Name: Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Scopri come creare un sistema di co-coltura cellulare con inserti a membrana permeabile per studiare i fattori solubili secretati senza contatto diretto tra cellule. Questo metodo permette di analizzare la segnalazione paracrina in biologia cellulare.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada a MGM. JR è uno studente del NSERC-Vanier.

NB: Ciascuna delle seguenti operazioni deve essere eseguita in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare come richiesto per colture cellulari di mammifero. Inoltre, le linee guida generali per la coltivazione ottimale delle cellule sterili si applicano, ad esempio., Scartando consigli ogni volta che possono portare a contaminazione incrociata, riducendo la quantità di cellule di tempo sono esposti all&#39;aria durante l&#39;esecuzione di interi cambiamenti dei media, correttamente, ma con delicatezza mescolando sospensioni cellulari per garantire la loro dispensazione omogeneo, ecc Inoltre, gli inserti sono una sorta di plasticware che richiedono un trattamento speciale. In primo luogo, ogni volta che gli inserti sono manipolati, evitare di toccare la membrana fragile, che strappa facilmente e potrebbe quindi compromettere l&#39;esperimento. Inoltre, non è adatto per eseguire l&#39;aspirazione sotto vuoto del mezzo di coltura cellulare, in quanto vi è il rischio di perforazione della membrana o dissociare cellule aderenti. Successivamente, inserti pendere nella piastra di coltura tissutale pozzetti e, pertanto, deve essere posta attenzione quando moVing il Plasticware o durante la dispensazione per evitare di dissociare cellule aderenti. Inoltre, quando si usano inserti di grandi dimensioni dei pori, c&#39;è una possibilità che il mezzo di coltura cellulare filtra attraverso la membrana e, quindi, è importante monitorare frequentemente il livello del liquido. Infine, si noti che il seguente protocollo è progettato per cellule aderenti e richiede piccole modifiche per essere adatto per cellule in sospensione. 1. Linee guida generali per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura di inserimento <ol><li> Semina tipo di cellula # 1 a inserti <ol><li> Scartare gli inserti dalla confezione. </li><li> Posizionare gli inserti in una piastra di coltura tissutale pozzetti vuota della dimensione corretta. Per fare ciò, afferrare il bordo superiore dell&#39;inserto usando pinzette. </li><li> Per migliorare l&#39;attaccamento e la diffusione di cellule aderenti, condizionare gli inserti con terreno di coltura cellulare prima della semina. Per fare ciò, coprire l&#39;intera superficie della membrana con coltura cellulare medium con una micropipetta. NOTA: Fate questo per il maggior numero di inserti, come richiesto. </li><li> Riposizionare il coperchio sulla piastra e incubare per almeno 1 ora o O / N alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2). </li><li> Quando gli inserti sono condizionati, rimuovere tutto il terreno di coltura cellulare utilizzando una micropipetta. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> tipo di cellula Seed # 1 nel terreno di coltura fresco nello stesso modo come in una piastra multipozzetto. Per fare ciò, disegnare un appropriato volume di sospensione cellulare con una micropipetta e dispensare il liquido nell&#39;inserto. NOTA: Preparare come molti inserti come richiesto. </li><li> Dopo la semina tutti gli inserti, oscillare delicatamente la piastra destra e sinistra, poi avanti e indietro in modo da distribuire le cellule in modo uniforme. Evitare di fare movimenti circolari, ciò causerebbe le cellule a accumulano nel centro degli inserti. </li><li> Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare come specificato per i requisiti cellulari (normalmente 37 ° C, 5-10% CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Semina tipo di cellula # 2 in piastre di coltura di tessuti pozzetti <ol><li> tipo di cellula Seed # 2 nel terreno di coltura fresco secondo il punto 1. </li><li> Preparare come molti pozzi come richiesto per il numero di inserti. Oscillare la piastra come al punto 1.1.7), al fine di garantire che le cellule sono equamente distribuiti nei pozzetti. </li><li> Mettere il coperchio sulla piastra e incubare alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2). </li></ol></li><li> media rinfrescante in inserti <ol><li> Usando una micropipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare, negli inserti contenenti tipo cellulare # 1. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. riposare delicatamente la punta sulla parete interna dell&#39;inserto e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare. </li><li> Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare secondo passo 1.1.4. </li></ol></li><li> media rinfrescante in piastre di coltura di tessuti pozzetti <ol><li> Utilizzando un MICROPIpipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare nei pozzetti contenenti tipo cellulare # 2. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. Posizionare la punta sulla parete interna del canale e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare. </li><li> Mettere il coperchio sulla piastra e incubare secondo protocolli di coltura cellulare precedentemente stabiliti. </li></ol></li><li> Trasferimento di inserti contenenti tipo di cellula # 1 a piastre di coltura tissutale pozzetti contenenti tipo di cellula # 2. NOTA: Eseguire questo passaggio quando entrambi i tipi di cellule hanno raggiunto la fase di crescita adeguato. <ol><li> Prima di trasferire gli inserti nei pozzetti, apportare le necessarie modifiche medie, come precedentemente descritto ai punti 1.3) e 1.4). NOTA: A questo punto, è importante dispensare i volumi appropriati di supporto in entrambi i compartimenti, come specificato da istruzioni del produttore dell&#39;inserto. </li><li> Con una pinzetta, afferrare il bordo superiore di un inserto contenente cellule Tipo 1 # e delicatamente posizionarlo nella appropriata pozzetto contenente tipo di cellula # 2. </li><li> Dopo aver trasferito tutti gli inserti, verificare la presenza di bolle d&#39;aria sotto la membrana di inserti. NOTA: Le bolle d&#39;aria impediscono qualsiasi scambio attraverso la membrana dell&#39;inserto e possono compromettere l&#39;intero esperimento. </li><li> Se le bolle d&#39;aria sono presenti, sollevare molto delicatamente l&#39;inserto dal bene con una pinzetta e immergersi di nuovo nel mezzo di coltura cellulare. Le bolle spariranno. Se sono ancora presenti, provare delicatamente immergendo inserti di nuovo nel mezzo di coltura cellulare in un angolo. NOTA: Non battere o mescolare gli inserti per evitare di dissociare cellule aderenti. </li><li> Dopo aver rimosso tutte le bolle d&#39;aria e controllare che i volumi di media in entrambi i comparti, posizionare il coperchio sulla piastra e incubare. </li></ol></li><li> mezzi rinfrescanti in un sistema di co-coltura NOTA: Anche se la membrana consente facilmente gli scambi multimediali tra inserto e ben, rinfrescante il medium è fatto inentrambi i comparti Poiché il tempo necessario per raggiungere l&#39;equilibrio nei vani superiori e inferiori da sola diffusione possono essere piuttosto lungo. <ol><li> media rinfrescante in inserti contenenti tipo cellulare # 1 viene effettuata nello stesso modo come nel punto 1.3). </li><li> Per aggiornare medie pozzetti contenenti tipo di cellula # 2, far scorrere delicatamente l&#39;inserto di lato per creare uno spazio abbastanza ampio per ospitare una punta della pipetta. Aggiornare il medium come al punto 1.4). </li><li> Controllare la presenza di bolle d&#39;aria e verificare i volumi come per gradini 1.5.3) attraverso 1.5.5). </li></ol></li></ol> 2. Esempio: misurare gli effetti delle citochine secrete da microglia N9 LPS-attivati ​​sulle cellule neuronali PC12 NOTA: Le seguenti operazioni sono progettati per specifiche pallone, bene e dimensioni del piatto. Tuttavia, il protocollo può essere personalizzato per qualsiasi dimensione plasticware. Per i media e la composizione vedi Materiali Tavolo. <ol><li> Semina e differenziazione delle cellule PC12 in multie piastre di coltura tissutale <ol><li> mezzo di coltura cellulare PC12 routine di riscaldamento, PC12 terreno di differenziamento e tripsina-EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Utilizzare cellule PC12 al 60-80% di confluenza da un 2 pallone 75 cm. </li><li> Con di 15 mm pipetta Pasteur, effettuare l&#39;aspirazione a vuoto dell&#39;intero mezzo di coltura cellulare nel pallone. </li><li> Lavare delicatamente il monostrato cellulare con 5 ml di sterile tampone fosfato e rimuovere il liquido con una pipetta Pasteur. Fare attenzione a non dissociare le cellule in questa fase. </li><li> Coprire il monostrato cellulare con 3 ml di tripsina-EDTA e incubare per 2-3 minuti a 37 ° C. </li><li> Assicurarsi che tutte le cellule sono staccati al microscopio. Se pochissime cellule sono flottanti, incubare per un periodo più lungo per un massimo di 5 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine al fine di inattivare la tripsina-EDTA. </li><li> Con una pipetta 10 ml, triturare delicatamente facendo in modo che la maggior parte delle cellule sono dissociate dal basso of matraccio. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria nella sospensione cellulare. </li><li> Con la stessa pipetta 10 ml, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugazione 50 ml. </li><li> Centrifugare per 1 min a 3.200 xg </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare PC12 routine con una pipetta 10 ml. NOTA: Questo volume può essere regolato se il pellet è insolitamente piccolo o grande. </li><li> Triturare con la stessa pipetta 10 ml per omogeneizzare il pellet. cellule PC12 spesso si raggruppano in modo almeno il 20 pipettando su e downare necessario. NOTA: Durante la triturazione vigorosa è necessario, evitare di creare bolle d&#39;aria nella sospensione cellulare. </li><li> In una provetta da 1,5 ml, preparare una diluizione appropriata di sospensione cellulare in blu trypan. Contare le cellule utilizzando un emocitometro secondo protocolli stabiliti in precedenza 74. </li><li> In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellularecon terreno di differenziamento