Name: Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Scopri un modello di co-coltura in vitro per mimare il microambiente tumorale e arricchire popolazioni cellulari. Questo metodo semplice consente di studiare la comunicazione intercellulare senza tecniche stressanti come il tagging fluorescente.

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Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni della New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), del National Institutes of Health (CA049062) e della National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).

1. Preparazione della cultura dei media e delle cellule <ol><li> Preparare 500 ml di mezzo di Eagle minimo essenziale integrato con 12,5% (vol / vol) siero bovino fetale inattivato al calore (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutammina, e 100 unità di penicillina e 100 pg di streptomicina per ml. NOTA: Il mezzo di crescita e integrazione (s) può essere facilmente scambiato per le esigenze di crescita di altri ceppi cellulari o linee cellulari. </li><li> Preparare 70 ml di terreno di coltura cellulare per ogni inserto (formato 6-ben inserto): mezzo essenziale minimo Eagle integrato con il 50% (vol / vol) inattivato al calore FBS, 2 mM di L-alanil-L-glutammina, e 100 unità di penicillina e 100 pg di streptomicina per ml. NOTA: Il mezzo è completato con 50% FBS per facilitare l&#39;adesione delle cellule al lato inferiore (cioè, inferiore) dell&#39;inserto. Il mezzo di crescita e integrazione (s) possono essere facilmente scambiate per le esigenze di crescita di altri ceppi cellulari o linee cellulari. </li><li>Preparare una sospensione cellulare delle cellule destinate a essere placcato sul lato inferiore dell&#39;inserto. NOTA: Qui, i risultati sono stati ottenuti utilizzando AG1522 normali fibroblasti umani coltivati ​​in 75 cm 2 fiasche di coltura cellulare, e queste cellule saranno quindi al centro di descrizione della preparazione della sospensione cellulare. </li><li> Per raccogliere le cellule, rimuovere il mezzo di crescita e lavare i 2x monostrato cella con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS). </li><li> Rimuovere il PBS e diffondere 1 ml di 0,25% (vol / vol) di tripsina con 2,21 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pre-riscaldato a temperatura ambiente (RT) sulle cellule per 2 min a RT (temperatura ambiente). </li><li> Quench l&#39;attività tripsina con 9 ml di mezzo di crescita completo (preparato al punto 1.1) e raccogliere le cellule pipettando delicatamente la sospensione cellulare sulla superficie del pallone 10x. </li><li> Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro o contatore elettronico e pipettare il volume sospensione cellulare che provide 250.000 cellule per inserire in una sterile 15 ml provetta da centrifuga. </li><li> Pellet la sospensione cellulare mediante centrifugazione (800 xg, 2 min). Sospendere il pellet di cellule con mezzo di crescita (preparato al punto 1.2) per creare una concentrazione di 250.000 cellule per 70 microlitri. NOTA: Come coltura cellulare in inserti membrana microporosa permeabile è basato su substrati 2D, semina cella è eseguita in modo simile, eccetto le cellule devono essere inizialmente sospese in terreno contenente 50% (vol / vol) FBS per facilitare il fissaggio. </li></ol> 2. Preparazione di Inserti NOTA: Per assicurare condizioni di sterilità, il lavoro in una cappa a flusso laminare di sicurezza biologica dedicata alla coltura cellulare. <ol><li> Selezionare inserti con una dimensione dei pori di membrana di 0,4 micron, 1 micron o 3 micron (determinata dalla interesse sperimentale (s), come la dimensione dei pori possono essere usati per esplorare il ruolo dei diversi modi di comunicazione intercellulare). NOTA: Il poro 0,4 micron è Smalabbastanza l di limitare la formazione di giunzioni gap funzionali tra celle su entrambi i lati della membrana inserto e può essere usato per studiare la comunicazione intercellulare da fattori secreti. Considerando che, il 1 micron e 3 micron pori sono abbastanza grandi da permettere la formazione di giunzioni funzionali e possono essere utilizzati per studiare la comunicazione intercellulare da entrambe le giunzioni e fattori secreti. </li><li> Rimuovere i singoli inserti dalla confezione e posto in un altrettanto dimensioni multi-ben piatto. NOTA: Gli inserti sono disponibili con diverse superfici di membrana per soddisfare esigenze applicative specifiche (ad esempio, 6-pozzetti, inserti 12-bene, e 24 pozzetti.). Qui, i risultati sono stati ottenuti utilizzando l&#39;inserto 6-bene, e sarà quindi al centro della descrizione del modello. </li><li> Coprire il piatto, contenente gli inserti con il coperchio piatto. Tenendo il piatto multi-bene con entrambe le mani, capovolgere delicatamente il piatto in modo che il fondo di inserimento (cioè inferiore) sono ora rivolti verso l&#39;alto. </li><li> rimuovere °e fondo del piatto multi-bene, esponendo il lato inferiore degli inserti. Lavorare con un inserto alla volta, utilizzare un paio