Name: Un protocollo per lanalisi dellepatite C replicazione del virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Impara a generare RNA genomico HCV e a trasfettare cellule per studiare il ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. Questo protocollo consente di analizzare l'ingresso virale, l'assemblaggio e l'uscita.

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Ringraziamo F. Chisari per aver fornito la linea cellulare Huh-7.5.1. Ringraziamo Justine Ho per l'editing del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award e dal National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

Uno schema generale del protocollo è illustrato in Figura 1. 1. Cellule <ol><li> Preparare mezzi di crescita completo che contiene il 10-15% di siero bovino fetale (FBS), 10 mM aminoacidi non essenziali, Hepes 10 mM, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml), e 2 mM L-glutammina. </li><li> Mantenere Huh-7.5.1 celle 13 in mezzi di crescita completi contenenti i supplementi di cui sopra per l&#39;analisi in vitro di epatite C ciclo di replicazione virale. </li><li> Cultura ceppi virali in Huh-7.5.1 celle con i mezzi di crescita integrata specificato a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 2. Virus e plasmidi costrutti <ol><li> Generare la forma complementare DNA (cDNA) di HCV RNA e clonare in un vettore plasmidico per facilità di manipolazione genetica. Nota: La scoperta del giapponese epatite fulminante 1, JFH-1 (genotipo HCV 2 bis), isolare è stato fondamentale per la ricerca HCV ed èutilizzato principalmente per studiare il ciclo 11-13 replicazione di HCV. Virus chimerici-Inter e intragenotypic basato su JFH-1 HCV sono comunemente utilizzati nella ricerca 14-18. Costruzione di intragenotype sintetico 2a virus chimerico, FNX-HCV, e un monocistronic ceppo giornalista chimerico è stato descritto in precedenza i 19 ei dettagli costruttivi sono oltre la portata di questo protocollo. </li><li> Utilizzare il pFNX-HCV virus intragenotype 2a in quanto contiene un 5&#39;NTR, regioni strutturali e p7, e parte delle regioni non strutturali NS2 (nucleotidi 1-2878) del ceppo parentale J6CF (NCBI adesione n. AF177036), come nonché i componenti non strutturali del JFH-1 ceppo virale (NCBI adesione n. AB047639). Nota: FNX-HCV è stato sintetizzato basandosi sulla sequenza di Jc1 intragenotype 2a HCV chimerico riferito in precedenza 15. </li><li> Generare un costrutto chimerico monocistronic giornalista virale, la pFNX-Rluc, basato sul ceppo pFNX-HCV (sopra al punto 2.2) inserendo un Renilla gene luciferasi tra il 5 &#39;NTR e gene nucleo (nt tra 388 e 389). Successivamente, collegare il gene della luciferasi e nucleo gene di questo costrutto utilizzando un 2A virus dell&#39;afta epizootica (F2A) sequenza peptidica, che funzioni come un segnale di scissione. </li><li> Ingegnere il costrutto virale RNA polimerasi-null (Pol-) utilizzando il pFNX-HCV o lo sfondo virale pFNX-Rluc. Sostituire i residui catalitici NS5B polimerasi, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), di una di queste dorsali virali con residui di acido AAG amino. </li></ol> 3. In Vitro HCV RNA Trascrizione <ol><li> Utilizzare un intragenotype 2a virus chimerico FNX-HCV e FNX-HCV Pol null (Pol-) HCV per la valutazione della replicazione virale (Figura 2A). </li><li> Linearizzare i plasmidi virali con XbaI enzima di restrizione e poi trattare con mung bean nucleasi per generare estremità smussata. Purificare i plasmidi digeriti mediante cromatografia a scambio anionico. Verificare l&#39;integrità of plasmide linearizzato sottoponendo DNA per elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2B). </li><li> Trascrivere i plasmidi virali linearizzate utilizzando la polimerasi T7-RNA. </li><li> Purificare il RNA DNasi trattati nuova sintesi utilizzando un kit di purificazione dell&#39;RNA. </li><li> Verificare la produzione di RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2C). </li><li> Quantificare l&#39;RNA per spettrofotometria. </li><li> Conservare il RNA generati in -80 ° C in aliquote di 10 mcg lavorativi. Nota: Per ridurre al minimo la variazione di qualità RNA in ciascun disegno sperimentale trascrivendo tutto RNA per ogni campione e controllo virale allo stesso tempo. </li></ol> 4. HCV RNA Transfezione e raccolta dei campioni <ol><li> Raccogliere le cellule Huh-7.5.1 utilizzando tripsina. </li><li> Per lavare le celle, centrifugare e risospendere la sospensione per due volte con il freddo i media siero basso. Risospendere le cellule in mezzi siero partire a 1 x 10 7 cellule per ml. </li><li> Mescolare un totale di 10 &amp; #956; g di RNA virale trascritto con 400 microlitri di cellule risospese (4 x 10 6 cellule) in 0,4-cm elettroporazione cuvetta. Transfettare le cellule tramite elettroporazione a 270 V, 100 Ω e 950 uF. </li><li> Risospendere le cellule elettroporate in 10 ml di media crescita completa con il 15% FBS. Nota: Aumento di sopravvivenza delle cellule elettroporate si vede quando le cellule Huh-7.5.1 sono state coltivate in 15% di siero fetale bovino. </li><li> Piastra le cellule in entrambe T-25 palloni (~ 1,2 x 10 6 cellule per pallone) e piastre a 48 pozzetti (1 x 10 4 cellule per pozzetto) per ciascuno dei seguenti punti temporali: 4, 48 e 96 ore. </li><li> Sostituire i media a 4-8 ore post-trasfezione con fresca mezzi di crescita supplementato con 10% FBS per rimuovere i detriti cellulari morti palloni in coltura e piatti. </li><li> Surnatanti di coltura cellulare Harvest ai 48, 96 punti di tempo hr e rimuovere detriti cellulari da campioni raccolti mediante centrifugazione di cellule a 1.500 rpm per 10 minuti a 4 º C. </li><li> Conservare il surnatante cell-free a -80 ° C. Lisare le cellule per l&#39;analisi delle proteine ​​e RNA da Western blot e trascrizione inversa-PCR quantitativa nei punti all&#39;ora indicata. </li></ol> 5. Trascrizione inversa-PCR quantitativa (RT-qPCR) per la valutazione delle copie HCV Genome <ol><li> Eseguire un due fasi RT-qPCR per determinare il numero di copie di RNA genomico di HCV. </li><li> Trascrivere Reverse 1 mg di RNA cellulare totale utilizzando la trascrittasi inversa e un primer specifico per HCV senso filo che lega 5&#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) o un primer specifico per il gene housekeeping peptidylprolyl isomerasi G (ppig R : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). Anche invertire trascrivere FNX-HCV RNA (generato nel passaggio 3) di copie del genoma noti (10 gennaio - 10 settembre di serie) utilizzando senso HCV filamento primer. </li><li> Effettuare qPCR utilizzando 50 ng del risultante cDNA trascritto utilizzando specifici primer HCV (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) e il legame al DNA colorante verde contenente qPCR eccellente mix. Eseguire qPCR per le pulizie gene ppig così (primer ppig F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; ppig R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Nota: Per il calcolo esatto livello intracellulare di RNA di HCV di tutti i campioni, usare cellulari gene housekeeping, ppig , livello di espressione (ciclo Ct) per la normalizzazione. Utilizzare il numero di copie del genoma FNX-HCV come standard per la determinazione del numero di copie. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni durante l&#39;esecuzione qPCR per la determinazione del numero di copie di HCV RNA: 95 º C per 15 sec e 60 &#160; ° C per 30 sec (40 cicli) utilizzando il sistema di PCR in tempo reale. </li><li> Vedere le Figure 3A e 3B per i risultati replicazione del genoma. </li></ol> 6. Western Blotting analisi per il rilevamento di HCV Protein Expression (Figura 3C) <ol><li> Utilizzare lisati cellulari frRNA virale om transfettata a 96 ore dopo la trasfezione di proteine ​​western blotting. </li><li> Risolvere il lisato cellulare mediante SDS-PAGE e trasferimento a polivinilidene (PVDF) membrana. </li><li> Bloccare la membrana con una soluzione bloccante contenente latte scremato 5%, 0,2% Tween 20 in tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo monoclonale di topo primario NS3 (1 in 1.000 diluizione) e beta-actina (1 in 5.000 diluizione). </li><li> Aggiungi IgG di capra anti-topo coniugata con perossidasi di rafano (1 in 5.000 diluizione) e rilevare da chemiluminescenza. </li></ol> 7. Immunofluorescenza Assay (IFA) <ol><li> Fissare le cellule con infezione da HCV e trasfettate con metanolo per 30 minuti a -20 ° C per l&#39;analisi di immunofluorescenza. </li><li> Lavare le cellule con PBS per tre volte e bloccare con IFA tampone di bloccaggio. </li><li> Utilizzare policlonale di coniglio anti-NS5A principalmente anticorpo (gentilmente fornito dal Dr. Dasgupta, UCLA) o il mouse monoclonale anti-DSRNA anticorpo J2 alla diluizione 1:200 (1 mg / ml) e incubare per 5 ore a tutta la notte a 4 º C. </li><li> Lavare le cellule con PBS per tre volte dopo l&#39;anticorpo primario. </li><li> Aggiungere goat anti-rabbit IgG-488 policlonale anticorpo secondario o di capra anti-topo IgG-594 anticorpo secondario policlonale ad una diluizione 1:1000 (1 mg / ml) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS per tre volte e nuclei macchia con Hoechst colorante e vista utilizzando microscopio a fluorescenza (Figura 