Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un sistema di co-coltura cellulare di due tipi di cellule utilizzando inserti con una membrana permeabile, consentendo così la diffusione di fattori solubili secreti. Ciò si ottiene con una serie di passaggi che posizionano con precisione inserti contenenti un tipo di cellula in una piastra di coltura tissutale a più pozzetti contenente un secondo tipo di cellula. Iniziamo la mia semina del tipo di cellula numero uno negli inserti e la semina del tipo di cellula numero due in una piastra di coltura tissutale a più pozzetti.

Il secondo passo consiste nel trasferire gli inserti nei pozzetti della piastra contenente il tipo di cella numero due. In definitiva, questo dà la possibilità di raccogliere i due tipi di cellule e i rispettivi surnatanti. Pertanto, è possibile valutare l'effetto dei fattori solubili secreti sul tipo di cellula di interesse.

Negli organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti suscitano risposte da diversi tipi di cellule come risultato della segnalazione paracrina. In quanto tale, il valore di un sistema di co-coltura con inserto risiede nella sua capacità di offrire un modo originale per valutare i cambiamenti dei parametri cellulari mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula. I sistemi di co-coltura a inserto offrono vari vantaggi rispetto ad altre tecniche di co-coltura, come ad esempio:uno tramite segnalazione direzionale; due polarità cellulari conservate; e tre rilevamenti specifici della popolazione di cambiamenti cellulari.

Di seguito verrà dettagliato un protocollo specifico per misurare gli effetti tossici delle citochine secrete dalla microglia N9 attivata da lipopolisaccaridi sulle cellule PC12 neuronali, fornendo così una comprensione concreta della metodologia di co-coltura degli inserti. Per iniziare, scartare la piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e gli inserti in politetrafluoroetilene da 0,4 micron dalla confezione. Quindi, posizionare gli inserti nei pozzetti vuoti della piastra di coltura tissutale afferrando il bordo superiore dell'inserto con una pinzetta sterile.

Quindi, riempire gli inserti con il terreno di routine N9 fino a coprire completamente la membrana. Incubare gli inserti per almeno un'ora, o durante la notte, per migliorare la capacità delle cellule di attaccarsi. Una volta che gli inserti sono pronti, dividere la microglia N9 all'80-90% di confluenza utilizzando il terreno N9 di routine per ottenere una sospensione cellulare che verrà utilizzata per seminare gli inserti.

Quindi, rimuovere il terreno di routine dagli inserti facendo attenzione a non perforare la membrana con la punta della micropipetta. Successivamente, seminare ogni inserto a 60.000 cellule per centimetro quadrato con 50 microlitri di sospensione cellulare, o secondo il protocollo del produttore dell'inserto. Durante la distribuzione della sospensione cellulare, assicurarsi che rimanga omogenea capovolgendo di tanto in tanto il tubo.

Quando tutti gli inserti sono stati seminati, far oscillare delicatamente la piastra avanti e indietro, quindi da sinistra a destra, in modo da distribuire uniformemente le cellule. Evita di fare movimenti circolari in quanto ciò causerà l'accumulo di cellule al centro dell'inserto. Successivamente, incubare la piastra contenente gli inserti per 24 ore prima di proseguire con l'attivazione della microglia N9.

Inizia pesando 10 milligrammi di lipopolisaccaride e conservalo in una provetta Eppendorf da 1,5 millilitri per un uso successivo. Poiché il lipopolisaccaride è un potente endotossina pro-infiammatoria e richiede particolari precauzioni di sicurezza, si raccomandano fortemente occhiali, guanti e un respiratore antiparticolato. Successivamente, creare una serie di diluizioni seriali di lipopolisaccaride utilizzando un terreno di trattamento N9 caldo per ottenere soluzioni di lavoro di quattro, due e un microgrammi per millilitro.

Infine, rimuovere metà del terreno di coltura dagli inserti, facendo attenzione a non disturbare le cellule. Quindi, aggiungere delicatamente 25 microlitri di soluzioni di lavoro lipopolisaccaridiche agli inserti per ottenere diluizioni finali di due, uno o 0,5 microgrammi per millilitro. Incubare la piastra per altre 24 ore prima di procedere con gli esperimenti di co-coltura.

Questo passaggio richiede cellule PC12 piastrate a 30.000 cellule per centimetro quadrato di interneuroni differenziati e microglia N9 attivata con lipopolisaccaride per 24 ore come descritto nella sezione precedente. Inizia rimuovendo delicatamente tutto il terreno dagli inserti e sostituendolo con 50 microlitri di terreno di trattamento N9 fresco e caldo. Questo è necessario per rimuovere tutte le tracce di lipopolisaccaride, lasciando solo la microglia N9 attivata.

Tenere presente che gli inserti sono allentati nei pozzetti della piastra di coltura tissutale e possono spostarsi se la punta viene premuta troppo forte sulla parete. Questo passaggio deve essere eseguito un inserto alla volta per evitare che le celle si secchino a causa del contatto prolungato con l'aria. Successivamente rimuovere completamente il terreno cellulare neuronale PC12 e sostituirlo con 0,6 millilitri di terreno di trattamento PC12 fresco e caldo.

