3D Flipwell Engineering per lo sviluppo di sistemi asincroni per terapie tossicologiche e immunomodulatorie in cellule batteriche, intestinali e immunitarie

Abbiamo sviluppato un sistema di co-coltura 3D che imita l'ambiente mucoso intestinale per studiare la diafonia seriale e valutare le risposte farmacologiche che potrebbero essere utilizzate per lo screening farmacologico e per comprendere le interazioni cellulari mucose. Diversi gruppi hanno sviluppato diversi sistemi di coltura per modellare l'ambiente mucoso intestinale utilizzando tecniche di bioingegneria molto complesse. Ma invece, abbiamo sviluppato un sistema di co-cultura molto più facile da realizzare utilizzando materiali meno costosi.

Il nostro sistema di co-coltura ha rivelato che un farmaco proteinogeno innesca risposte coordinate tra batteri intestinali, cellule epiteliali e immunità, attivando probabilmente l'immunità dell'ospite con i nostri metaboliti batterici e mediando la comunicazione tra specie. Miriamo a studiare sia ceppi batterici aerobici che anerobici e i loro metaboliti per scoprire gli effetti immunomodulanti, aprendo la strada a nuove strategie immunoterapeutiche basate sui metaboliti batterici. Per cominciare, apri un copricapo per piastre di Petri e mettilo da parte.

Posiziona una lama di bisturi sul bordo del fondo della piastra di Petri. Prendi una pinzetta sterile e prendi delicatamente il fondo dell'inserto verso l'alto per rimuoverlo dalla confezione. Con l'altra mano, prendi la lama sterile del bisturi e portala all'inserto.

Con un movimento a forma di C, perfora la membrana sul bordo e fai scorrere delicatamente la lama del bisturi attorno al fondo dell'inserto, restando vicino alla parete di plastica. Taglia la membrana PET e usa la seconda pinzetta per rimuoverla. Poi usa la lama del bisturi per raschiare eventuali trucioli bianchi della membrana e pulire il bordo e il bordo dell'inserto.

Poi, stendi delicatamente una perla di silicone da 2-3 millimetri tutto intorno al fondo dell'inserto, facendo attenzione a non toccare la membrana. Prendi il secondo set di pinze sterili e solleva con cura il primo inserto senza la membrana dal suo zaino protettivo. Unisci i due inserti dal basso al basso in modo che i bordi inferiori si allineino.

Quando il pila Flipwell è incollata, mettila all'interno della confezione sterile originale o in una piastra di Petri profonda per farla asciugare per 72 ore. Usa il coperchio delle piastre di Petri specificate per coprire l'assemblaggio della pila. Per sterilizzare gli assemblaggi dello stack, si usano pinze sterili per appendere lo stack Flipwell sul bordo del bordo della piastra di Petri profonda specificato.

Poi, chiudi la fascia di vetro dell'armadietto di biosicurezza e accendi la luce ultravioletta. Per verificare eventuali perdite prima del rivestimento di collagene, aggiungi prima 500 microlitri di PBS sterile o acqua deionizzata sterile. Il giorno dopo, aspira il liquido usato per i test prima di asciugare le stack per 1-2 ore all'interno dell'armadietto di biosicurezza.

Per ricoprire la membrana con collagene, apri il coperchio della piastra di Petri e lascia che il Flipwell penda dal bordo della piastra di Petri. Aggiungi con attenzione 200 microlitri di soluzione di collagene su un lato della pila dell'inserto. Aspirare la soluzione di collagene dopo un'ora, poi pipetta 200 microlitri di PBS sterile. Dopo aver aspirato il PBS, copri la piastra di Petri con un coperchio e lascia asciugare la membrana per 60 minuti all'interno dell'armadietto.

Quando la membrana è asciutta, usa pinze o pinzette sterili e gira la Flipwell sul lato opposto lasciandola penzolare dal bordo della piastra di Petri. Per realizzare l'inserto batterico, posizionare due set di pinze sterili e gli inserti a 24 pozzi all'interno dell'armadietto di biosicurezza. Con una pinzetta sterile, solleva l'inserto dal suo impacco sterile.

Con il secondo set di pinzette o pinze, stacca i piccoli piedini di plastica alla base dell'inserto. Testa l'inserto a 24 pozzi montandolo all'interno di uno degli stack sterili degli inserti co-culture Flipwell o degli inserti originali a 12 pozzi. Per iniziare a seminare i Flipwell, semina 500 microlitri delle linee cellulari epiteliali su ciascun lato apicale del Flipwell.

