Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare costrutti vitali carichi di cellule con una geometria complessa utilizzando una biostampa 3D. Ciò si ottiene isolando prima le cellule stromali del tessuto adiposo umano dalla coltura. Successivamente, le cellule vengono miscelate con inchiostro bio di alginato coniugato RGD ossidato appena preparato.

Nella fase finale, la cellula LA in biomateriale viene estrusa tramite bioprinting. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per analizzare la vitalità, la proliferazione e la migrazione delle cellule biostampate. Il vantaggio principale di questa procedura rispetto alle procedure esistenti, come la formazione di impalcature e la semina cellulare, è che con la nostra procedura è possibile posizionare direttamente le cellule e gli aggregati cellulari esattamente dove devono essere per formare il tessuto.

A dimostrare la procedura oggi sarà Sarah Grace Dennis, una studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare seminando 350.000 cellule stromali di tessuto adiposo umano su un pallone T 75 trattato in 15 millilitri di TMEM a basso contenuto di glucosio per l'espansione in un incubatore di colture cellulari. Quando la coltura raggiunge l'80% di fluenza, rimuovere il terreno e sciacquare le cellule in cinque millilitri di DPBS senza calcio e magnesio.

Quindi incubare le cellule in cinque millilitri di tripsina e DPBS per due minuti a 37 gradi Celsius quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione enzimatica con tre millilitri di terreno di coltura cellulare e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Quindi, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in due millilitri di terreno di coltura cellulare. Quindi contare le cellule, trasferire 1,3 volte 10 delle sei aliquote cellulari in un tubo conico da 15 millilitri e far girare nuovamente le cellule.

Sospendi il pellet in un millilitro di inchiostro bio appena preparato, avendo cura di distribuire in modo omogeneo le cellule in tutta la soluzione acquosa di alginato. Quindi caricare le cellule in una siringa da tre millilitri compatibile con una stampante sterile e avvitare una punta di plastica sterile calibro 22. Ora accendi il bioprint, ciascuno dei computer dell'erogatore e il bagnomaria a ricircolo.

Impostare manualmente la temperatura del bagno a quattro gradi Celsius per il meccanismo di azione e i parametri di stampa per ciascun erogatore sul computer dell'erogatore correlato. Imposta il volume di erogazione a 230 nanolitri, il numero di passaggi all'indietro a zero e la velocità del dispensario a 10 microlitri al secondo. Quindi aprire il software di progettazione e il programma per visualizzare il display della fotocamera USB sul computer.

Quindi, inserisci manualmente le coordinate per una serie di punti cinque per cinque con 2,4 millimetri di spazio tra le gocce. Salva il programma e invia il programma al robot. Quindi posizionare una capsula di Petri contenente gelatina di biossido di titanio sul tavolino della stampante a quattro gradi Celsius e chiudere e bloccare lo sportello della camera.

Utilizzando il controller logico programmabile, inizializzate le sorgenti di luce ultravioletta per sterilizzare la camera. Dopo 90 secondi, aprire la camera e caricare la siringa contenente la sospensione di cellule stromali del tessuto adiposo umano nella pistola, chiudere e bloccare lo sportello della camera e utilizzare il controller logico programmabile per accendere il sistema di ventilazione. Attendere 30 secondi affinché la pressione interna si equilibri, quindi eseguire il programma contenente il percorso geometrico e i parametri di stampa durante tutto il processo di stampa.

Osservare il display della fotocamera USB sul computer per confermare una stampa accurata e uniforme. Per quantificare la vitalità dei costrutti biostampati, immergerli in una soluzione colorante appena preparata. Quindi mettere i costrutti in frigorifero per 15 minuti al buio per consentire alla macchia di fissarsi.

Quindi, utilizzando un'immagine al microscopio confocale, i costrutti colorati se le cellule appaiono gialle o verdi, le classificano come vive se rosse, le cellule sono morte. Come dimostrano questi risultati, il bioprinting facilita la deposizione di aiuti cellulari e idrogel in specifiche posizioni tridimensionali in modo accurato e coerente utilizzando un software computerizzato. Il software del computer determina il posizionamento di ciascuna gocciolina e controlla molti dei parametri per l'erogazione.

Uno dei requisiti di una tecnica di bioprinting di successo è che le cellule rimangano vitali Qui. Le cellule stampate con inchiostro alginico bio, come appena dimostrato, sono state analizzate un'ora e otto giorni dopo la stampa, con il 98% delle cellule che apparivano verdi e vitali il giorno zero e il 95% l'ottavo giorno. Come indica la colorazione rossa, sono state osservate poche cellule morte in entrambi i momenti, confermando l'idoneità dell'inchiostro alternativo per il bioprinting.

Inoltre, l'inchiostro di algina coniugato RGD migliora l'attaccamento delle cellule ai costrutti stampati, portando a una migliore diffusione e proliferazione cellulare, come quantificato in tre aree separate dell'idrogel su uno zero e un otto. Qui, un confronto della qualità della coniugazione del peptide RGD sull'inchiostro ginnet bio è stato confrontato con l'uso del solo inchiostro Ginnet bio l'ottavo giorno. La diffusione cellulare osservata nel campione colorato con gin coniugato RGD indicava la riuscita incorporazione del peptide sul ginnet, un fenomeno che era notevolmente assente nei campioni di bioprint non coniugati dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare la produzione additiva come mezzo per assemblare costrutti ingegnerizzati viventi.