Un protocollo per l'analisi dell'epatite C replicazione del virus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le varie fasi del ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. Ciò si ottiene generando prima l'RNA genomico dell'HCV, trascritti da costrutti plasmidici HCV linearizzati. Il secondo passo consiste nel trasfettare le cellule con H-C-V-R-N-A.

Successivamente, le cellule vengono piastrate per vari punti temporali e saggi. Il passaggio finale consiste nel raccogliere il surnatante della coltura cellulare per misurare il titolo virale e raccogliere le cellule trasfettate per proteine e RNA. Infine, vengono eseguite la trascrizione inversa, la PCR, il saggio di immunofluorescenza Western blotting e il titolo HCV e dimostrano un robusto sistema di coltura cellulare infettiva per HCV.

Il vantaggio principale di questo sistema di coltura cellulare del virus dell'epatite C infettivo rispetto al sistema replicante dell'HCV è che è possibile studiare l'ingresso virale, l'assemblaggio del vione e le fasi di uscita. Questo protocollo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della virologia dell'epatite C, come Vion, morfogenesi e interazione ospite-patogeno. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di vaccini in quanto consente la caratterizzazione di ceppi virali attenuati che possono essere valutati come potenziali candidati vaccini.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul virus dell'epatite C, può essere applicato anche ad altri virus a RNA della famiglia di lab verde. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo dovranno affrontare la sfida di generare uno studio genomico dell'RNA dell'HCV di alta qualità. Il ciclo completo di replicazione dell'HCV è diventato fattibile in coltura cellulare in seguito alla scoperta di un isolato di epatite uno fulminante giapponese di genotipo A.

La dimostrazione visiva del test virologico è fondamentale perché il test richiederà competenze in tecniche molecolari e cellulari utilizzando un virus chimerico A intra genotipo due, F-N-X-H-C-V e F-N-X-H-C-V poll null HCV per la valutazione della replicazione virale. Linearizzare plasmidi virali precedentemente generati mediante digestione con un enzima di restrizione XBA in una provetta da due millilitri. Quindi trattare i plasmidi con nucleasi di fagiolo mung per generare estremità smussate.

Purificare i plasmidi digeriti mediante cromatografia a scambio anionico. Verificare l'integrità del plasmide linearizzato sottoponendo il DNA all'elettroforesi su gel AROS. Successivamente, aggiungere il modello di DNA plasmidico linearizzato in una provetta da 0,2 millilitri contenente sette componenti della reazione dell'RNA polimerasi T per sintetizzare i trascritti dell'RNA genomico dell'HCV.

Purificare l'RNA trattato con DNA appena sintetizzato utilizzando un kit di purificazione dell'RNA. Quindi verificare la produzione di RNA mediante elettroforesi su gel Agros. Successivamente, quantificare l'RNA mediante fotometria spettrale.

Staccare le sette cellule aderenti HU utilizzando il trattamento enzimatico con tripsina e raccogliere le cellule in una conica da 50 millilitri. Due successivi risur di centrifugazione. Sospendere il pellet cellulare con terreno freddo a basso contenuto di siero Dopo aver ripetuto la centrifugazione, risospendere le cellule in terreno a basso contenuto di siero una volta da 10 a sette cellule per millilitro.

Successivamente, mescolare un totale di 10 microgrammi di RNA virale trascritto con 400 microlitri di cellule risospese in un veterinario di elettroporazione pre-raffreddato da 0,4 centimetri per erogare l'RNA virale nelle cellule utilizzando un'elettroporazione a 270 volt, 100 ohm e 950 micro ferri. Al termine, risospendere le celle elettroporate in 10 millilitri di terreno di coltura completo con il 15% di FBS a questo punto, placcare le cellule in entrambi i flaconi T 25 a circa 1,2 volte 10 per le sei celle per pallone e le piastre a 48 pozzetti in una volta 10 alle quarte celle per pozzetto per 4 punti temporali da 48 e 96 ore. Sostituire il terreno da quattro a otto ore dopo la trasfezione con un terreno di coltura fresco integrato con il 10% di FBS per rimuovere i detriti di cellule morte dai flaconi e dalle piastre in coltura.

Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere i surnatanti della coltura cellulare ai punti temporali di 48 N 96 ore in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi rimuovere i detriti cellulari dai campioni raccolti mediante centrifugazione a 15.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione. Conservare i surnatanti privi di cellule a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Licare le cellule per l'analisi di proteine e RNA mediante western blot e PCR quantitativa a trascrizione inversa o R-T-Q-P-C-R nei punti temporali indicati. Trascrivere inversamente un microgrammo di RNA cellulare totale utilizzando l'enzima trascrittasi inversa e un primer specifico per il filamento di senso dell'HCV che si lega alla regione dei cinque primi non tradotti in un tubo da 0,2 millilitri. Trascrivi anche F-N-X-H-C-V-R-N-A di copie note del genoma utilizzando un primer di rilevamento HCV utilizzando un sistema di PCR in tempo reale.

