Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un sistema di coltura cellulare in co-coltura di due tipi cellulari utilizzando inserti con una membrana permeabile, consentendo così la diffusione di fattori solubili secreti. Questo viene ottenuto mediante una serie di passaggi che posizionano con precisione inserti contenenti un tipo cellulare in una piastra per colture tessutali a più pozzetti contenente un secondo tipo cellulare. Iniziamo seminando il tipo cellulare numero uno negli inserti e il tipo cellulare numero due in una piastra per colture tessutali a pozzetti multipli.

Il secondo passaggio consiste nel trasferire gli inserti nei pozzetti della piastra contenente il tipo cellulare numero due. In definitiva, questo consente di raccogliere i due tipi cellulari e i rispettivi supernatanti. Pertanto, è possibile valutare l'effetto dei fattori solubili secreti sul tipo cellulare di interesse.

In organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti elicitano risposte da diversi tipi cellulari a seguito di segnalazione paracrina. Pertanto, il valore di un sistema di co-coltura con inserto risiede nella sua capacità di offrire un approccio originale per valutare le modifiche dei parametri cellulari mediate da fattori solubili secreti in assenza di contatto diretto tra le cellule. I sistemi di co-coltura con inserto offrono diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche di co-coltura, come: uno, segnalazione direzionale; due, conservazione della polarità cellulare; e tre, rilevamento specifico della popolazione per le modifiche cellulari.

Di seguito verrà illustrato un protocollo specifico per misurare gli effetti tossici delle citochine secrete dai microglia N9 attivati dal lipopolisaccaride su cellule neuronali PC12, fornendo così una comprensione concreta della metodologia di co-coltura con inserti. Per iniziare, rimuovere l'imballaggio dalla piastra per colture cellulari a 24 pozzetti e dagli inserti in politetrafluoroetilene poroso con pori di 0,4 micron. Successivamente, posizionare gli inserti nei pozzetti vuoti della piastra per colture cellulari afferrando il bordo superiore dell'inserto con pinzette sterili.

Successivamente, riempire gli inserti con il mezzo N9 di routine fino a quando la membrana è completamente coperta. Incubare gli inserti per almeno un'ora, oppure durante la notte, per migliorare la capacità delle cellule di aderire. Una volta che gli inserti sono pronti, suddividere le microglia N9 a una confluenza dell'80-90% utilizzando il mezzo N9 di routine per ottenere una sospensione cellulare che verrà utilizzata per seminare gli inserti.

Quindi, rimuovere il mezzo di routine dagli inserti avendo cura di non perforare la membrana con la punta della micropipetta. Successivamente, seminare ogni inserto a 60.000 cellule per centimetro quadrato con 50 microlitri di sospensione cellulare, oppure secondo il protocollo del produttore dell'inserto. Durante la distribuzione della sospensione cellulare, assicurarsi che rimanga omogenea invertendo occasionalmente il tubo.

Una volta seminati tutti gli inserti, agitare delicatamente la piastra avanti e indietro, quindi da sinistra a destra, per distribuire le cellule in modo uniforme. Evitare movimenti circolari poiché potrebbero causare l'accumulo delle cellule al centro dell'inserto. Successivamente, incubare la piastra contenente gli inserti per 24 ore prima di procedere con l'attivazione dei microglia N9.

Iniziare pesando 10 milligrammi di lipopolisaccaride e conservarli in una provetta Eppendorf da 1,5 millilitri per un uso successivo. Poiché il lipopolisaccaride è un potente endotossina pro-infiammatoria e richiede specifiche precauzioni di sicurezza, si raccomandano fortemente l'uso di occhiali, guanti e una maschera respiratoria antiparticolato. Successivamente, preparare una serie di diluizioni seriali del lipopolisaccaride utilizzando il mezzo di trattamento N9 tiepido, al fine di ottenere soluzioni operative di quattro, due e un microgrammo per millilitro.

Infine, rimuovere metà del mezzo di coltura dagli inserti, avendo cura di non disturbare le cellule. Quindi, aggiungere delicatamente 25 microlitri delle soluzioni operative di lipopolisaccaride negli inserti, ottenendo diluizioni finali di 2, 1 o 0,5 microgrammi per millilitro. Incubare la piastra per ulteriori 24 ore prima di procedere con gli esperimenti di co-coltura.

Questo passaggio richiede cellule PC12 seminate a 30.000 cellule per centimetro quadrato, interneuroni differenziati e microglia N9 attivata con lipopolisaccaride per 24 ore come descritto nella sezione precedente. Iniziare rimuovendo delicatamente tutto il mezzo dagli inserti e sostituendolo con 50 microlitri di mezzo di trattamento N9 fresco e pre-riscaldato. Questo passaggio è necessario per rimuovere ogni traccia di lipopolisaccaride, lasciando soltanto microglia N9 attivata.

Tenere presente che gli inserti sono liberi nei pozzetti della piastra per colture cellulari e possono spostarsi se la punta viene premuta troppo contro la parete. Questo passaggio deve essere eseguito un inserto alla volta per evitare che le cellule si secchino a causa di un prolungato contatto con l'aria. Successivamente, rimuovere completamente il mezzo delle cellule neuronali PC12 e sostituirlo con 0,6 millilitri di mezzo di trattamento PC12 fresco e caldo.