di pinze sterili e tenere delicatamente l&#39;inserto in posizione. Con la mano libera, utilizzare una pipetta con una punta bocca larga per disegnare 70 ml di sospensione cellulare (preparato in passaggi 1,3-1,8), contenente 250.000 cellule. </li><li> Al piatto le celle, inserire la punta della pipetta delicatamente sul centro della membrana di inserimento, e pipetta lentamente 70 ml di sospensione cellulare mentre lentamente spostando la punta della pipetta attorno alla superficie della membrana. Fare attenzione a non estendere la punta della pipetta e sospensione cellulare al bordo dell&#39;inserto. NOTA: toccando il bordo dell&#39;inserto potrebbe causare la perdita di tensione capillare della sospensione cellulare che porta alle celle di essiccazione durante allegato. </li><li> Ripetere per inserti rimanenti, con cura viene esercitato non lavorare direttamente sopra gli inserti esposti per evitare la potenziale contaminazione microbica. </li><li> tornare delicatamente il multi-pozzofondo piatto per coprire gli inserti. Mantenere il piatto con inserti invertita, incubare in atmosfera aria umidificata 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C per 30-45 min. NOTA: Se la sospensione cellulare sui contatti inserto del fondo del pozzo, sollevare con cura il fondo piatto e di riposo sul bordo del piano piatto, in modo da formare un leggero angolo e crea una maggiore distanza tra la superficie del piatto e il lato inferiore degli inserti (dove vengono seminate cellule). Ciò impedirà le cellule di attaccarsi alla superficie dei pozzetti invece dell&#39;inserto. </li><li> Dopo il tempo di incubazione 30-45 min, rimuovere delicatamente il piatto contenente gli inserti e posizionarlo nella cappa di sicurezza biologica a flusso laminare. </li><li> Con due mani e mantenendo il coperchio piatto stretto, gentilmente re-invertire il piatto in modo che il lato inferiore degli inserti contenenti le cellule attaccate ora rivolto verso il basso. </li><li> Lentamente e con attenzione aggiungere 2 ml (1 ml per 3 micron pori inserti per evitare migratisu cellule attraverso i pori inserto) di terreno completo pre-riscaldato (vedere fase 1.1) a ciascun pozzetto, in modo che il fondo dell&#39;inserto è immersa. </li><li> Dopo l&#39;aggiunta di terreno di crescita in tutti i pozzetti contenenti inserti, posizionare il piatto di nuovo nel incubatore umidificato. </li><li> Lasciare gli inserti di rimanere indisturbata in incubatrice per 48 ore. Dopo 48 ore, alimentare le cellule aspirando i 2 ml di terreno dal fondo del pozzo e aggiungendo 2 ml di terreno di coltura fresco. </li><li> Dopo aver aggiunto mezzo fresco al fondo del pozzo, sementi 1 ml della seconda sospensione popolazione cellulare (~ 250.000 cellule / ml) sul lato superiore dell&#39;inserto, che ha già la prima popolazione cellulare crescente sul lato inferiore (per queste esperimenti, cellule (controllo) AG1522 o cellule tumorali (sperimentali) sono placcati sulla sommità degli inserti, che hanno già cellule AG1522, destinate a diventare CAF, crescente sul lato inferiore degli inserti). Porre la capsula di nuovo nel incubatore umidificato. NOTA: Se il lavorore con cellule che non aderiscono bene al fondo dell&#39;inserto, queste cellule possono essere coltivate in alternativa sul lato superiore dell&#39;inserto. </li><li> Cambiare il mezzo a 24, 72, e 96 ore dopo la semina della seconda popolazione di cellule sul lato superiore dell&#39;inserto aspirando il mezzo dall&#39;alto dell&#39;inserto e fondo del pozzetto. Delicatamente aggiungere 1 ml di mezzo fresco al lato superiore dell&#39;inserto e 2 ml al fondo del pozzo. Lasciare le due popolazioni cellulari di rimanere in co-coltura su entrambi i lati della membrana microporosa permeabile inserto per 120 ore. </li></ol> 3. Raccolta Cellule da Inserisci per tripsinizzazione NOTA: Oltre alla facilità di ottenere popolazioni cellulari arricchiti, il modello TME inserto permette anche per trattamenti sperimentali simili (ad esempio, l&#39;incubazione con sostanze chimiche, esposizione a condizioni di ossigeno che sono sopra o sotto atmosfera ambiente, trattamento con radiazioni ionizzanti, ecc) come altri in vitro </em&gt; TME modelli co-coltura. Inoltre, il substrato inserto co-coltura permeabile può essere analizzato da procedure già sviluppate per i modelli 2D standard di coltura dei tessuti. Ad esempio, le cellule possono essere raccolte da entrambi i lati della membrana inserto per ottenere popolazioni altamente arricchito, che può quindi essere utilizzato per l&#39;analisi di endpoint (ad esempio, in situ immuno-rilevazione, Western blotting) o propagate per le successive 36 esperimenti. <ol><li> Per raccogliere le cellule, rimuovere l&#39;inserto del terreno di coltura e metterlo in un piatto di coltura cellulare 35 millimetri contenente 1 ml di PBS. Lavare la parte inferiore e superiore lati dei 1x inserto con 1 ml di PBS. </li><li> Rimuovere il PBS e aggiungere 200 ml di 0,25% (vol / vol) di tripsina con 2.21 mM EDTA, pre-riscaldato a RT. <ol><li> Se la raccolta