Fallo bene uno alla volta per assicurarti che le celle non si secchino. Usando una pinzetta, afferra il bordo superiore di un inserto e posizionalo delicatamente nel pozzetto contenente le cellule neuronali PC12. Quando tutti gli inserti sono stati trasferiti, verificare la presenza di bolle d'aria sotto le membrane degli inserti.

Le bolle d'aria impediranno qualsiasi scambio attraverso la membrana dell'inserto e possono compromettere l'intero esperimento. Rimuovere eventuali bolle d'aria sollevando molto delicatamente l'inserto dal pozzetto usando una pinzetta e rimettendolo nel terreno di coltura cellulare, questa azione dovrebbe eliminare la maggior parte delle bolle. Tuttavia, per le bolle persistenti, prova a immergere delicatamente l'inserto nel terreno di coltura cellulare ad angolo.

Non bussare o mescolare gli inserti, poiché ciò tende a causare la dissociazione delle cellule aderenti. Successivamente, controllare i volumi dei fluidi sia negli inserti che nei pozzetti, il liquido in entrambi gli scomparti dovrebbe essere all'incirca allo stesso livello. Quando tutte le bolle d'aria sono state rimosse e i volumi del terreno sono appropriati, incubare la piastra.

Le cellule, il terreno di coltura o entrambi, possono quindi essere raccolti per misurare gli effetti della segnalazione paracrina tra la microglia N9 e le cellule neuronali PC12. Saggi di immunoassorbimento enzimatico sono stati eseguiti sul terreno di coltura cellulare del compartimento inferiore per quantificare le citochine proinfiammatorie. I risultati illustrano che 24 ore dopo il periodo di attivazione, le microglia N9 trattate con due microgrammi per millilitro di lipopolisaccaride hanno secreto significativamente più citochine proinfiammatorie, come l'interluken-6, il fattore di necrosi tumorale-alfa e l'interferone gamma, rispetto alle microglia che non sono state trattate.

Inoltre, la microglia N9 trattata con un microgrammo per millilitro di lipopolisaccaride ha secreto una quantità di interferone gamma maggiore dopo 24 ore, mentre ci sono volute 48 ore per vedere un aumento significativo dei livelli di interluken-6 e fattore di necrosi tumorale-alfa nel mezzo cellulare. Al contrario, la condizione di 0,5 microgrammi per millilitro non è riuscita a migliorare l'espressione delle citochine nella microglia N9 sia a 24 che a 48 ore dopo il periodo di attivazione. Inoltre, i dati a 24 ore nel gruppo dei due microgrammi per millilitro suggeriscono che c'era microgliosi, un aumento della popolazione microgliale.

Tuttavia, è stato solo dopo 48 ore che il numero di cellulare è aumentato in modo significativo. Infine, al fine di valutare le conseguenze dell'attivazione microgliale che porta ad un aumento della secrezione di citochine e microgliosos, la citotossicità è stata valutata nelle cellule neuronali PC12 co-coltivate. Misurando i livelli di lattato deidrogenasi extracellulare, che viene rilasciato dalle cellule danneggiate, è stato riscontrato che le cellule PC12 neuronali mostrano una maggiore morte cellulare all'aumentare della concentrazione di lipopolisaccaride sulle cellule N9.

Pertanto, questi risultati mostrano che i fattori solubili secreti sono in grado di attraversare la membrana degli inserti di co-coltura e possono causare danni citotossici alle cellule neuronali PC12 in assenza di contatto cellula-cellula. Sebbene qui sia stato presentato un solo scenario di co-coltura degli inserti, si tratta di una tecnica molto flessibile. In questo protocollo, un tipo di cellula è stato pretrattato con la molecola responsabile della riduzione della secrezione di fattori solubili che, trasferendo l'inserto nel pozzetto, influenzano il comportamento del secondo tipo di cellula.

Tuttavia, è possibile incubare entrambi i tipi di cellule insieme in un sistema di co-coltura per rilevare l'aumento della debolezza, o resistenza, di una o entrambe le popolazioni cellulari a un trattamento successivo. Questa tecnica può semplicemente utilizzare due popolazioni di cellule incubate insieme senza alcun trattamento, ad esempio per valutare la segnalazione reciproca paracrina basale. Oltre ad essere apprezzati nel campo della neuroinfiammazione, come dimostrato qui, i sistemi di co-coltura possono essere utilizzati per rispondere a una vasta gamma di domande relative alla regenesi del tumore, al neurolatirisma, alla segnalazione dell'apoptosi o a qualsiasi altro argomento con una componente di segnalazione paracrina.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come i sistemi di co-coltura in insert possano offrire un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati dal fattore solubile secreto. E speriamo di avervi convinto dell'alto potenziale di questi sistemi di co-coltura nell'ambito dello studio della segnalazione paracrina multicellulare in assenza di contatto cellula-cellula.