Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle

Questo protocollo descrive una metodologia di bioprinting che utilizza un sistema di deposito robotico automatizzato che incorpora segnali di guida topografici incisi con la deposizione di precisione di una cella contenente idrogel bioink. Le celle stampate vengono consegnate direttamente alle caratteristiche incise e sono in grado di percepirle e orientarsi con esse.

L'obiettivo generale di questa tecnica di erogazione robotica automatizzata è quello di creare una superficie per la guida topografica delle celle e quindi fornire le celle a queste caratteristiche seguendo uno schema programmato, consentendo il controllo del comportamento e della distribuzione delle celle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria biomedica, come ad esempio come le topologie di superficie possono influenzare il comportamento cellulare, sia in monocoltura che in co-coltura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la programmazione e la stampa del modello di guida cellulare richiedono meno tempo rispetto ai metodi più consolidati.

Include anche la fase di erogazione delle celle per l'erogazione controllata. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che i modelli 2D di cellule depositate in idrogel potevano beneficiare della guida di superficie. Pertanto, abbiamo sviluppato questa tecnica per stampare idrogel in modo che corrispondesse alle caratteristiche della superficie.

Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di erogazione robotizzato assistito da contropressione come bioprinter basato sull'incisione superficiale e sull'estrusione. Per preparare una superficie in polistirolo per l'incisione e la stampa, selezionare un foglio di polistirene di un millimetro di spessore. Le lamiere più spesse si piegheranno di più.

Quindi, trattare il foglio con plasma di ossigeno. Impostare il regolatore dell'ossigeno gassoso su due bar. Quindi, accendi la macchina al plasma e accendi la pompa del vuoto.

Procedere alla programmazione della macchina per 150 watt e 30 centimetri cubi standard al minuto di flusso di ossigeno gassoso ed esporre il foglio a queste condizioni per 10 minuti. Quindi, evacuare la camera e sigillare la porta e avviare il ciclo. Successivamente, immergere il foglio trattato in puro siero fetale bovino e incubarlo a 37 gradi Celsius per due ore con agitazione.

Dopo il trattamento con il siero, lavare il foglio tre volte con 1X PBS e sterilizzare il foglio. Dopo il lavaggio finale, lasciare asciugare la sfoglia in forno a 37 gradi Celsius per una notte per circa 12 ore. Per prima cosa prepara uno stilo di stampa per l'incisione.

Con grande cura, inserire un ago tessile di 1,5 millimetri di diametro nell'ugello di una siringa di erogazione fino a quando non si incastra e si fissa. Quando si tenta per la prima volta di creare una disposizione biostampata, disegnare il modello desiderato su carta millimetrata con assi numerati per generare le coordinate x, y. Quindi inserisci le coordinate del modello in un foglio di calcolo.

Successivamente, nel software di stampa, selezionare Programma, Aggiungi programma, quindi Modifica, Aggiungi punto per stabilire il programma. Quindi, copia i valori delle coordinate x e y dal foglio di calcolo al software di erogazione della stampa. Prima di ogni corsa, calibrare l'altezza z del robot per impostare la posizione di contatto dello stilo.

Innanzitutto, seleziona l'opzione Robot. Quindi, fai clic su Modifica modalità e abilita l'opzione Modalità di insegnamento. Ciò abilita la funzione JOG del robot.

Per JOG il robot, prima metti il robot nella sua posizione predefinita selezionando Robot, Meca Initialize. Poi, Robot, JOG. Successivamente, negli slot x e y, inserisci la distanza in millimetri necessaria per posizionare lo stilo esattamente sull'origine del modello.

Quindi, sempre in millimetri, inserire un valore numerico nella fessura z per posizionare lo stilo o l'ugello a contatto con la superficie senza flettere o rientrare la superficie. Questo valore è indicato come valore iniziale di z. La profondità di ogni scanalatura può essere variata utilizzando l'altezza z.

Ad esempio, le scanalature tagliate potrebbero essere profonde 40, 80 o 170 micron. Ci vuole concentrazione e osservazione ravvicinata per trovare un punto di contatto tale che non ci siano flessioni dello stilo o rientranze evidenti sulla superficie. Per garantire il successo, si consiglia di preparare diversi fogli ed eseguire il programma a diverse altezze z per trovare la posizione di partenza ideale.