PC12 per ottenere una sospensione appropriata diluite per semina pozzetti di una piastra da 24 pozzetti (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per pozzetto secondo il protocollo del produttore). NOTA: Il 24-pozzetti deve essere preventivamente rivestito con collagene, come specificato dai protocolli stabiliti in precedenza 75. </li><li> Distribuire 0,6 ml della sospensione di cellule per pozzetto con una micropipetta. </li><li> Quando tutti i pozzi sono testa di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7). </li><li> Per consentire il corretto differenziamento delle cellule PC12, incubare le piastre a 24 pozzetti per 7-9 giorni a 37 ° C in atmosfera umida 5% CO 2 in PC12 differenziazione medio 15,16 prima di eseguire esperimenti di co-coltura. </li><li> Eseguire modifiche medie a giorni rimuovendo la metà del liquido e la sua sostituzione con un uguale volume di terreno di differenziamento PC12 fresco. </li></ol></li><li> Semina microglia N9 negli inserti e trattare con LPS <ol><li> Un giorno prima di effettuare degli esperimenti di co-coltura, pre-trattamento di PTFE 0,4 inserti micron-pori con routine di terreno di coltura cellulare N9 per ottimizzare l&#39;aderenza delle cellule, seguendo i punti 1.1.1) attraverso 1.1.4) </li><li> Warm medio di routine N9 coltura cellulare e tripsina-EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Nel frattempo, pesano circa 10 mg di LPS in una provetta da 1,5 ml per un uso successivo. NOTA: Dal momento che LPS è un potente endotossine pro-infiammatorio e richiede particolari precauzioni di sicurezza, occhiali, guanti, e un respiratore per particolati sono fortemente raccomandato. </li><li> Utilizzare le cellule N9 a 80-90% di confluenza da un 2 pallone 75 cm. </li><li> Seguire i passaggi 2.1.3) a 2.1.14). Usare sempre terreno di coltura cellulare N9 di routine, invece di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine. Si noti inoltre che la microglia N9 non si aggregano insieme tanto quanto le cellule PC12 fanno, in modo meno pipettando su e giù possono essere necessarie al punto 2.1.13). </li><li> In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellulare con terreno di coltura cellulare N9 per obtain una sospensione cellulare diluita appropriato per la semina inserti progettati per tenere in piastre da 24 pozzetti (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml per inserto secondo il protocollo del produttore, per superficie della membrana vedere le informazioni del produttore). NOTA: Questi inserti sono già rivestiti con collagene dal produttore e sono ottimizzati per l&#39;adesione cellulare. </li><li> Distribuire 0,05 ml della sospensione cellulare per inserto utilizzando una micropipetta. </li><li> Quando tutti gli inserti sono teste di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7). </li><li> Eseguire diluizioni seriali di LPS utilizzando terreno di trattamento N9 per ottenere 4 mg / ml, 2 mg / ml e / ml soluzione di lavoro 1 mg. </li><li> Pipettare 0,05 ml di 4 mg / ml soluzione di lavoro in un set di inserti per produrre una diluizione finale di 2 mg / ml. </li><li> Ripetere il passaggio 2.2.10) per le altre due soluzioni di lavoro in diversi inserti set, ottenendo diluizioni finali di 1 mg / ml e 0,5 mg / ml, rispettivamente. </li><li> Incubate le piastre contenenti gli inserti per 24 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5% per consentire N9 microglia attivazione con LPS prima di eseguire degli esperimenti di co-coltura. </li></ol></li><li> Co-coltivando cellule PC12 neuronali con microglia N9 <ol><li> A 7-9 giorni di differenziazione delle cellule PC12, attivare le microglia N9 dopo 24 ore di incubazione con LPS di terreno di trattamento N9 calda e terreno di trattamento PC12 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Eseguire un cambio medio totale per microglia N9 come al punto 1.3), sostituendo l&#39;intero mezzo utilizzato da 0,1 ml di terreno di trattamento N9. Fate questo per ogni insert.This è necessario rimuovere tutte le tracce di LPS, lasciando microglia N9 solo attivati ​​negli inserti. </li><li> Eseguire un cambio medio totale per le cellule neuronali PC12 come al punto 1.4). Trasferire gli inserti nelle piastre da 24 pozzetti come al punto 1.5) .Incubate co-colture N9-PC12 per 24 ore o 48 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5%. </li><li> dopo 24hr o 48 hr, raccogliere il surnatante e / o le cellule per la citotossicità, saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), Western Blot, o di altri test. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La fase più critica di esperimenti sistema inserto co-coltura effettivamente abita nello scegliere l&#39;inserto corretto di utilizzare. Dimensione dei pori e materiale della membrana devono essere presi in considerazione approfondita, senza dimenticare di considerare il tipo di cellule che saranno seminate e lo scopo dell&#39;esperimento. Per esempio, saggi chemiotassica possono utilizzare lo stesso tipo di membrana di co-colture cellulari per analizzare modulazioni comportamento cellulare indotta da fattori solubili s...