Eseguire la QPCR utilizzando 50 nanogrammi del CD NA trascritto risultante utilizzando primer specifici per l'HCV e colorante verde legante il DNA contenente QPCR super mix. Utilizzare le seguenti condizioni durante l'esecuzione della QPCR per determinare il numero di copie H-C-V-R-N-A dopo la QPCR. Risolvere il lisato cellulare dall'RNA virale trasfettato a 96 ore.

Pubblica la trasfezione utilizzando la pagina SDS. Quindi trasferire le proteine risolte nel gel su una membrana di fluoruro di vite mediante il metodo trans plot turbo. Bloccare la membrana utilizzando una soluzione bloccante contenente il 5% di latte scremato e lo 0,2% di PTS e porre in un contenitore.

Incubare la membrana con l'anticorpo monoclonale primario di topo e S3 a una diluizione di una su 1000 e la beta actina a una diluizione di una su 5.000 in una cella frigorifera di quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere l'immunoglobulina G di capra anti topo coniugata alla perossidasi di rafano a una diluizione di uno su 5.000 e rilevare mediante chemiluminescenza. A questo punto, fissare le cellule trasfettate H-C-V-R-N-A utilizzando metanolo per 30 minuti a 20 gradi Celsius negativi per il test di immunofluorescenza.

Al termine, lavare le cellule con PB S3 volte dopo il blocco con il tampone bloccante il test di immunofluorescenza, utilizzare un anticorpo primario anti-NS di coniglio cinque e un anticorpo monoclonale di topo anti DS RNA J due a una diluizione da uno a 200 e incubare per cinque ore fino a una notte in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con PB S3 volte dopo l'anticorpo primario. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario policlonale di capra anti coniglio G 4 8 8 e l'anticorpo secondario policlonale di capra anti muse 5 9 4 a una diluizione su 1000 e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un dondolo da tavolo.

Dopo aver lavato le cellule con PB S3 volte, colorare i nuclei utilizzando herx die e visualizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza. Successiva tonalità naïve alla piastra, 7,5 0,1 celle a circa tre volte 10 fino alla terza cella per pozzetto. Utilizzando una piastra da 96 pozzetti il giorno successivo, eseguire una diluizione seriale di dieci volte del surnatante di coltura privo di cellule raccolto da cellule trasfettate H-C-V-R-N-A utilizzando terreni di crescita e inoculare in triplicato sulla tonalità.

7,5 0,1 cellule Fissare le cellule a 72 ore dopo l'infezione utilizzando metanolo per 30 minuti a 20 gradi Celsius negativi dopo aver rimosso le cellule dal congelatore Colorazione amminica per la proteina H-C-V-N-S cinque A utilizzando le condizioni precedentemente descritte utilizzando un microscopio a fluorescenza. Conta i focolai cellulari NS cinque, A positivi nel pozzetto con la più alta diluizione virale e calcola il numero medio di unità di formazione del fuoco per millilitro. La qualità del plasmide HCV linearizzato è stata valutata mediante elettroforesi su gel.

L'H-C-V-D-N-A è stato sottoposto a trascrizione in vitro mediata da T sette RNA polimerasi, che ha prodotto un singolo prodotto di RNA a 9,6 Kilobasi. I risultati hanno indicato che il virus wild type ha replicato il genoma in modo efficiente. Il wild type ha mostrato un livello di replicazione del genoma da uno a tre log più alto rispetto al virus null poll.

Il virus wild type ha prodotto la proteina NS 3 coinvolta nella scissione delle proteine virali e nella replicazione del genoma. Il virus wild type esprimeva anche la proteina NS five a e la proteina NS five a e l'RNA a doppio filamento colocalizzato nel citoplasma cellulare di cellule trasfettate wild type, suggerendo che le misurazioni del titolo del virus di replicazione virale attiva indicavano che il virus wild type è infettivo e produce oltre 10.000 focolai che formano unità per millilitro di particella infettiva a sei ore dopo la trasfezione. Sia i virus wild type che quelli pole null avevano attività luciferasiche simili, indicando un livello di input simile di trasfettazione.

L'RNA era stato tradotto, tuttavia, a 48 ore e 96 ore dopo la trasfezione. Il virus wild type ha mostrato livelli di replicazione del genoma aumentati rispetto al virus poll null. Il virus wild type ha anche prodotto la proteina virale NS tre.

Il virus poll null aveva un'attività di luciferasi di livello base, mentre il virus wild type aveva un livello di replicazione da due a tre log superiore rispetto al virus poll null reporter. Una volta padroneggiati, i test virologici per l'epatite TC possono essere eseguiti in due settimane se eseguiti correttamente Durante il tentativo di questa procedura, è importante disporre di cellule robuste e trascritti di RNA genomico HCV di alta qualità. Seguendo questa procedura, i ceppi di HCV possono essere testati in sistemi modello animale per studiare la fitness in vivo e le interazioni tra patogeni e ospite.

Lo sviluppo di un sistema infettivo di coltura cellulare per l'HCV ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare il virione, la morfogenesi e le fasi di uscita virale del ciclo di replicazione dell'HCV. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire vari test virologici per caratterizzare le diverse fasi del ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite C può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati, come indossare dispositivi di protezione individuale.