Eseguire questa operazione una alla volta per garantire che le cellule non si secchino. Utilizzando pinzette, afferrare il bordo superiore di un inserto e posizionarlo delicatamente nel pozzetto contenente le cellule neuronali PC12. Una volta trasferiti tutti gli inserti, verificare la presenza di bolle d'aria al di sotto delle membrane degli inserti.

Le bolle d'aria impediranno qualsiasi scambio attraverso la membrana dell'inserzione e potranno compromettere l'intero esperimento. Rimuovere le bolle d'aria sollevando molto delicatamente l'inserzione dalla pozzetta con delle pinzette e riposizionandola nel mezzo di coltura cellulare; questa operazione dovrebbe eliminare la maggior parte delle bolle. Tuttavia, per le bolle più persistenti, provare a immergere delicatamente l'inserzione nuovamente nel mezzo di coltura cellulare con un angolo inclinato.

Non battere né agitare gli inserti, poiché ciò tende a causare la dissociazione delle cellule aderenti. Successivamente, verificare i volumi di mezzo sia negli inserti che nei pozzetti: il liquido in entrambi i compartimenti dovrebbe trovarsi approssimativamente allo stesso livello. Una volta eliminate tutte le bolle d'aria e verificato che i volumi del mezzo siano adeguati, incubare la piastra.

Le cellule, il mezzo di coltura o entrambi possono quindi essere raccolti per misurare gli effetti della segnalazione paracrina tra le microglia N9 e le cellule neuronali PC12. Sono stati eseguiti saggi immunoenzimatici sul mezzo di coltura del compartimento inferiore per quantificare le citochine proinfiammatorie. I risultati mostrano che 24 ore dopo il periodo di attivazione, le microglia N9 trattate con due microgrammi per millilitro di lipopolisaccaride hanno secreto una quantità significativamente maggiore di citochine proinfiammatorie, come interleuchina-6, fattore di necrosi tumorale-alfa e interferone gamma, rispetto alle microglia non trattate.

Inoltre, le microglia N9 trattate con un microgrammo per millilitro di lipopolisaccaride hanno secreto una quantità nettamente maggiore di interferone gamma dopo 24 ore, mentre sono state necessarie 48 ore per osservare un aumento significativo dei livelli di interleuchina-6 e del fattore di necrosi tumorale alfa nel mezzo cellulare. Al contrario, la condizione con 0,5 microgrammi per millilitro non è riuscita a potenziare l'espressione delle citochine nelle microglia N9 sia a 24 che a 48 ore dal periodo di attivazione. Inoltre, i dati a 24 ore nel gruppo con due microgrammi per millilitro suggeriscono la presenza di microgliosi, ovvero un aumento della popolazione microgliale.

Tuttavia, solo dopo 48 ore il numero cellulare è aumentato in modo significativo. Infine, al fine di valutare le conseguenze dell'attivazione microgliale che porta a un aumento della secrezione di citochine e a microgliosi, è stata valutata la citotossicità nelle cellule neuronali PC12 in co-coltura. Misurando i livelli di lattato deidrogenasi extracellulare, che viene rilasciata dalle cellule danneggiate, si è osservato che le cellule neuronali PC12 mostravano una maggiore morte cellulare all'aumentare della concentrazione di lipopolisaccaride sulle cellule N9.

Pertanto, questi risultati dimostrano che i fattori solubili secreti sono in grado di attraversare la membrana degli inserti per co-coltura e possono causare danni citotossici alle cellule neuronali PC12 in assenza di contatto diretto tra le cellule. Sebbene qui sia stato presentato un solo scenario di co-coltura con inserti, si tratta di una tecnica molto flessibile. In questo protocollo, un tipo cellulare è stato pretrattato con la molecola responsabile della riduzione della secrezione di fattori solubili che, una volta trasferito l'inserto nel pozzetto, influenzano il comportamento di un secondo tipo cellulare.

Tuttavia, è possibile incubare contemporaneamente entrambi i tipi cellulari in un sistema di co-coltura per rilevare l'aumento della debolezza o della resistenza di una o di entrambe le popolazioni cellulari a un successivo trattamento. Questa tecnica può semplicemente utilizzare due popolazioni cellulari incubate insieme senza alcun trattamento, al fine di valutare la segnalazione paracrina reciproca basale, ad esempio. Oltre ad avere un valore nel campo della neuroinfiammazione, come dimostrato qui, i sistemi di co-coltura con inserti possono essere impiegati per rispondere a un'ampia gamma di domande relative alla rigenerazione tumorale, alla neurolatirismia, alla segnalazione dell'apoptosi o a qualsiasi altro argomento che coinvolga un componente di segnalazione paracrina.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come i sistemi di co-coltura con inserto possano offrire un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati da fattori solubili secreti. E speriamo di averti convinto del grande potenziale di questi sistemi di co-coltura con inserto nello studio della segnalazione paracrina multicellulare in assenza di contatto diretto tra le cellule.