Lo studio dei tessuti, organi o sistemi in vitro è un tentativo di semplificare le molto complesse relazioni esistenti fra i vari sottotipi cellulari che compongono organismi multicellulari. Infatti, gli studi in vitro permettono di acquisire una comprensione dettagliata delle popolazioni di cellule singole. Ci sono due principali vantaggi di condurre esperimenti in vitro: 1) riduzione interazioni cellulari, e 2) la capacità di manipolare facilmente l&#39;ambiente cellulare. Scienziati Quindi, questi due vantaggi hanno consentito di prevedere il comportamento di specifici tipi cellulari in vivo, che porta alla capacità di regolare risultati delle influenze estrinseche in organismi interi. In questo senso, colture cellulari in vitro spesso funziona come un ponte che collega le scienze di base e applicate vita. Tuttavia, ci sono anche diversi svantaggi di lavorare in vitro, il più importante dei quali è che una certa riserva può dimorare nella fisiologicaAl rilevanza di fenotipi osservati. In effetti, quando un unico tipo di cellula è coltivato in un vaso, la cultura perde, a diversi livelli,, le sue connessioni cellula-cellula con altri tipi di cellule, il suo contributo per l&#39;ambiente umorale dal tessuto e organismo di origine, e le ancore all&#39;interno il tessuto che ha permesso di sostenere una particolare struttura tridimensionale volte cruciale per la funzione delle cellule. La questione dei rapporti cellula-cellula è stato affrontato con lo sviluppo di tecniche di coltura mista. In questo metodo, due o più popolazioni di cellule sono coltivate insieme nello stesso recipiente di coltura. Tuttavia, queste culture miste sopportano disagi importanti. Da un lato, alcuni sottotipi di cellule non fisicamente interagiscono tra loro nei tessuti di origine e si basano esclusivamente sulle comunicazioni paracrini sostenute da fattori solubili secreti e recettori nelle vicinanze. Questo è il caso per diversi processi infiammatori che dipendono prossimale segnalazione di citochine. In misto cultures, interazioni fisiche sono inevitabili e rendono impossibile studiare le comunicazioni paracrini in assenza di contatti cellula-cellula che possono produrre risultati alterati. D&#39;altra parte, ottenendo interpretazioni specifiche delle celle all&#39;interno di una popolazione mista diventa irrealizzabile senza l&#39;uso di tecniche di separazione dure che potrebbero influenzare significativamente i risultati. Per risolvere questi problemi importanti, l&#39;uso dei mezzi condizionati è stata sviluppata come una tecnica che consente culture compartimenti e lo studio di segnalazione paracrina. Questo metodo richiede il trasferimento del surnatante di un tipo di cellula, medio così chiamato condizionata, di pozzetti contenenti un&#39;altra popolazione di cellule. Tuttavia, un importante inconveniente è che le molecole di breve durata non sopravvivono abbastanza a lungo nel mezzo condizionato da trasferire ai pozzetti della seconda popolazione di cellule. Anche le molecole lunghe durata sarà notevolmente diluiti nel tempo a causa di diffusione. Inoltre, sia cellulepopolazioni partecipano solo in comunicazione paracrina unidirezionale, piuttosto che nella comunicazione bidirezionale attiva. Questo porta alla mancanza di segnale di retroazione che è vitale per ricreare rapporti multicellulari accurate come esistono in vivo. Di conseguenza e guidato dalla necessità di meglio simulare l&#39;originale in condizioni in vivo l&#39;ambiente cellulare in vitro, diverse progressi nelle tecniche di coltura cellulare sono stati ottenuti nel corso degli anni. Uno dei progressi più significativi è stato l&#39;uso di supporti permeabili con membrane microporose di compartimentazione colture cellulari, utilizzate per la prima volta da Grobstein nel 1953 1. Tali supporti permeabili sono stati adattati negli anni per ospitare numerosi tipi di cellule e da utilizzare in diverse applicazioni. Oggi, questi supporti esistono inserti come cave che sono progettati per riposare in pozzetti di una piastra di coltura tissutale pozzetti o in circupiatti lar. In un sistema di co-coltura, l&#39;inserto contiene un tipo di cellule che pozzo o piatto contiene l&#39;altra popolazione cellulare, permettendo di studiare il contributo di due differenti popolazioni di cellule sul loro ambiente umorale (Figura 1). Come risultato, la polarità cellulare (basolaterale vs secrezione apicale o ricezione del segnale) è conservato, conferendo sistemi inserto co-coltura un importante vantaggio rispetto colture miste e tecniche mezzo