Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

L'obiettivo generale di questo semplice modello di cocoltura in vitro è quello di imitare le caratteristiche di un microambiente tumorale in vivo, arricchire le singole popolazioni cellulari e studiare varie modalità di comunicazione intercellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro e della radiobiologia, in particolare per quanto riguarda i fattori alla base della generazione di fibroblasti associati al cancro e le risposte agli agenti terapeutici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la generazione di singole popolazioni cellulari da una coltura cellulare mista senza l'etichettatura a fluorescenza o la selezione cellulare che inducono stress.

Inizia lavando la coltura cellulare di interesse due volte con cinque millilitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, staccare le cellule con un millilitro di tripsina-EDTA a temperatura ambiente per due minuti a temperatura ambiente. Quindi spegnere la reazione con nove millilitri di terreno di coltura completo, pipettando delicatamente il terreno sulla superficie del pallone 10 volte per dissociare le cellule.

Dopo il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per millilitro in terreno fresco e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri. Centrifugare le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un terreno di crescita fresco integrato con il 50% di siero fetale bovino a 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per 70 microlitri di media concentrazione. Successivamente, trasferire gli inserti della dimensione dei pori sperimentale appropriata dalla loro confezione nei singoli pozzetti di una piastra a più pozzetti e coprire la capsula.

Quindi, tenendo il piatto con entrambe le mani, capovolgere delicatamente il piatto fino a quando il fondo dell'inserto non è rivolto verso l'alto. Togliete il fondo del piatto. Utilizzando una pinza sterile in una mano, tenere un inserto in posizione e utilizzare l'altra mano per aspirare lentamente 70 microlitri di cellule in un puntale per micropipetta.

Quindi erogare lentamente le cellule sulla superficie di quella che ora è la parte superiore dell'inserto. Dopo aver seminato ciascuno degli inserti, riposizionare con cura il fondo del piatto e incubare il piatto capovolto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità per 30-45 minuti. Al termine dell'incubazione, in una cabina di sicurezza biologica a flusso laminare, capovolgere accuratamente la piastra in modo che il fondo degli inserti sia rivolto verso il basso.

Quindi immergere lentamente e con attenzione il fondo di ciascun inserto in due millilitri di terreno completo preriscaldato e riposizionare il piatto nell'incubatrice umidificata. Dopo 48 ore, sostituire il terreno sul fondo di ogni pozzetto con due millilitri di terreno di coltura fresco. Quando tutto il terreno è stato rinfrescato, seminare 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula della seconda popolazione di interesse sulla parte superiore degli inserti in un millilitro di terreno fresco e rimettere il piatto nell'incubatrice.

24, 48 e 96 ore dopo, sostituire il terreno nella parte superiore di ciascun inserto con un millilitro di terreno completo fresco. E il terreno sul fondo di ogni pozzetto con due millilitri di terreno completo fresco. Dopo 120 ore di cocoltura, trasferire un inserto alla volta in singole piastre di coltura cellulare da 35 millimetri contenenti un millilitro di PBS.

E lavare il fondo e la parte superiore degli inserti con un millilitro di PBS. Per raccogliere le cellule cresciute sul fondo dell'inserto, posizionare gli inserti con il lato inferiore rivolto verso il basso in 200 microlitri di tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Dopo due minuti a temperatura ambiente, interrompere la reazione con 800 microlitri di terreno di coltura completo.

Quindi, tenendo l'inserto leggermente inclinato, pipettare delicatamente il surnatante sulla superficie delle cellule 10 volte, raccogliendo le cellule nel piatto. Quando tutti gli inserti sono stati rimossi, risospendere le cellule a una concentrazione di due volte 10 per la quinta cellula per millilitro di terreno di crescita. E aggiungere 250 microlitri di cellule su vetrini di vetro sterili individuali.

Posizionare i vetrini coprioggetti nell'incubatrice umidificata per un'ora. Al termine dell'incubazione, in una cappa di sicurezza biologica a flusso laminare, aggiungere con cura due millilitri di terreno di coltura completo alla piastra e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con umidità per 48 ore. Quindi lavare le celle tre volte con PBS.

Dopo il terzo lavaggio, fissare le cellule in formaldeide al 4% in PBS per dieci minuti a temperatura ambiente, seguiti da cinque lavaggi con soluzione fisiologica tamponata con Tris. Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,25% integrato con saponina 0,1 per cinque minuti a temperatura ambiente, seguito da incubazione in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, etichettare i campioni con l'anticorpo primario di interesse nella soluzione bloccante a quattro gradi Celsius durante la notte.

La mattina successiva, rimuovere l'anticorpo non legato con tre minuti di lavaggio in soluzione di lavaggio, seguiti da un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente nell'anticorpo secondario appropriato in soluzione bloccante. Al termine dell'incubazione, lavare l'anticorpo secondario non legato come appena dimostrato e montare i vetrini coprioggetti su vetrini singoli con terreno di montaggio antisbiadimento contenente DAPI. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente.

Quindi visualizza le cellule con un ingrandimento dell'olio di 63x su un microscopio invertito dotato di una sorgente di luce esterna per l'eccitazione della fluorescenza. Questo sistema consente di far crescere due diverse popolazioni cellulari su entrambi i lati delle membrane porose degli inserti di coltura cellulare per almeno 120 ore, mantenendo una purezza superiore al 99% nelle popolazioni cellulari su entrambi i lati della membrana, quando vengono utilizzati inserti con pori da 0,4 o un micron. Gli inserti con tre micron di pori, tuttavia, sono abbastanza grandi da consentire alle cellule di migrare attraverso la membrana, come osservato in questo esperimento utilizzando una linea cellulare di carcinoma mammario umano GFP-positiva.

inserti porosi da 0,4 micron limitano anche la formazione di giunzioni funzionali tra le colture cellulari su entrambi i lati dell'inserto, limitando la comunicazione ai fattori secreti. Gli inserti con pori da uno e tre micron, tuttavia, consentono l'accoppiamento funzionale delle cellule attraverso le giunzioni gap, come indicato dal trasferimento dell'etichetta fluorescente attraverso la membrana in queste cocolture. È importante sottolineare che questo sistema può essere utilizzato per generare efficacemente fibroblasti associati al cancro da normali fibroblasti diploidi umani dopo la loro cocoltura con cellule di cancro al seno, come evidenziato dalla ridotta espressione di caveolina-1 sui fibroblasti cocoltivati con le cellule di cancro al seno umano.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante selezionare inserti con una dimensione dei pori adeguata alla questione in esame. E vedere la prima popolazione cellulare sul lato inferiore dell'inserto in terreno che ne facilita l'attaccamento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoblotting, l'immunofluorescenza in situ o la maggior parte degli altri saggi basati su cellule per rispondere a ulteriori domande sulle alterazioni dell'espressione proteica, sui cambiamenti nell'invasione e nella migrazione o sulle differenze nelle risposte agli agenti terapeutici.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro e della biologia delle radiazioni per esplorare i fattori che contribuiscono allo sviluppo, all'evoluzione del microambiente tumorale e, nel nostro caso, alla diffusione degli effetti dannosi delle radiazioni ionizzanti dalle cellule bersaglio con radiazioni alle cellule astanti nelle vicinanze. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una cocoltura cellulare mista, mantenere la cocoltura e raccogliere popolazioni cellulari arricchite ad alta purezza dalla cocoltura per ulteriori analisi. Non dimenticare che lavorare con ceppi o linee cellulari umane può essere pericoloso e che è necessario indossare dispositivi di protezione individuale appropriati e rispettare le norme di biosicurezza durante l'esecuzione di questa procedura.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.