Studio di vettori virali in un tridimensionale fegato Modello ripopolata con l'Umano carcinoma epatocellulare Linea cellulare HepG2

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare un modello epatico tridimensionale per studiare virus e vettori virali. Questo metodo consente lo studio dei processi biologici in un sistema tridimensionale vascolarizzato con cellule umane che differiscono nella loro fisiologia dalle cellule di roditori in un modello murino o ratto. Inoltre, si tratta di un passo avanti per migliorare il benessere degli animali in quanto evita esperimenti con animali vivi ed è, a lungo termine, destinato a sostituire completamente i componenti animali.

Sebbene abbiamo sviluppato questo metodo per studiare i vettori virali per il trasferimento genico, può essere applicato anche allo studio dei virus vitali infettivi e ad altre aree di ricerca come la ricerca sul cancro. A dimostrare la procedura sarà Viola Rohrs, un tecnico del mio laboratorio. Ai fini del benessere degli animali, per il presente studio sono stati utilizzati solo animali in eccedenza che sono stati sacrificati per altri esperimenti sugli animali, cioè

non sono stati necessari altri animali per ottenere gli scaffold epatici. Per iniziare, per prima cosa espandi la linea cellulare epatica Hep G2. Semina 15 milioni di cellule in flaconi T175 in 30 millilitri di terreno contenente il 10% di siero fetale di vitello e due millimoli di gulatmina, penicillina e streptomicina. Dopo quattro giorni di coltivazione, utilizzare cinque minuti di esposizione alla soluzione di tripsina in condizioni di coltura per allentare le cellule, quindi raccoglierle.

Quindi centrifugare le celle a 300 Gs per tre minuti. Quindi risospenderli in quattro millilitri di PBS e ottenere una conta cellulare. Ogni bottiglia dovrebbe produrre circa 45 milioni di cellule.

Sono necessari 600 milioni di cellule per ricellularizzare una ECM epatica di ratto. Per ricellularizzare la MEC, è necessario prima impostare il sistema del bioreattore contenente una camera di profusione epatica, un sistema di profusione, un serbatoio di terreno e una trappola a bolle. La procedura di ricellularizzazione è caratterizzata da due passaggi fondamentali.

Uno è quello di evitare di intrappolare bolle d'aria nel sistema di profusione. La seconda è che l'intero sistema deve essere mantenuto sterile. Innanzitutto, sterilizzare questi componenti del sistema del bioreattore a 121 gradi Celsius per 15 minuti.

In secondo luogo, riempire i tubi e la camera di profusione sterilizzata con il fluido. Quindi posizionare l'impalcatura di fegato di ratto decellularizzata nella camera di profusione epatica. Il passaggio successivo consiste nell'utilizzare clip per tubi per collegare la vena porta canulata al sistema di profusione.

Posizionare ora il sistema del bioreattore nell'incubatrice e collegarlo a una pompa peristaltica. Quindi, equilibrare l'impalcatura con 150 millilitri di terreno integrato per cinque giorni. Impostare il flusso su 1,25 millilitri al minuto.

Dopo cinque giorni, scollegare il sistema del bioreattore dalla pompa e trasferirlo in una cappa sterile. Scollegare l'impalcatura epatica dal circuito dei fluidi. Quindi caricare una siringa con cinque millilitri di terreno contenente 300 milioni di cellule Hep G2 e iniettare le cellule attraverso la vena porta, evitando la formazione di bolle d'aria.

Quindi lasciare che le cellule ripopolino l'ECM per un'ora senza far funzionare la pompa. Dopo un'ora, avviare la pompa a 1,25 millilitri al minuto. Dopo 10 minuti, aumentare la pressione a 2,5 millilitri al minuto.

Dopo altri 20 minuti, impostare la pompa sulla velocità di funzionamento di 3,75 millilitri al minuto. Dopo 30 minuti alla massima velocità della pompa, spegnere la pompa, aggiungere altri 300 milioni di cellule e lasciare che le cellule popolino la ECM per un'ora. Dopo un'ora, aumentare gradualmente la circolazione regolando gradualmente la velocità della pompa come prima.