condizionato. Diversi tipi di materiali membrana sono disponibili, i più comuni sono poliestere (PET), policarbonato (PC) o collagene rivestite con politetrafluoroetilene (PTFE), ed esistono in diverse dimensioni dei pori da 0,4 micron a 12,0 micron. Queste varietà di materiali e dimensioni dei pori offrono una gamma di inserti che esercitano funzioni di variabili rilevanti per le proprietà ottiche, spessore della membrana e l&#39;adesione delle cellule che li rendono pratici a livelli diversi per i seguenti usi non limitato a: -studiandola differenziazione delle cellule, lo sviluppo embrionale, metastasi tumorali e la riparazione delle ferite mediante saggi chemiotassica attraverso membrane permeabili; -evaluating penetrazione farmaco, valutando il loro trasporto attraverso monostrati epiteliali o endoteliali in coltura su supporti permeabili, e; -Esecuzione co-colture di cellule di analizzare modulazioni il comportamento delle cellule indotte da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula. Lo scopo di questo articolo è descrivere orientamenti metodologici generali per compiere la terza funzione sopra indicato, che è di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secrete in assenza di contatto cellula-cellula con un sistema di inserimento co-coltura. Diversi campi di ricerca fanno uso di sistemi inserto co-coltura per rispondere a domande relative all&#39;effetto di fattori solubili secreti su popolazioni di cellule. Infatti, segnalazione paracrina che modula comportamento cellulare a vari livelli è pertinente in tutti i tessutie sistemi, il che rende i sistemi di co-coltura inserto indispensabile per assicurare progressi in questi campi. Al contrario, l&#39;utilizzo di inserti può confermare che il segnale di trasduzione è attraverso il contatto diretto cellula-cellula e non da fattori secreti. Uno degli usi più importanti di inserti è in studi infiammazione 2-14 in cui l&#39;effetto di citochine secrete viene valutato in vari giocatori cellulari di immunità. In particolare, lo studio di infiammazione nel sistema nervoso centrale (SNC) ha notevolmente beneficiato da studi inserto co-coltura, che hanno permesso di definire meglio i ruoli paracrini distinti di neuroni e microglia nel guidare neuroinfiammazione 15-21. Questi sistemi sono stati concepiti per studiare il potenziale anti-infiammatorio di molecole che si basa sulla loro capacità di ridurre o inibire la secrezione di fattori pro-infiammatori 22-26. La ricerca di pertinenza di cancro 27-31, in particolare i meccanismi alla base dell&#39;angiogenesi 32-34 e inflammatisul 35-42 nella tumorigenesi, beneficia anche di sistemi di inserti co-coltura. Inoltre, fattori solubili sono di primaria importanza nei processi che guidano la differenziazione e diversi studi hanno usato gli inserti di rispondere alle domande in quel particolare settore 43-50. Nel SNC, visto che tessuto neurale ha un potenziale rinnovamento molto limitato, lo studio di neurotrophism e neuroprotezione è fondamentale ed è stato ampiamente garantita dall&#39;uso di cellule staminali in sistemi di co-coltura 51-56. Inoltre, gli inserti sono utilizzati anche in settori diversi come nefrologia 57,58, interazioni endoteliali e l&#39;angiogenesi 59-62, apoptosi segnalazione 63-65, infiammazione di obesità e sindrome metabolica 22,23,66-67, orecchio interno di protezione delle cellule dei capelli 68,69, e anche in funghi virulenza 70,71 e parassitologia 72,73. Questo articolo offre indicazioni metodologiche generali al fine di istituire un sperimento in vista di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secreti che utilizzano un sistema di inserimento co-coltura. In particolare, ci concentreremo la nostra attenzione su co-colture di cellule nervose e il loro uso nello studio processo neuroinfiammatorio. Data la vasta gamma di esperimenti che inserisce rendere possibile pilota, è insopportabile per coprire ogni aspetto di questa tecnica di coltura cellulare. Come esempio, un protocollo specifico per misurare gli effetti di citochine secrete da lipopolisaccaride (LPS) -activated microglia N9 su cellule PC12 neuronali sarà dettagliato, offrendo una comprensione concreta della metodologia inserto co-coltura.