Il passaggio successivo consiste nel definire l'istruzione di stampa per ciascuno dei punti delle coordinate. Utilizzare l'erogazione di inizio riga per definire il primo punto e l'inizio della stampa. Utilizzare il passaggio di linea per designare i punti intermedi e, infine, utilizzare l'erogazione di fine linea per segnalare al robot di terminare la tiratura.

Per comunicare il programma al robot, selezionare Robot, Invia dati C&T. Quindi, avviare la corsa selezionando Robot, Modifica modalità, Cambia modalità di esecuzione e impostando l'impostazione su Esegui. Infine, avvia la stampa.

Per realizzare il bioink, sciogliere il 2% di gelatina in Alpha MEM integrata con il 10% di FBS e il 2% di antimicotico antibiotico. Posizionare il terreno a 60 gradi Celsius per due ore per consentire alla gelatina di sciogliersi nel mezzo. Coltiva le cellule per il bioink fino alla confluenza del 70% in piatti di 10 centimetri.

Possono essere utilizzate tutte le cellule che rispondono alle funzioni di guida della superficie e devono esprimere un'etichetta fluorescente in modo da poter essere viste durante il processo di inclusione. Rilasciare le cellule attaccate nella sospensione rimuovendo il terreno, lavando le cellule con PBS e rivestendo le cellule con una soluzione 1X Tripsina-EDTA per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver neutralizzato la tripsina con il terreno, raccogliere le cellule in una sospensione e pellettare a 1.000 g per cinque minuti.

Descrivere il surnatante e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di terreno. Dopo aver misurato la densità cellulare, mescolare la sospensione nella soluzione bioink raffreddata per ottenere una soluzione con cinque milioni di cellule per millimetro. Quindi, versare il bioink contenente cellule in una siringa di stampa preparata bloccata da un cappuccio per esche.

Raffreddare la siringa carica a quattro gradi Celsius per ottenere una viscosità stampabile. Quindi, estrarre la siringa caricata e raffreddata, rimuovere il cappuccio della siringa e collegare l'ugello di stampa. Quindi, collegare la siringa carica al sistema di erogazione e collegarla alle linee di pressione dell'aria.

Per stampare il bioink sul modello pre-progettato, i bordi e le linee devono essere distinti. La stampa precisa si ottiene infatti ottimizzando la contropressione dell'erogatore e del calibro dell'ago dell'ugello di stampa. Impostare la contropressione dell'erogatore a 0,05 megapascal per una siringa da 10 millilitri con ago conico calibro 34.

Quindi, nel software, impostare la velocità di scrittura a cinque millimetri al secondo su una superficie di pellicola di polistirolo. A questo punto, seguendo lo schema programmato, depositare il bioink cellularizzato sui solchi pre-mordenzati. Dopo aver depositato le cellule, lasciare incubare il foglio per 20 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, coprire l'impalcatura cellulare stampata con il terreno di coltura appropriato e incubare le cellule per 24 ore in modo che le cellule si attacchino prima di ulteriori esperimenti. Le cellule staminali seminate dalla bioprinting all'interno del bioink alla fine si sono sedimentate in superficie e rilevate e allungate lungo una direzione delle linee discretamente incise. Anche le cellule seminate in terreno di coltura senza bioprinting si sono allineate nella direzione delle caratteristiche.

Tuttavia, coprivano anche l'intera superficie, quindi il bioink vincolava le cellule alla traccia stampata. Quando sono state seminate su fogli senza le caratteristiche incise, le celle non hanno mostrato alcun orientamento o allineamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incidere con precisione le scanalature sul foglio di polistirene e quindi biostampare con precisione le celle nelle scanalature.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due o tre ore. È molto utile per i ricercatori nel campo della bioingegneria esporre le interazioni della superficie cellulare in modelli in cui è richiesta l'anisotropia e il posizionamento cellulare. Non dimenticare che il bioink contiene cellule vive ed è molto importante utilizzare una tecnica sterile quando si stampano i fogli.