delle cellule cresciute sul lato inferiore dell&#39;inserto, posizionare la soluzione tripsina nella piastra da 35 mm e posizionare delicatamente il fondo dell&#39;inserto nella soluzione tripsina per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Se la raccolta delle cellules cresciuto sul lato superiore dell&#39;inserto, posizionare l&#39;inserto in una piastra da 35 mm e aggiungere la soluzione tripsina all&#39;inizio dell&#39;inserto e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Placare l&#39;attività tripsina con l&#39;aggiunta di 800 ml di terreno di coltura completo. <ol><li> Se la raccolta delle cellule cresciute sul fondo dell&#39;inserto, aggiungere il medium di crescita alla piastra da 35 mm e raccogliere le cellule pipettando delicatamente i 1 ml di sospensione cellulare sulla superficie dell&#39;inserto 10x, con l&#39;inserto essendo tenuto leggermente angolo tale che la sospensione cellulare raccoglie nel piatto. </li><li> Se la raccolta delle cellule dal lato superiore dell&#39;inserto, aggiungere il medium di crescita al lato superiore e pipettare delicatamente i 1 ml di sospensione cellulare sulla superficie dell&#39;inserto 10x. </li></ol></li></ol> 4. Caratterizzazione di cellule purezza, in citometria a flusso NOTA: per caratterizzare la capacità degli inserti membrana microporosa permeabile per mantenere la purezza del tegli due popolazioni cellulari (cioè, superiore e inferiore) fino a 120 ore, sezioni 1-3 sono state eseguite, con la proteina fluorescente verde (GFP) -tagged MDA-MB-231 cellule essendo placcato sul lato superiore dell&#39;inserto, e cellule AG1522 non GFP-tagged di essere placcato sul lato inferiore del 0,4 μm-, 1 μm-, o 3 micron inserti pori. <ol><li> Una volta che le cellule dal lato inferiore dell&#39;inserto stati raccolti (procedura descritta al punto 3), pellet la sospensione cellulare per centrifugazione (500 g, 30 sec). </li><li> Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 400 ml di soluzione salina bilanciata Hanks &#39;(HBSS) supplementato con 1% (vol / vol) FBS. </li><li> Eseguire citometria su un citofluorimetro equipaggiato con un laser 488 nm per eccitare GFP ed un filtro passa-banda di 530/30 per rilevare GFP emissione di fotoni 37. </li><li> Ai fini dell&#39;identificazione delle cellule, usare popolazioni di cellule di controllo AG1522 per regolare l&#39;ora e le tensioni lato scatter sul citofluorimetro. Regolarela tensione del canale GFP per impostare il valore autofluorescenza cellulare come la soglia di sensibilità inferiore per il segnale GFP. </li><li> Determinare gating soglia utilizzando cellule di controllo. Valutare purezza ciascuna popolazione cellulare basato sulla presenza di cellule GFP-positive rispetto controllo. NOTA: Una popolazione pura sarebbe riflettente di nessuna cellula GPF-positivi rilevati. </li></ol> 5. caratterizzazione di cellule in situ immunofluorescenza <ol><li> Dopo tripsinizzazione delle cellule dall&#39;inserto (vedi sezione 3), raccogliere le cellule, piatto 5 x 10 4 cellule in 250 medie microlitri di crescita (vedi punto 1.1) su vetrini sterili, e consentono di allegare per 1 ora in un atmosfera di aria umidificata di 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C incubatore. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, rimuovere delicatamente il piatto contenente il coprioggetto e posizionarlo nella cappa di sicurezza biologica a flusso laminare. </li><li> Aggiungere con cautela 2 ml di terreno completo pre-riscaldato (vedere fase1.1) per ogni piatto, in modo che il vetrino è immerso. </li><li> Dopo aver aggiunto terreno di crescita a tutti i piatti contenenti coprioggetto, restituire i piatti in un&#39;atmosfera umidificata di 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C in un incubatore per 48 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 48 hr, lavare i 3x campione con PBS e fissare con 4% (peso / volume) di formaldeide in PBS per 10 minuti a RT. </li><li> Risciacquare 5x con Tris Buffered Saline (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) e poi permeabilize con 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (peso / volume) saponina per 5 min a RT. </li><li> Bloccare non specifici siti di legame con 2% (vol / vol) siero normale di capra (NGS), 1% (peso / volume) di albumina di siero bovino (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (blocco soluzione) per 1 ora a RT. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario (anti-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1000) in soluzione bloccante a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare non legati anticorpi primari (3x, 5 min / lavaggio) con lo 0,2% NGS (vol / vol), 1% (peso / volume) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (soluzione di lavaggio). </li><li> Incubare con anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora a soluzione bloccante (vedi paragrafo 5.4). </li><li> Lavare non legato l&#39;anticorpo secondario (3x, 5 min / lavaggio) con soluzione di lavaggio (vedi punto 5.6). </li><li> Monte coprioggetto su un vetrino con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento contenente 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), e sigillare con smalto. </li><li> Osservare cellule utilizzando un obiettivo di ingrandimento olio 63X su un microscopio invertito dotato di una fonte di luce esterna per eccitazione di fluorescenza, e catturare le immagini utilizzando una fotocamera digitale collegata per la successiva analisi. </li></ol> 6. caratterizzazione di cellule di Western Blot NOTA: La procedura di Western Blot è descritto altrove 38. Un breve profilo è descritto qui: <ol><li> Dopo il distacco delle cellule dal inserto da tripsinizzazione (vedi sezione 3), pellet la sospensione cellulare per centrifugazione (500 g, 30 sec). </li><li> Rimuovere il surnatante e sospendere i 2x pellet cellulare con 100 ml di PBS. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e lisare in 50 ml di dosaggio radioimmunoprecipitazione modificato (RIPA) tampone (Tris pH 7.5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), desossicolato sodico monoidrato (DOC) 0,5% (vol / vol), dodecil solfato di sodio (SDS) 0,1% (v / v)), contenenti proteasi e inibitori della fosfatasi cocktail. </li><li> Incubare per 20 min in ghiaccio e centrifugare a 19.000 g per 15 min a 4 ° C. </li><li> Determinare la concentrazione delle proteine ​​nel supernatante utilizzando un saggio densità ottica proteine, compatibili con i detergenti nel buffer RIPA. </li><li> proteine ​​separate mediante elettroforesi gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) e electroblot su una membrana di nitrocellulosa 0,2 micron. </li><li> Incubare membrane in TBS contenente 0,1% (vol / vol) di Tween-20 (TBST) e il 4% (peso / volume) latte scremato (soluzione bloccante) per 60 min e reagire con l&#39;anticorpo primario a 4 ° C per una notte (anti-CAV1, 1: 1.000). </li><li> Lavare 3x membrana con TBST a temperatura ambiente (5 min / lavaggio). </li><li> Incubare le membrane per 30 minuti nel bloccare soluzione contenente un anticorpo secondario anti-topo coniugata con perossidasi di rafano (HRP) (1: 5.000). </li><li> Lavare 3x membrana con TBST a temperatura ambiente (5 min / lavaggio). </li><li> Visualizza prodotti di reazione per chemiluminescenza utilizzando un sistema di rilevamento Western blotting. </li></ol> 7. Caratterizzazione di intercellulare comunicazione mediante citometria di flusso NOTA: Per caratterizzare l&#39;adattabilità della membrana microporosa permeabile inserti di esaminare diverse modalità di comunicazione intercellulare (ad esempio, i fattori secreti, giunzioni). Sezioni 1-2.12 stati eseguiti con cellule AG1522 non fluorescenti essendo placcato sul lato inferiore del 0,4 μm-, 1 μm-, o 3 inserti micron-pori. <ol><li> Cultura non etichettati cellule AG1522 in un piatto 35 millimetri al 90% di confluenza con supporto descritto nel paragrafo 1.1. </li><li> Rcellule INSE 1x con 1 ml di HBSS. </li><li> Le celle di carico con calceina AM incubando le cellule in HBSS contenente 30 micron di calceina AM. </li><li> Incubare per 15 minuti in una atmosfera di aria umidificata al 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule 2x con 1 ml di HBSS. </li><li> Trypsinize cellule aggiungendo soluzione di 200 ml di 0,25% (vol / vol) di tripsina con 2.21 mM EDTA per 2 min a RT. </li><li> Placare l&#39;attività tripsina con l&#39;aggiunta di 800 ml di terreno completo contenente 12,5% (vol / vol) FBS. </li><li> Portare le cellule in sospensione pipettando ripetutamente. </li><li> Calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o contatore elettronico e piastra 250.000 cellule caricate con calceina AM al lato superiore di inserti che già hanno cellule AG1522 crescente sul lato inferiore. </li><li> Incubare gli inserti in un&#39;atmosfera aria umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C per 6 ore. </li><li> Dopo 6 ore, raccogliere le cellule dal lato inferiore degli inserti, come descrittonella sezione 3. </li><li> Pellet la sospensione cellulare per centrifugazione (500 g, 30 sec). </li><li> Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 400 ml di HBSS integrato con 1% (vol / vol) FBS. </li><li> Analizzare le cellule su un citometro equipaggiato con un laser e filtrata in grado di eccitare e rilevare le emissioni di calceina (496 nm e 516 nm, rispettivamente), secondo il protocollo del produttore. </li><li> Ai fini dell&#39;identificazione delle cellule, utilizzare una popolazione di cellule di controllo AG1522 senza macchia per regolare l&#39;ora e le tensioni lato scatter sul citofluorimetro. Regolare la tensione del canale Calceina per impostare il valore di autofluorescenza cellulare come la soglia di rilevamento inferiore per il segnale calceina. </li><li> Determinare il limite di soglia superiore utilizzando cellule di controllo Calceina-caricati. Valutare comunicazione per ciascun inserto cella in base alla presenza di cellule calceina-positivi rispetto ai controlli. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o in conflitto.