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Miscela Medio/Nutriente F-12 Prosciutto</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso, deve essere integrato con 0,365 gm/L di L-glutammina</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S dalla ghiandola sottomascellare murina</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Ricostituire la polvere liofilizzata in una soluzione di soluzione salina tamponata o di terreno di coltura tissutale contenente 0,1&ndash; 1,0% di albumina sierica bovina o 1-10% di siero</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA soluzione</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi da&nbsp; Escherichia coli 055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td> Inserti per colture cellulari <td>tossiche</td></tr><tr><td>per l'uso con piastre a 24 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0,4 &mu; m pori</td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Rivestire con collagene prima dell'uso</td></tr><tr>Terreno <td></td><td></td> di<td>coltura cellulare PC12</td><td>di routine Terreno di coltura cellulare N9 di routine</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 85% RPMI medio</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 90% DMEM-F12 medio</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% siero</td><td></td><td></td> di cavallo inattivato a caldo<td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% siero di cavallo inattivato a caldo</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Siero</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> fetale bovino inattivato al 5%<td>PC12 terreno di differenziazione</td><td>N9 mezzo di trattamento</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI medio</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% DMEM-F12 medio</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% siero</td><td></td><td></td> fetale bovino inattivato <td>termicamente-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% siero fetale bovino inattivato termicamente</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 50 ng/mL di fattore</td><td></td><td></td><td></td>di crescita nervoso</tr><tr><td>PC12 terreno</td><td></td><td></td><td></td> di trattamento</tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI medio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Siero</td><td></td><td></td><td></td> fetale bovino inattivato termicamente all'1%</tr></tbody></table>

sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Il ruolo dei fattori solubili secreti nella modifica delle risposte cellulari è un tema ricorrente nello studio di tutti i tessuti e sistemi. Nel tentativo di rendere semplici le relazioni molto complesse tra i diversi sottotipi cellulari che compongono gli organismi pluricellulari, sono state sviluppate tecniche in vitro per aiutare i ricercatori ad acquisire una comprensione dettagliata delle popolazioni di singole cellule. Una di queste tecniche utilizza inserti con una membrana permeabile che consente la diffusione dei fattori solubili secreti. Pertanto, una popolazione di cellule coltivate in inserti può essere co-coltivata in un pozzetto o in un piatto contenente un diverso tipo di cellula per valutare i cambiamenti cellulari a seguito di segnalazione paracrina in assenza di contatto cellula-cellula. Tali sistemi di co-coltura con inserti offrono vari vantaggi rispetto ad altre tecniche di co-coltura, in particolare la segnalazione bidirezionale, la polarità cellulare conservata e il rilevamento specifico della popolazione dei cambiamenti cellulari. Oltre ad essere utilizzati nel campo dell'infiammazione, del cancro, dell'angiogenesi e del differenziamento, questi sistemi di co-coltura sono di primaria importanza nello studio delle intricate relazioni che esistono tra i diversi sottotipi cellulari presenti nel sistema nervoso centrale, in particolare nel contesto della neuroinfiammazione. Questo articolo offre linee guida metodologiche generali per impostare un esperimento al fine di valutare le modificazioni cellulari mediate da fattori solubili secreti utilizzando un sistema di co-coltura in inserto. Inoltre, verrà dettagliato un protocollo specifico per misurare gli effetti neuroinfiammatori delle citochine secrete dalla microglia N9 attivata da lipopolisaccaridi sulle cellule neuronali PC12, offrendo una comprensione concreta della metodologia di co-coltura degli inserti.

L&#39;utilizzo di sistemi di inserti co-coltura è particolarmente pertinente nello studio dei processi neuroinfiammatori che mettono in risalto le relazioni tra i diversi attori paracrini cellulari del sistema nervoso centrale. Immunità nel sistema nervoso centrale avviene principalmente dalle cellule residenti chiamate microglia che monitorano l&#39;ambiente nel loro riposo stato ramificata (Figura 2A) e sono in grado di disturbi di rilevamento che potrebbero turbare la...