Copri gli assemblaggi con un coperchio per piastra di Petri, poi incuba a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% durante la notte finché le cellule non si attaccano. Apri il coperchio della piastra di Petri e aspira il supporto DMEM dal lato apicale della pila Flipwell. Con la pinza sterile, prendi con cura il Flipwell per il gancio e ruotalo di 180 gradi.

Con il secondo set di pinze sterili, prendi la pila Flipwell per l'altro gancio ora rivolto verso l'alto. Poi abbassa l'insieme di nuovo nella piastra di Petri e appendi il gancio sopra il bordo della piastra di Petri. Aggiungi 500 microlitri di sospensione per celle THP-1 sul lato apicale dello stack di inserti di co-coltura.

Regolare il mezzo HT-29 per le cellule epiteliali del colon aggiungendo materiale alla piastra di Petri del pozzo profondo. Per rimuovere eventuali bolle d'aria, tieni la pila Flipwell per il braccio con una pinza sterile. Abbassa con attenzione un ago da gavage dentro e sotto l'assemblaggio dell'inserto e posiziona molto delicatamente la punta morbida vicino alla bolla d'aria.

Tira con cura e molto lentamente lo sturalavandini della siringa e guarda la bolla d'aria sparire lentamente. Poi rimuovi con attenzione ago e siringa dal Flipwell. Dopo che le bolle d'aria sono state rimosse con un ago a forma di garaggio, si coltura entrambi i tipi cellulari nell'incubatore di colture cellulari.

Con la pinza, inserisci l'inserto in una piastra di Petri sterile e coprila con il coperchio. Trasferisci la piastra di Petri con i Flipwell nell'armadietto di biosicurezza e mettila da parte sul lato opposto della teglia con inserti batterici. Pipetta 300 microlitri del mezzo DMEM dal lato apicale del Flipwell per consentire l'inserimento batterico, poi copri con il coperchio della piastra di Petri.

Ora, aggiungi da 50 a 100 microlitri di coltura di Bacillus subtilis agli inserti batterici a 24 pozzi e inseriscilo nel lato superiore del Flipwell. Ruota il braccio e appendilo al bordo della pila di inserti co-culture Flipwell. Tieni la pila con il secondo set di pinze sterili.

Dopo un'incubazione di tre ore, si usano pinze sterili per rimuovere l'inserto batterico dal Flipwell. Inserire il Flipwell all'interno di un tubo conico da 50 millilitri senza smontare. Per smontare il Flipwell per la microscopia elettronica, si tiene con entrambe le mani e si torce via ogni parte incollata dello stack.

Ruota l'inserto con la membrana e posalo con la membrana rivolta verso l'alto. Tieni l'inserto, taglia con cura la membrana con una lama di bisturi, poi inseriscila in un tubo da 1,7 millilitri contenente soluzione di aldeide paraformica. Per la microscopia confocale, aggiungi 300 microlitri di PBS sterile sul lato apicale.

Rimuovi con cura la pila dalla piastra di Petri dopo aver pipetato il PBS. Ora, gira il Flipwell e aggiungi 300 microlitri di PBS sul lato RPMI ora rivolto verso l'alto dello stack di inserti co-colture Flipwell, poi aspira la soluzione salina tamponata con fosfato. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, crea una grande goccia di PBS.

Sfila il gruppo inserti per separarlo negli inserti. Poi posiziona con cura lo stack Flipwell con celle THP-1 sopra la caduta di 200 microlitri di PBS. Aggiungi 200 microlitri di buffer di permeabilizzazione sulla parte superiore con cellule epiteliali del colon e lascia per 10 minuti.

Per la colorazione immunofluorescente, si pipettano 300 microlitri di anticorpo primario sulla parte superiore dell'inserto. Aggiungi 300 microlitri di anticorpo primario al pozzo di una piastra a 12 pozzi, poi posiziona l'inserto all'interno del pozzo sopra la goccia. Copri bene l'anticorpo.

La colorazione ha mostrato aumenti drammatici della secrezione di muco nel compartimento epiteliale intestinale dopo il trattamento con sepiapterina, come indicato dagli aumenti della proteina marcatore epiteliale CK20 e della proteina mucosa MUC2. Nelle monocolture di THP-1, il trattamento con sepiapterina ha aumentato significativamente l'espressione del marcatore macrofago M1 CD80, mentre ha modulato il marcatore macrofagico M2 CD163, indicando la polarizzazione M1. La microscopia elettronica a scansione ha rivelato un aumento della secrezione di muco dalle cellule epiteliali nelle co-colture trattate in separazione.

Il trattamento con sepiapterina ha indotto una morfologia dei macrofagi simili al fenotipo M1 sia in monocolture che in co-colture. Le cellule batteriche nelle monocolture trattate con sepiapterina mostravano superfici rugose caratteristiche della formazione di biofilm.