Ora lascia che la coltura ricellularizzi il fegato per due settimane. A giorni alterni, sostituire 50 millilitri di terreno e misurare i parametri fisiologici da un campione del terreno utilizzato. La produzione di vettori AAV è una procedura complicata che coinvolge molti passaggi che sono riassunti nel protocollo di testo.

In questa sezione del video vengono illustrati alcuni dei passaggi cruciali. Innanzitutto, produrre, purificare e quantificare i vettori AAV. Produrre brevemente i vettori AAV in bottiglie a rullo e purificarli mediante centrifugazione con gradiente di iodixanolo.

Rimuovere lo iodixanolo residuo mediante filtrazione su colonne di filtrazione su gel PD10. Quindi determinare la concentrazione del vettore AAV mediante QPCR utilizzando il DNA genomico AAV come standard. Per modello sono necessari un totale di 27 trilioni di vettori AAV.

Ora trasduci il modello del fegato. Innanzitutto, ottieni 27 trilioni di vettori in cinque millilitri di PBS caricati in una siringa. Il rosso fenolo può essere aggiunto a 5 microgrammi per millilitro.

Quindi scollegare il fegato dal circuito multimediale e iniettare i vettori nel sistema. Una volta iniettato, incubare il sistema per un'ora senza pompare. Quindi aumentare gradualmente il flusso come descritto in precedenza.

Successivamente, quando il fegato trasdotto viene incubato per sei giorni, cambiare 50 millilitri del terreno a giorni alterni. Usando un bisturi, affetta campioni da ciascun lobo del fegato che sono spessi circa mezzo centimetro e lunghi da 1,5 a due centimetri. Incubare le fette in paraformaldeide al 4% con saccarosio al 4% per 90 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi lavare il campione tre volte con PBS per un minuto per lavaggio. Seguire i lavaggi incubando i campioni per una notte in saccarosio all'8% a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, caricare i campioni in criostampi contenenti un mezzo di fissaggio.

Evitare di introdurre bolle d'aria. Una volta caricati, coprire completamente i campioni con il mezzo di fissaggio e metterli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Una volta congelato, preparare criosezioni da 10 micron dai campioni utilizzando un criotomo.

Colorare i campioni secondo necessità per confermare la ricellularizzazione. Per l'analisi dell'espressione genica, prelevare campioni utilizzando un punzone bioptico da quattro millimetri. Per valutare la ricellularizzazione, le criosezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina.

I lobi di due fegati trasdotti e di un fegato di controllo che è stato ricellularizzato ma non trasdotto sono stati tutti ripopolati con cellule Hep G2. L'espressione dell'RNA e il titolo del vettore sono stati quantificati da 28 biopsie di punch da ciascun modello di fegato. Nei due modelli di fegato trasdotti, sono stati misurati 55 e 90 genomi vettori per cellula, che è un vettore sufficiente per indurre il silenziamento genico.

Nessun genoma è stato misurato nel controllo, come previsto. L'espressione di EmGFP è stata analizzata mediante RT-PCR e western blotting. La maggior parte delle biopsie ha mostrato l'espressione dell'mRNA di EmGFP e l'espressione proteica di EmGFP.

L'immunostanding delle criosezioni ha mostrato che, ovunque il modello fosse ricellularizzato con successo, si poteva vedere anche l'espressione di EmGFP. Questo è indicativo di una buona espressione del gene AAV. Successivamente, il knockdown mediato da AAV della ciclofilina B umana è stato analizzato mediante RT-PCR quantitativa.

Il knockdown medio della ciclofilina B umana è stato compreso tra il 70 e il 90% su tutti i lobi dei due fegati trasdotti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per studiare la distribuzione di virus e vettori virali nel sistema di organi vascolarizzato e tridimensionale. Tali studi contribuiranno a migliorare le attuali tecniche di trasferimento genico e a sviluppare nuove strategie antivirali.