Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

L'obiettivo generale di questa metodologia di bioprinting microfluidico è quello di generare un costrutto di tessuto vascolarizzato. Questo metodo può risolvere problemi chiave nella biofabbricazione di tessuti vascolarizzati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è versatile nel generare una vasca vascolare tridimensionale a forma controllata per l'ingegnerizzazione di tessuti vascolarizzati attraverso un processo di semina cellulare secondaria.

Sebbene questo protocollo fornisca informazioni sull'ingegnerizzazione dei tessuti cardiaci vascolarizzati, può essere applicato anche a molti altri tipi di tessuto come fegato, pelle e persino tumori. Le persone generiche che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché l'impostazione del bioprinter potrebbe non essere semplice. Per iniziare questa procedura, costruire una testina di stampa microfluidica concentrica a doppio strato inserendo un ago smussato più piccolo, che funge da nucleo, al centro dell'ago smussato più grande, che funge da guaina.

Assicurarsi che l'ago centrale sporga dal guscio esterno di circa un millimetro. Dopodiché inserire un ago calibro 23 nella canna dell'ago centrale nella direzione opposta. Fai un foro sul lato del fusto dell'ago esterno e inserisci un connettore metallico della stessa dimensione.

Sigillare con colla epossidica. Montare l'estrusore sulla testina di una biostampante, utilizzando un supporto in polimetilmetacrilato o PMMA. Successivamente, per l'iniezione del bioink e della soluzione reticolante attraverso due tubi in PVC singolarmente, collegare gli ingressi della testina di stampa a una pompa siringa a doppio canale.

Prepara il bioink usando una miscela di alginato, gelMA e fotoiniziatore. Disciolto in tampone HEPES da 25 millimolari, contenente il 10% di siero fetale bovino o FBS. Quindi preparare una soluzione di cloruro di calcio 0,3 molare in tampone HEPES contenente il 10% di FBS che funge da fluido trasportatore di reticolazione.

Subito prima del bioprinting, tripsinizzare le cellule endoteliali della vena ombelicale umana o HUVEC per 5-10 minuti. Centrifugare le celle a 800 giri/min per cinque minuti in una provetta da 15 millilitri. Risospendere le cellule nel bioink a una concentrazione da cinque a 10 volte da 10 a sei cellule per millilitro pipettando lentamente da cinque a 10 volte.

Successivamente, utilizzare una pompa a siringa a doppio canale per avviare l'iniezione del bioink HUVEC attraverso uno e del fluido reticolante attraverso l'altro canale a una velocità di flusso di cinque microlitri al minuto. Lasciare che i flussi scorrano continuamente per un massimo di un minuto fino a quando non si stabilizzano. Successivamente, avviare il movimento della testina di stampa mantenendo la velocità di deposizione della biostampante di circa quattro millimetri al secondo.

Questo bioprinting dovrebbe portare a una rapida gelificazione ionica del componente alginato e alla deposizione di un'impalcatura in microfibra. Dopo che l'impalcatura è stata stampata, reticolare fotograficamente il componente gelMA con 5-10 milliwatt per centimetro quadrato di luce UV per 20-30 secondi per ottenere la gelificazione chimica. Quindi rimuovere il cloruro di calcio in eccesso dall'impalcatura risciacquandolo delicatamente con PBS caldo a 37 gradi Celsius.

Coltiva questa impalcatura in un terreno di crescita delle cellule endoteliali a 37 gradi Celsius in una percentuale di CO2 del cinque in volume, per un massimo di 16 giorni. Cambiare il mezzo almeno ogni due giorni. Durante il periodo di coltura, monitorare gli HUVEC al microscopio fino a quando non migrano verso le periferie delle microfibre dell'impalcatura e formano strutture simili a lumi.

Quindi rimuovere con cautela l'intero mezzo dallo spazio intrastiziale dell'impalcatura con forza capillare utilizzando un pezzo di carta da filtro sterile. Aggiungere istantaneamente una goccia di sospensione di un tipo di cellula secondaria come i cardiomiociti sulla parte superiore dell'impalcatura, consentendo alle cellule di infiltrarsi nell'intero spazio intrastiziale. Dopodiché, incubare questa impalcatura in un'incubatrice per 30 minuti o due ore, consentendo alle cellule di aderire alle singole microfibre.

Rimuovere le cellule non aderenti lavando delicatamente l'impalcatura con PBS. Coltivare questa impalcatura in un terreno appropriato fino a formare il tessuto vascolarizzato desiderato. La biostampa microfluidica qui descritta, consente la biostampa diretta di scaffold microfibrosi utilizzando bioink a bassa viscosità.

Un'impalcatura di sei per sei per sei millimetri quadrati< contenente più di 30 microfibre, potrebbe essere biostampata in 10 minuti. Le micrografie delle micrografie dell'impalcatura mostrano l'eccellente integrità strutturale durante il processo di bioprinting. Si ottiene con l'immediata reticolazione ionica del componente alginato con cloruro di calcio.

Dopo l'estrusione microfluidica del bioink, la reticolazione ionica e la fotoreticolazione, gli HUVEC hanno mantenuto una vitalità relativamente elevata. Le cellule proliferavano e migravano dalla distribuzione inizialmente casuale al giorno zero, alle periferie delle microfibre al giorno 16. I cardiomiociti neonatali di ratto che sono stati seminati sull'impalcatura sono maturati e hanno popolato l'impalcatura.

Hanno mostrato una forte espressione di biomarcatori cardiaci funzionali. Come l'alfa actinina sarcomerica e la connessina 43. La microscopia confocale di uno scaffold microfibroso biostampato, popolato da cardiomiociti, ha rivelato la coesistenza sia di HUVEC che di cardiomiociti.

Gli HUVEC sono presenti principalmente nei confini delle microfibre, mentre i cardiomiociti circondano l'esterno delle microfibre. Le cellule sono state in grado di mantenere il loro battito spontaneo e sincronizzato per un massimo di 9-28 giorni. A seconda della fonte cellulare e della configurazione degli scaffold.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre tessuti vascolarizzati utilizzando la tecnica di bioprinting microfluidico, nonché la fabbricazione della testina di stampa e le operazioni di biostampa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fabbricazione della testina di stampa e le operazioni della biostampante possono essere complicate per le persone che non ne hanno mai utilizzata una prima. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di rendere concentrici i due aghi nella testina di stampa e lasciare che il flusso si stabilizzi prima di iniziare il bioprinting.

Con lo sviluppo di questa tecnica, i ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale e della biofabbricazione hanno ora un altro strumento abilitante per generare costrutti di tessuto vascolarizzato per scopi di rigenerazione in vivo o per modellare tessuti in vitro.