Il protocollo qui descritto è un semplice, adattabile a procedura vitro (Figura 1) che utilizza un inserto membrana microporosa permeabile per generare altamente arricchito popolazioni di cellule individuali di una co-coltura di cellule eterotipica. Significativamente, il modello è adatto per studiare vari modi di comunicazione intercellulare. Le fasi critiche comprendono selezionando l&#39;inserto pori di dimensioni appropriate per specifiche interesse sperimentale (s), seminando la p...

Il microambiente tumorale (TME) è un sistema altamente complesso costituito da cellule di carcinoma che coesistono e si evolvono insieme stroma ospite. Questo componente stromale consiste tipicamente di fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, i vari componenti del sistema immunitario, così come una matrice extracellulare 1. Un costituente significativo, spesso la maggior parte di questo stroma, sono fibroblasti attivati, spesso indicato come fibroblasti cancro-associata o fibroblasti carcinoma-associato (CAF) 2,3. A differenza dei normali fibroblasti non attivati, CAF contribuiscono iniziazione tumorale, progressione, angiogenesi, invasione, metastasi e recidive 4-11 in un&#39;ampia varietà di carcinomi, compresi seno, prostata, polmone, pancreas, pelle, colon, esofago, e dell&#39;ovaio 5,6,12-17. Tuttavia, l&#39;esatta natura del contributo della CAF in tutta patogenesi del cancro rimane scarsamente definita. Inoltre, l&#39;evidenza clinica ha dimostrato un valore prognostico della CAF, Correlando la loro presenza a tumori di alto grado, fallimento della terapia, e la scarsa 10,18,19 generale la prognosi. Chiaramente, migliorando la nostra comprensione degli eventi che iniziano nello sviluppo CAF, così come le comunicazioni intercellulari che mediano il loro ruolo all&#39;interno della TME, può fornire nuove interessanti bersagli terapeutici e strategie avanzate che potrebbero migliorare i risultati del paziente. A tale scopo, diversi in vivo e in vitro sono stati sviluppati. Mentre gli approcci in vivo sono più riflessivo di TME dei pazienti, che possiedono limitazioni, tra cui l&#39;immensa complessità ed eterogeneità sia all&#39;interno che tra i tumori. Inoltre, campioni di tumore da soggetti umani spesso rappresentano molto sviluppati TME e non consentono una comprensione degli eventi che iniziano TME. studi su animali sperimentali offrono alcuni vantaggi, tuttavia generalizzazione dei dati sugli animali agli esseri umani dovrebbe essere fatto con cautela a causa delle differenze nei Physiology tra esseri umani e animali come roditori (ad esempio, la chimica tiolo 20, il tasso metabolico 21, la tolleranza allo stress 22, etc.). Inoltre, a differenza della popolazione umana, che è geneticamente eterogenea in natura, gli animali da laboratorio sono in genere allevati per omogeneità. Inoltre, è spesso difficile esaminare variazioni fisiologiche transitorie e cambiamenti fenotipo delle cellule, nonché per il controllo dei parametri sperimentali specifici utilizzando animali come roditori. Così, in vitro 2 e 3 dimensioni (2D e 3D) modelli di coltura dei tessuti sono spesso utilizzati per far progredire la comprensione di base dello sviluppo TME. Nonostante la loro mancanza di una rappresentazione accurata della complessità dei sistemi in vivo, questi modelli offrono vantaggi che facilitano notevolmente indagini meccanicistici. In vitro modelli consentono un&#39;analisi più semplificata, concentrato e conveniente di TME, per cui statisticamente significativa i dati possono essere generati incellule gratuitamente da variazioni sistemici che sorgono in animali. Ci sono diverse varietà di sistemi in vitro. I due modelli TME in vitro più comunemente utilizzati sono costituiti da monostrato misto o colture cellulari sferoidali. Entrambi i metodi di coltura sono vantaggiose per studi di base di interazioni intercellulari (ad esempio, le cellule normali con cellule tumorali) e per l&#39;analisi di varie modifiche fenotipo cellulare specifici TME (ad esempio, emergere di fibroblasti cancro-associata di fibroblasti normali). Inoltre, gli sferoidi possono creare una struttura di tessuto simile più riflessivo della TME, e possono essere rappresentativi del tumore eterogeneità 23. Tuttavia sferoidi spesso producono molto diversi gradienti di tensione di ossigeno attraverso i livelli, che possono complicare le conclusioni sperimentali 24. Purtroppo, entrambi i modelli sono estremamente limitati nella loro capacità di isolare le popolazioni di cellule pure per un&#39;ulteriore caratterizzazione e lo studio dopo cooperazionecultura. Per fare questo è necessario almeno un tipo di cellula di essere fluorescente-tag o etichettati con un produttore di identificazione, e quindi sottoponendo il misto di co-coltura di svariati processi di lavorazione e di smistamento delle cellule per separare le popolazioni di cellule. Mentre un cell sorter è in grado di isolare una popolazione di cellule piuttosto pura, si deve essere consapevoli di stress cellulare e potenziale contaminazione microbica rischi 25. Per facilitare la comprensione della comunicazione intercellulare, grandi sforzi sono stati dedicati allo sviluppo e all&#39;ottimizzazione sistemi in vitro che imitano da vicino l&#39;ambiente in vivo, pur consentendo un approccio semplificato. Uno di questi strumenti è l&#39;inserto microporosa permeabile, un substrato di membrana che è stata sviluppata nel 1953 26 e successivamente adattato per diverse applicazioni e gli studi (per esempio, la polarità delle cellule 27, endocitosi 28, il trasporto di droga 29, la modellazione del tessuto 30, FertSterilizza- 31, effetto astante 32,33, etc.). Questo sistema permette la crescita delle cellule in vivo con -come anatomica e differenziazione funzionale, nonché espressione di molti in vivo marcatori 34,35 che non si osserva quando coltivate su plasticware impermeabile. Inoltre, l&#39;estremamente sottile membrana porosa (10 micron di spessore) consente la rapida diffusione delle molecole e tempi di equilibrazione, che simula l&#39;ambiente in vivo e permette funzionamento cellulare indipendente in entrambi i domini di cellule apicali e basolaterale. Un ulteriore vantaggio di utilità dell&#39;inserto come sistema TME è la separazione fisica dei due