Negli organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti suscitano risposte da diversi tipi di cellule come risultato della segnalazione paracrina. I sistemi di co-coltura in insert offrono un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un sistema di coltura cellulare in co-coltura di due tipi cellulari utilizzando inserti con una membrana permeabile, consentendo così la diffusione di fattori solubili secreti. Questo viene ottenuto mediante una serie di passaggi che posizionano con precisione inserti contenenti un tipo cellulare in una piastra per colture tessutali a più pozzetti contenente un secondo tipo cellulare. Iniziamo seminando il tipo cellulare numero uno negli inserti e il tipo cellulare numero due in una piastra per colture tessutali a pozzetti multipli.Il secondo passaggio consiste nel trasferire gli inserti nei pozzetti della piastra contenente il tipo cellulare numero due. In definitiva, questo consente di raccogliere i due tipi cellulari e i rispettivi supernatanti. Pertanto, è possibile valutare l'effetto dei fattori solubili secreti sul tipo cellulare di interesse.In organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti elicitano risposte da diversi tipi cellulari a seguito di segnalazione paracrina. Pertanto, il valore di un sistema di co-coltura con inserto risiede nella sua capacità di offrire un approccio originale per valutare le modifiche dei parametri cellulari mediate da fattori solubili secreti in assenza di contatto diretto tra le cellule. I sistemi di co-coltura con inserto offrono diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche di co-coltura, come: uno, segnalazione direzionale; due, conservazione della polarità cellulare; e tre, rilevamento specifico della popolazione per le modifiche cellulari.Di seguito verrà illustrato un protocollo specifico per misurare gli effetti tossici delle citochine secrete dai microglia N9 attivati dal lipopolisaccaride su cellule neuronali PC12, fornendo così una comprensione concreta della metodologia di co-coltura con inserti. Per iniziare, rimuovere l'imballaggio dalla piastra per colture cellulari a 24 pozzetti e dagli inserti in politetrafluoroetilene poroso con pori di 0,4 micron. Successivamente, posizionare gli inserti nei pozzetti vuoti della piastra per colture cellulari afferrando il bordo superiore dell'inserto con pinzette sterili.Successivamente, riempire gli inserti con il mezzo N9 di routine fino a quando la membrana è completamente coperta. Incubare gli inserti per almeno un'ora, oppure durante la notte, per migliorare la capacità delle cellule di aderire. Una volta che gli inserti sono pronti, suddividere le microglia N9 a una confluenza dell'80-90% utilizzando il mezzo N9 di routine per ottenere una sospensione cellulare che verrà utilizzata per seminare gli inserti.Quindi, rimuovere il mezzo di routine dagli inserti avendo cura di non perforare la membrana con la punta della micropipetta. Successivamente, seminare ogni inserto a 60.000 cellule per centimetro quadrato con 50 microlitri di sospensione cellulare, oppure secondo il protocollo del produttore dell'inserto. Durante la distribuzione della sospensione cellulare, assicurarsi che rimanga omogenea invertendo occasionalmente il tubo.Una volta seminati tutti gli inserti, agitare delicatamente la piastra avanti e indietro, quindi da sinistra a destra, per distribuire le cellule in modo uniforme. Evitare movimenti circolari poiché potrebbero causare l'accumulo delle cellule al centro dell'inserto. Successivamente, incubare la piastra contenente gli inserti per 24 ore prima di procedere con l'attivazione dei microglia N9.Iniziare pesando 10 milligrammi di lipopolisaccaride e conservarli in una provetta Eppendorf da 1,5 millilitri per un uso successivo. Poiché il lipopolisaccaride è un potente endotossina pro-infiammatoria e richiede specifiche precauzioni di sicurezza, si raccomandano fortemente l'uso di occhiali, guanti e una maschera respiratoria antiparticolato. Successivamente, preparare una serie di diluizioni seriali del lipopolisaccaride utilizzando il mezzo di trattamento N9 tiepido, al fine di ottenere soluzioni operative di quattro, due e un microgrammo per millilitro.Infine, rimuovere metà del mezzo di coltura dagli inserti, avendo cura di non disturbare le cellule. Quindi, aggiungere delicatamente 25 microlitri delle soluzioni operative di lipopolisaccaride negli inserti, ottenendo diluizioni finali di 2, 1 o 0,5 microgrammi per millilitro. Incubare la piastra per ulteriori 24 ore prima di procedere con gli esperimenti di co-coltura.Questo passaggio richiede cellule PC12 seminate a 30.000 cellule per centimetro quadrato, interneuroni differenziati e microglia N9 attivata con lipopolisaccaride per 24 ore come descritto nella sezione precedente. Iniziare rimuovendo delicatamente tutto il mezzo dagli inserti e sostituendolo con 50 microlitri di mezzo di trattamento N9 fresco e pre-riscaldato. Questo passaggio è necessario per rimuovere ogni traccia di lipopolisaccaride, lasciando soltanto microglia N9 attivata.Tenere presente che gli inserti sono liberi nei pozzetti della piastra per colture cellulari e possono spostarsi se la punta viene premuta troppo contro la parete. Questo passaggio deve essere eseguito un inserto