Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre
22 settembre 2015
Un bioprinter cartesiano è stato progettato e fabbricato per consentire la deposizione di più materiali in geometrie precise e riproducibili, consentendo anche il controllo dei fattori ambientali. Utilizzando il bioprinter tridimensionale, è possibile stampare e riprodurre facilmente costrutti complessi e fattibili.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare costrutti contenenti cellule vitali con una geometria complessa utilizzando una biostampante 3D. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando cellule staminali del tessuto adiposo umano dalla coltura. Successivamente, le cellule vengono mescolate con un bioinchiostro di alginato ossidato coniugato con RGD appena preparato.
Nell'ultimo passaggio, il LA cellulare nel biomateriale viene estruso mediante biostampa. Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per analizzare la vitalità, la proliferazione e la migrazione delle cellule biostampate. Il vantaggio principale di questo procedimento rispetto ai metodi esistenti, come la formazione di scaffold e il semina cellulare, è che con il nostro metodo è possibile posizionare direttamente le cellule e gli aggregati cellulari esattamente dove devono trovarsi per formare il tessuto.
La procedura di oggi sarà dimostrata da Sarah Grace Dennis, una studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare seminando 350.000 cellule stromali di tessuto adiposo umano in una fiasca T75 trattata con 15 millilitri di TMEM a basso contenuto di glucosio per l'espansione in un incubatore per colture cellulari. Quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza, rimuovere il mezzo e risciacquare le cellule con cinque millilitri di DPBS senza calcio e magnesio.
Quindi incubare le cellule in cinque millilitri di tripsina e DPBS per due minuti a 37 gradi Celsius; quando le cellule si sono staccate, arrestare la reazione enzimatica con tre millilitri di mezzo di coltura cellulare e trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in due millilitri di mezzo di coltura cellulare. Poi contare le cellule, trasferire un'aliquote di 1,3 × 10⁶ cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare nuovamente le cellule.
Sospendere il pellet in un millilitro di bioinchiostro appena preparato, avendo cura di distribuire in modo omogeneo le cellule in tutta la soluzione acquosa di alginato. Successivamente, caricare le cellule in una siringa sterile da tre millilitri compatibile con la stampante e avvitare una punta di plastica sterile da 22 gauge. Accendere ora la biostampante, ciascun computer del dispenser e il bagno a circolazione d'acqua.
Impostare manualmente la temperatura del bagno a quattro gradi Celsius per il meccanismo di azionamento e i parametri di stampa per ogni dispenser sul relativo computer del dispenser. Impostare il volume di erogazione a 230 nanolitri, il numero di passi indietro a zero e la velocità di erogazione a 10 microlitri al secondo. Quindi aprire il software di progettazione e il programma per visualizzare il display della telecamera USB sul computer.
Successivamente, inserire manualmente le coordinate per un reticolo di punti 5 per 5 con uno spazio di 2,4 millimetri tra le gocce. Salvare il programma e inviarlo al robot. Quindi posizionare una piastra di Petri contenente gelatina e biossido di titanio sul piatto della stampante a quattro gradi Celsius e chiudere e bloccare la porta della camera.
Utilizzando il controllore logico programmabile, attivare le sorgenti di luce ultravioletta per sterilizzare la camera. Dopo 90 secondi, aprire la camera e caricare la siringa contenente la sospensione di cellule stromali del tessuto adiposo umano nella pistola uno, chiudere e bloccare la porta della camera e utilizzare il controllore logico programmabile per accendere il sistema del ventilatore. Attendere 30 secondi affinché la pressione interna si equilibri, quindi eseguire il programma contenente il percorso geometrico e i parametri di stampa per tutta la durata del processo di stampa.
Guardare il display della telecamera USB sul computer per verificare una stampa accurata e uniforme. Per quantificare la vitalità delle strutture biostampate, immergerle in una soluzione colorante appena preparata. Successivamente, posizionare le strutture in frigorifero per 15 minuti al buio per permettere al colorante di fissarsi.
Quindi, utilizzando un'immagine al microscopio confocale, se le strutture colorate appaiono gialle o verdi, classificarle come cellule vive; se rosse, le cellule sono morte. Come dimostrano questi risultati, la biostampa consente il deposito di cellule e idrogeli in specifiche posizioni tridimensionali in modo preciso e ripetibile, grazie a un software computerizzato. Il software determina la posizione di ciascuna goccia e controlla numerosi parametri per l'erogazione.
Uno dei requisiti di una tecnica di bioprinting di successo è che le cellule rimangano vitali. Le cellule stampate con inchiostro bio di acido alginico, come appena dimostrato, sono state analizzate un'ora e otto giorni dopo la stampa: l'8% delle cellule appariva verde e vitale al giorno zero e il 95% al giorno otto. Come indica la colorazione rossa, poche cellule morte sono state osservate in entrambi i momenti temporali, confermando l'idoneità dell'inchiostro alternativo per il bioprinting.
Inoltre, l'inchiostro di alginato coniugato con RGD migliora l'adesione delle cellule alle strutture stampate, portando a una maggiore diffusione e proliferazione cellulare, come quantificato in tre aree distinte dell'idrogel al giorno zero e al giorno otto. In questo caso, la qualità della coniugazione del peptide RGD sull'inchiostro bioattivo ginnet è stata confrontata con l'utilizzo dell'inchiostro bioattivo ginnet da solo al giorno otto. La diffusione cellulare osservata nel campione colorato con ginnet coniugato con RGD ha indicato l'incorporazione riuscita del peptide nel ginnet, un fenomeno chiaramente assente nei campioni di biostampa non coniugati dopo lo sviluppo.
Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare la produzione additiva come mezzo per assemblare costrutti viventi ingegnerizzati.
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Panoramica
Questo studio presenta una procedura per la generazione di costrutti contenenti cellule vitali con geometrie complesse, utilizzando una bioprinter 3D. Il metodo prevede l'isolamento di cellule staminali del tessuto adiposo umano e la loro miscelazione con un bioinchiostro prima dell'estruzione attraverso la bioprinter.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biostampa
- Biologia cellulare
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- La biostampa 3D permette un posizionamento preciso delle cellule.
- I metodi tradizionali prevedono la formazione di impalcature e il seminamento cellulare.
- Il posizionamento diretto delle cellule può migliorare la formazione del tessuto.
- La microscopia confocale viene utilizzata per l'analisi della vitalità cellulare.
Scopo dello studio
- Creare costrutti complessi e vitali utilizzando una biostampante 3D.
- Migliorare la precisione del posizionamento cellulare nell'ingegneria tissutale.
- Analizzare il comportamento delle cellule biostampate dopo la stampa.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cellule staminali del tessuto adiposo umano.
- Preparazione di inchiostro biologico a base di alginato coniugato con RGD ossidato.
- Estensione di biomateriale caricato con cellule mediante biostampa.
- Analisi della vitalità, proliferazione e migrazione cellulare mediante microscopia confocale.
Risultati principali
- Generazione con successo di costrutti contenenti cellule vitali.
- Maggiore controllo sul posizionamento cellulare rispetto ai metodi tradizionali.
- Confermata vitalità e proliferazione delle cellule biostampate.
- La microscopia confocale ha confermato i modelli di migrazione cellulare.
Conclusioni
- La bioprinter 3D consente un posizionamento preciso e riproducibile delle cellule.
- Questo metodo potrebbe potenzialmente avanzare le applicazioni nell'ingegneria tissutale.
- Studi futuri potrebbero esplorare ulteriori applicazioni di questa tecnica di bioprinting.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo di biostampa consente una precisa organizzazione spaziale delle cellule all'interno di geometrie 3D complesse, affrontando una sfida fondamentale nell'ingegneria tissutale per la medicina rigenerativa e la modellizzazione delle malattie. Mantenendo un'elevata vitalità cellulare e sostenendo la proliferazione, l'approccio fornisce una piattaforma riproducibile per valutare candidati terapeutici in costrutti fisiologicamente rilevanti. Questa capacità supporta la validazione precoce dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici, permettendo il posizionamento diretto di agenti bioattivi in microambienti definiti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il deposito cellulari controllato nello spazio all'interno di architetture biomimetiche.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale degli obiettivi mantenendo la vitalità cellulare (>95% all'ottavo giorno) e la proliferazione nei costrutti stampati.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nell'interazione con l'obiettivo riproducendo un'organizzazione simile a quella del tessuto nativo per lo screening di composti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce costrutti standardizzati e vitali contenenti cellule, con output quantificabili mediante microscopia confocale per valutare vitalità, proliferazione e migrazione.
- Valore operativo: Consente la riproducibilità del saggio grazie a parametri di stampa controllabili e alla produzione assistita da progettazione computerizzata.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma per la valutazione di composti successivi mediante un posizionamento preciso delle gocce e un controllo ambientale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta la progressione dalla scoperta alla validazione preclinica mantenendo la funzionalità cellulare nell'inchiostro biologico a base di alginato coniugato con RGD.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Migliora l'affidabilità predittiva grazie all'adesione e alla diffusione cellulare potenziate mediante la coniugazione del peptide RGD.
- Sistema rilevante per la malattia: Genera costrutti tissutali biomimetici che riproducono da vicino l'organizzazione nativa della matrice extracellulare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto attivo, fornendo letture biologiche riproducibili e quantificabili in tessuti ingegnerizzati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi attraverso il posizionamento preciso di cellule e idrogeli in specifiche posizioni tridimensionali definite.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante la produzione standardizzata di costrutti e l’imaging confocale quantitativo del comportamento cellulare.
- Analisi: Consente l’analisi comparativa delle condizioni utilizzando parametri di vitalità, proliferazione e migrazione ottenuti da costrutti colorati.
- Ricerca traslazionale: Si collega al lavoro preclinico mantenendo la funzionalità cellulare nell’inchiostro biologico per oltre otto giorni dal termine della stampa.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per generare geometrie complesse in diversi progetti attraverso l’erogazione programmabile e il controllo software.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle interazioni cellula-ambiente.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante parametri di dispensazione controllati e ambiente sterile della camera.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale consentendo una valutazione precoce delle risposte cellulari in contesti simili al tessuto.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata rispetto al rischio, sostenuta da dati quantitativi sulla vitalità e sulla proliferazione che supportano i criteri di avanzamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento cellulare, nella preparazione dell'inchiostro biologico e nella microscopia confocale per la valutazione della vitalità.
- Dipende dall'hardware della biostampante, dai sistemi di siringhe sterili e dalle fasi di stampa a temperatura controllata.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i team per i disegni CAD, le velocità di dispensazione e i controlli ambientali.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la composizione dell'inchiostro biologico e la compatibilità del tipo cellulare con matrici a base di alginato.
- I limiti pratici comprendono il rischio di occlusione della punta e la necessità di protocolli di colorazione post-stampa per quantificare la vitalità.