popolazioni cellulari eterotipica coltivati ​​su entrambi i lati della membrana nelle stesse condizioni ambientali, mantenendo diverse modalità di comunicazione intercellulare attraverso i pori della membrana. Anche se fisicamente separati, le due popolazioni cellulari sono metabolicamente accoppiati tramite elementi secreti e, come dedescritto qui, anche attraverso i canali gap-giunzionale. Inoltre, mantenendo gli inserti a in vivo tensione parziale dell&#39;ossigeno (PO 2), il modello riduce le complicazioni di ossigeno e chimiche gradienti osservati in altri sistemi. Piuttosto, aumenta la comprensione dei meccanismi naturali che controllano il TME. In particolare, le due popolazioni cellulari possono essere facilmente isolati con elevata purezza, senza codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule dopo periodi prolungati di co-coltura. Qui si descrive un protocollo in vitro TME costituito da cellule di carcinoma mammario umano e fibroblasti umani coltivati rispettivamente, ai due lati di un inserto membrana microporosa permeabile, ma ancora in continua comunicazione bidirezionale attraverso i pori della membrana. Abbiamo dimostrato che utilizzando membrane con differenti dimensioni dei pori, il contributo di un tipo specifico di comunicazione intercellulare (per esempio, fattori secreti contro giunzioni) allo sviluppodella TME può essere indagato.

<table><tbody><tr><td>Per coltura cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (i.e., AG1522) fibroblasto diploide umano</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Passaggio 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 linea cellulare di adenocarcinoma mammario</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>Linea parentale: ATCC (#HTB-26)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231/GFP linea cellulare di adenocarcinoma mammario</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's minimal essential medium (MEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), qualificato</td><td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanil-L-glutammina)</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina soluzione, 100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Inserto Transwell (cioè , inserto a membrana microporosa permeabile) (0,4 &mu; Inserto</td> per pozzetti <td>Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>(cioè , inserto a membrana microporosa permeabile) (1 &mu; Greiner</td> <td>bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Inserto per pozzetti trans (i.e., inserto a membrana microporosa permeabile) (3 &mu; </td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 pallone per colture cellulari</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>0,25% (vol/vol) Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da centrifuga da 15 ml</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari da 35 mm x 10 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Per microscopia a immunofluorescenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-Caveolina 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>In situ Immunofluorescenza - 1:5.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra anti-topo, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>In situ Immunofluorescenza - 1:2.000</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina - Frazione V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td> Soluzione di formaldeide al 16% (wt/vol) <td>priva di immunoglobuline e proteasi</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Diluire al 4% con 1x</td></tr><tr><td>PBS Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)</td><td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento SlowFade Gold con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Flow Cytometric Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM</td><td>Molecular Probes</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Western Blot Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1.000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa (0,2 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Protein Assay</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato monoidrato (DOC)</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

un mimic del microambiente tumorale: un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e investigating intercellulare comunicazione

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

La comprensione delle prime interazioni eterotipica tra le cellule tumorali e lo stroma non cancerose circostante è importante per chiarire gli eventi che portano all&#39;attivazione stromale e l&#39;istituzione del microambiente tumorale (TME). Diversi in vitro e in vivo della TME sono stati sviluppati; Tuttavia, in generale, questi modelli non facilmente consentono l&#39;isolamento di singole popolazioni cellulari, in condizioni non perturbante, per ulteriori studi. Per aggirare questa difficoltà, abbiamo impiegato un modello TME in vitro utilizzando un substrato di crescita cellulare costituito da un inserto membrana microporosa permeabile che permette semplice generazione di popolazioni cellulari altamente arricchito cresciuto intimamente e separatamente, su entrambi i lati della membrana di inserto per co estesa volte -Culture. Attraverso l&#39;uso di questo modello, siamo in grado di generare notevolmente arricchito fibroblasti cancro-associata (CAF) popolazioni da fibroblasti umani normali diploidi seguenteco-coltura (120 hr) con cellule di carcinoma mammario umano altamente metastatico, senza l&#39;uso di codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule. Inoltre, modulando la dimensione dei pori dell&#39;inserto, possiamo controllare il mezzo di comunicazione intercellulare (ad esempio, comunicazione gap-junction, fattori secreti) tra le due popolazioni cellulari eterotipica, che consente studio dei meccanismi alla base dello sviluppo del TME, compreso il ruolo della permeabilità gap-junction. Questo modello serve come un valido strumento per migliorare la nostra comprensione degli eventi iniziali che portano al cancro iniziazione-stroma, la prima evoluzione della TME, e l&#39;effetto modulante dello stroma sulle risposte delle cellule tumorali di agenti terapeutici.