alla volta per evitare che le cellule si secchino a causa di un prolungato contatto con l'aria. Successivamente, rimuovere completamente il mezzo delle cellule neuronali PC12 e sostituirlo con 0,6 millilitri di mezzo di trattamento PC12 fresco e caldo.Eseguire questa operazione una alla volta per garantire che le cellule non si secchino. Utilizzando pinzette, afferrare il bordo superiore di un inserto e posizionarlo delicatamente nel pozzetto contenente le cellule neuronali PC12. Una volta trasferiti tutti gli inserti, verificare la presenza di bolle d'aria al di sotto delle membrane degli inserti.Le bolle d'aria impediranno qualsiasi scambio attraverso la membrana dell'inserzione e potranno compromettere l'intero esperimento. Rimuovere le bolle d'aria sollevando molto delicatamente l'inserzione dalla pozzetta con delle pinzette e riposizionandola nel mezzo di coltura cellulare; questa operazione dovrebbe eliminare la maggior parte delle bolle. Tuttavia, per le bolle più persistenti, provare a immergere delicatamente l'inserzione nuovamente nel mezzo di coltura cellulare con un angolo inclinato.Non battere né agitare gli inserti, poiché ciò tende a causare la dissociazione delle cellule aderenti. Successivamente, verificare i volumi di mezzo sia negli inserti che nei pozzetti: il liquido in entrambi i compartimenti dovrebbe trovarsi approssimativamente allo stesso livello. Una volta eliminate tutte le bolle d'aria e verificato che i volumi del mezzo siano adeguati, incubare la piastra.Le cellule, il mezzo di coltura o entrambi possono quindi essere raccolti per misurare gli effetti della segnalazione paracrina tra le microglia N9 e le cellule neuronali PC12. Sono stati eseguiti saggi immunoenzimatici sul mezzo di coltura del compartimento inferiore per quantificare le citochine proinfiammatorie. I risultati mostrano che 24 ore dopo il periodo di attivazione, le microglia N9 trattate con due microgrammi per millilitro di lipopolisaccaride hanno secreto una quantità significativamente maggiore di citochine proinfiammatorie, come interleuchina-6, fattore di necrosi tumorale-alfa e interferone gamma, rispetto alle microglia non trattate.Inoltre, le microglia N9 trattate con un microgrammo per millilitro di lipopolisaccaride hanno secreto una quantità nettamente maggiore di interferone gamma dopo 24 ore, mentre sono state necessarie 48 ore per osservare un aumento significativo dei livelli di interleuchina-6 e del fattore di necrosi tumorale alfa nel mezzo cellulare. Al contrario, la condizione con 0,5 microgrammi per millilitro non è riuscita a potenziare l'espressione delle citochine nelle microglia N9 sia a 24 che a 48 ore dal periodo di attivazione. Inoltre, i dati a 24 ore nel gruppo con due microgrammi per millilitro suggeriscono la presenza di microgliosi, ovvero un aumento della popolazione microgliale.Tuttavia, solo dopo 48 ore il numero cellulare è aumentato in modo significativo. Infine, al fine di valutare le conseguenze dell'attivazione microgliale che porta a un aumento della secrezione di citochine e a microgliosi, è stata valutata la citotossicità nelle cellule neuronali PC12 in co-coltura. Misurando i livelli di lattato deidrogenasi extracellulare, che viene rilasciata dalle cellule danneggiate, si è osservato che le cellule neuronali PC12 mostravano una maggiore morte cellulare all'aumentare della concentrazione di lipopolisaccaride sulle cellule N9.Pertanto, questi risultati dimostrano che i fattori solubili secreti sono in grado di attraversare la membrana degli inserti per co-coltura e possono causare danni citotossici alle cellule neuronali PC12 in assenza di contatto diretto tra le cellule. Sebbene qui sia stato presentato un solo scenario di co-coltura con inserti, si tratta di una tecnica molto flessibile. In questo protocollo, un tipo cellulare è stato pretrattato con la molecola responsabile della riduzione della secrezione di fattori solubili che, una volta trasferito l'inserto nel pozzetto, influenzano il comportamento di un secondo tipo cellulare.Tuttavia, è possibile incubare contemporaneamente entrambi i tipi cellulari in un sistema di co-coltura per rilevare l'aumento della debolezza o della resistenza di una o di entrambe le popolazioni cellulari a un successivo trattamento. Questa tecnica può semplicemente utilizzare due popolazioni cellulari incubate insieme senza alcun trattamento, al fine di valutare la segnalazione paracrina reciproca basale, ad esempio. Oltre ad avere un valore nel campo della neuroinfiammazione, come dimostrato qui, i sistemi di co-coltura con inserti possono essere impiegati per rispondere a un'ampia gamma di domande relative alla rigenerazione tumorale, alla neurolatirismia, alla segnalazione dell'apoptosi o a qualsiasi altro argomento che coinvolga un componente di segnalazione paracrina.Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come i sistemi di co-coltura con inserto possano offrire un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati da fattori solubili secreti. E speriamo di averti convinto del grande potenziale di questi sistemi di co-coltura con inserto nello studio della segnalazione paracrina multicellulare in assenza di contatto diretto tra le cellule.

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