Qui abbiamo adattato un inserto membrana microporosa permeabile per sviluppare un sistema cellulare di co-coltura heterotypic in vitro che simula il microambiente tumorale in vivo (Figura 1). Questo sistema permette due popolazioni cellulari differenti per essere coltivate su entrambi i lati della membrana porosa-dell&#39;inserto per lunghi periodi di tempo (fino a 120 ore, nel nostro uso). È importante sottolineare che il sistema è in grado di mantener...

Abbiamo adattato un inserto di membrana microporosa permeabile per imitare il microambiente tumorale (TME). Il modello è costituito da una coltura cellulare mista, consente la generazione semplificata di singole popolazioni cellulari altamente arricchite senza l'uso di marcature fluorescenti o di smistamento cellulare e consente di studiare la comunicazione intercellulare all'interno del TME in condizioni normali o di stress.

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

L'obiettivo generale di questo semplice modello di cocoltura in vitro è riprodurre le caratteristiche di un microambiente tumorale in vivo, arricchire popolazioni cellulari individuali e studiare diverse modalità di comunicazione intercellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori dell'oncologia e della radiobiologia, in particolare riguardo ai fattori alla base della generazione di fibroblasti associati al cancro e alle risposte ad agenti terapeutici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di ottenere popolazioni cellulari singole da una coltura cellulare mista, senza l'uso di marcatori fluorescenti o di sorting cellulare, che potrebbero indurre stress.Cominciare lavando due volte la coltura cellulare di interesse con cinque millilitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, staccare le cellule con un millilitro di tripsina-EDTA a temperatura ambiente per due minuti a temperatura ambiente. Quindi interrompere la reazione aggiungendo nove millilitri di mezzo di crescita completo, pipettando delicatamente il mezzo sulla superficie della fiasca 10 volte per dissociare le cellule.Dopo il conteggio, diluire le cellule fino a una concentrazione di 2,5 × 10⁵ cellule per millilitro in mezzo fresco e trasferire le cellule in una provetta centrifuga sterile da 15 millilitri. Centrifugare le cellule per farle sedimentare e risospendere il pellet in mezzo di crescita fresco integrato con il 50% di siero fetale bovino, alla concentrazione di 2,5 × 10⁵ cellule per 70 microlitri di mezzo. Successivamente, trasferire gli inserti della dimensione dei pori sperimentali appropriata dal loro imballaggio in singole pozzette di una piastra multi-pozzetta e coprire la piastra.Quindi, tenendo la piastra con entrambe le mani, capovolgere delicatamente la piastra finché le basi degli inserti non siano rivolte verso l'alto. Rimuovere la parte inferiore della piastra. Utilizzando pinze sterili con una mano, tenere fermo un inserto e con l'altra mano aspirare lentamente 70 microlitri di cellule in una punta di pipetta micrometrica.Quindi, distribuire lentamente le cellule sulla superficie di quella che ora è la parte superiore dell'inserzione. Dopo aver seminato ciascun inserto, reinserire con attenzione il fondo della piastra e incubare la piastra capovolta a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità per 30-45 minuti. Al termine dell'incubazione, all'interno di una cappa biologica a flusso laminare, capovolgere con cura la piastra in modo che i fondi degli inserti siano ora rivolti verso il basso.Quindi immergere lentamente e con attenzione la parte inferiore di ciascun inserto in due millilitri di mezzo completo preriscaldato e riposizionare la piastra nell'incubatore umidificato. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo nella parte inferiore di ogni pozzetto con due millilitri di mezzo di crescita fresco. Una volta rinnovato completamente il mezzo, seminare 2,5 × 10⁵ cellule della seconda popolazione di interesse sulla parte superiore degli inserti in un millilitro di mezzo fresco e reinserire la piastra nell'incubatore.24, 48 e 96 ore dopo, sostituire il mezzo nella parte superiore di ogni inserto con un millilitro di mezzo completo fresco e il mezzo nella parte inferiore di ogni pozzetto con due millilitri di mezzo completo fresco. Dopo 120 ore di cocoltura, trasferire un inserto alla volta in piatti individuali per coltura cellulare da 35 millimetri contenenti un millilitro di PBS.Sciacquare le superfici inferiori e superiori degli inserti con un millilitro di PBS. Per raccogliere le cellule cresciute sulla superficie inferiore dell'inserto, posizionare gli inserti con la parte inferiore rivolta verso il basso in 200 microlitri di tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Dopo due minuti a temperatura ambiente, arrestare la reazione aggiungendo 800 microlitri di mezzo di crescita completo.Quindi, tenendo l'inserto con un leggero angolo, pipettare delicatamente il soprannatante sulla superficie delle cellule per 10 volte, raccogliendo le cellule nella piastra. Una volta che tutti gli inserti sono stati svuotati, risospendere le cellule a una concentrazione di due per 10 alla quinta cellule per millilitro di mezzo di crescita. Aggiungere quindi 250 microlitri di cellule su ciascun vetrino di vetro sterile.Posizionare i coverslip nell'incubatrice umidificata per un'ora. Al termine dell'incubazione, all'interno di una cappa biologica a flusso laminare, aggiungere con attenzione due millilitri di mezzo di crescita completo nella piastra e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità per 48 ore. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS.Dopo il terzo lavaggio, fissare le cellule con formaldeide al 4% in PBS per dieci minuti a temperatura ambiente, seguito da cinque lavaggi con soluzione salina tamponata al Tris. Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,25% integrato con saponina allo 0,1% per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi procedere con l'incubazione in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, etichettare i campioni con l'anticorpo primario di interesse in soluzione di blocco a quattro gradi Celsius durante la notte.La mattina successiva, rimuovere l'anticorpo non legato eseguendo lavaggi di tre minuti con la soluzione di lavaggio, seguiti da un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente con l'anticorpo secondario appropriato in soluzione di blocco. Al termine dell'incubazione, lavare l'anticorpo secondario non legato come appena descritto e montare i coverslip su singoli vetrini utilizzando un mezzo di montaggio antifade contenente DAPI. Sigillare i bordi dei coverslip con smalto trasparente.Quindi osservare le cellule con un ingrandimento a immersione in olio di 63x su un microscopio invertito dotato di una sorgente luminosa esterna per l'eccitazione della fluorescenza. Questo sistema permette di coltivare due popolazioni cellulari diverse sui due lati delle membrane porose degli inserti per colture cellulari per almeno 120 ore, mantenendo una purezza superiore al 99% nelle popolazioni cellulari su ciascun lato della membrana, quando si utilizzano inserti con pori di 0,4 o di un micron. Tuttavia, i pori di tre micron sono abbastanza grandi da consentire alle cellule di migrare attraverso la membrana, come osservato in questo esperimento mediante una linea cellulare di carcinoma mammario umano positiva per GFP.Gli inserti con pori di 0,4 micron limitano anche la formazione di giunzioni comunicanti funzionali tra le colture cellulari su entrambi i lati dell'inserto, restringendo la comunicazione ai fattori secreti. Gli inserti con pori di uno e tre micron, tuttavia, permettono l'accoppiamento funzionale delle cellule attraverso le giunzioni comunicanti, come indicato dal trasferimento dell'etichetta fluorescente attraverso la membrana in queste colture in cocultura. In modo importante, questo sistema può essere utilizzato per generare in modo efficace fibroblasti associati al cancro a partire da fibroblasti diploidi umani normali dopo la loro cocoltura con cellule di carcinoma mammario, come dimostrato dalla ridotta espressione di caveolina-1 sui fibroblasti in cocultura con le cellule di carcinoma mammario umane.Nel corso di questa procedura, è importante selezionare inserti con una dimensione dei pori adeguata alla domanda in esame e osservare la prima popolazione cellulare sul lato inferiore dell'inserto in un mezzo che ne favorisca l'adesione. Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altre metodiche come immunoblotting, immunofluorescenza in situ o la maggior parte degli altri saggi cellulari per rispondere ad ulteriori quesiti riguardo le alterazioni nell'espressione proteica, i cambiamenti nell'invasione e nella migrazione o le differenze nelle risposte agli agenti terapeutici.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro e della biologia della radiazione per esplorare i fattori che contribuiscono allo sviluppo, all'evoluzione del microambiente tumorale e, nel nostro caso, alla diffusione degli effetti dannosi delle radiazioni ionizzanti dalle cellule bersaglio esposte alle radiazioni alle cellule vicine non direttamente colpite. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare una cocoltura cellulare mista, mantenere la cocoltura e raccogliere popolazioni cellulari arricchite ad alta purezza dalla cocoltura per ulteriori analisi. Non dimenticare che lavorare con ceppi o linee cellulari umane può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura si dovrebbe indossare l'adeguata protezione personale e rispettare le appropriate norme di biosicurezza.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione (Video) | JoVE Journal

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

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