3D). </li></ol> 8. Virus misura Titer <ol><li> Piatto ingenui Huh-7.5.1 cellule a circa 3 x 10 3 cellule / pozzetto utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Il giorno successivo, eseguire diluizioni seriali di 10 volte del cell-free cultura surnatante raccolto da RNA transfettate cellule HCV utilizzo dei supporti di crescita e di inoculare in triplice copia su Huh-7.5.1 cellule. </li><li> Fissare le cellule a 72 ore dopo l&#39;infezione con metanolo (per 30 minuti a -20 </sup&gt; º C) e immunostain per HCV proteine ​​NS5A come indicato nella sezione 7. </li><li> Usare la massima diluizione di contare per i fuochi positivo NS5A e calcolare il numero medio di messa a fuoco unità di formazione (FFU) per millilitro. Vedere Figura 4 per HCV titolo. </li></ol> 9. Renilla Luciferase Reporter Assay per Viral Genome Replica e Infettività <ol><li> Per valutare la replicazione del genoma virale, piastra HCV RNA-elettroporato Huh-7.5.1 cellule in triplice copia in piastre 48 pozzetti (1 x 10 4 cellule / pozzetto). </li><li> Lisare le cellule con 75 ml di tampone di lisi passiva al 6 ore, 48 ore e 96 ore dopo la trasfezione. </li><li> Oscillare delicatamente le piastre per 15 minuti a temperatura ambiente e conservare a -80 ° C. </li><li> Per misurare l&#39;attività enzimatica Renilla luciferasi, scongelare il lisato proteico e Renilla luciferasi i reagenti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20 ml di lisato proteico per pozzetto di una 96-wel<html> l piatto luminescenza bianca e mettere il piatto in un luminometro. </li><li> Dispensare 100 ml di Renilla luciferasi di reagenti del dosaggio (coelenterazina substrato + tampone) per bene e dopo un ritardo di 2 secondi di pre-lettura; integrare la luce emessa per 10 sec. </li><li> Calcolare la media e la deviazione standard per ciascun campione dai valori di luciferasi triplicato biologici e sottoporre i dati per l&#39;analisi statistica (Figura 5). </li><li> Per valutare l&#39;infettività, inoculare 500 ml di surnatante cell-free ottenuti da cellule RNA-HCV transfettate per i punti temporali indicati (48 ore e 96 ore) in triplice copia su naïve Huh-7.5.1 cellule in piastre 48 pozzetti. </li><li> Sostituire l&#39;inoculo virale con 500 ml di mezzo fresco per bene dopo 6 ore dopo l&#39;infezione. </li><li> Lisare le cellule a 48 ore dopo l&#39;infezione e sono soggetti a Renilla saggio luciferasi come descritto nei passaggi 8,2-8,7 (Figura 5). </li></ol>DENOMINAZIONE &quot;&gt; 10. Analisi statistica <ol><li> Le barre di errore nei grafici indicano deviazioni standard (SD). I valori di P sono stati calcolati con il test t spaiato. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa illustrazione descrive un metodo per analizzare il ciclo di replicazione del virus dell&#39;epatite C. HCV è un agente patogeno umano e il protocollo sulla biosicurezza prescritta dovrà essere seguite scrupolosamente. Sistemi di coltura di cellule HCV infettive sono state descritte in precedenza 11-13,16,17. Ci sono alcuni punti cruciali attuiamo quando seguendo il protocollo illustrato. In primo luogo, è di grande importanza per avere una buona qualità di intatta tutta la lunghezza RNA genomico virale...

Virus dell&#39;epatite C (HCV) causa cirrosi e cancro del fegato. Essa colpisce 170 milioni di persone in tutto il mondo con 350.000 persone muoiono ogni anno 1-3. HCV è un virus a RNA filamento positivo con un genoma di 9,6 kb. Il genoma di HCV è tradotto come singola poliproteina di ~ 3000 residui amminoacidici che viene scissione proteolitica da varie proteasi cellulari e virali in 10 polipeptidi. HCV è il virus prototipo in genere Hepacivirus e appartiene alla famiglia Flaviviridae 4. Dopo l&#39;esposizione, HCV stabilisce infezione cronica nel 80% degli individui. L&#39;infezione è prevalentemente asintomatica e tempestiva diagnosi può consentire l&#39;intervento terapeutico per prevenire il deterioramento del fegato. Il trattamento attuale è ottimale e nessun vaccino è disponibile 5,6. L&#39;eziologia di epatite C è stata descritta per la prima nel 1989 7. Studiare la replica di HCV è importante per il vaccino contro l&#39;epatite C e la ricerca del trattamento, ma era statolungo ostacolata dalla mancanza di un efficiente sistema di coltura virale. Un clone molecolare di HCV ha dimostrato di essere contagiosa negli scimpanzé su inoculazione intraepatica 8. Successivamente, sono stati descritti repliconi HCV sub-genomici, che ha permesso di sezionare la fase di replicazione del genoma virale in un sistema di coltura cellulare 9,10. Scoperta di un HCV genotipo 2a isolare JFH-1 (Giapponese epatite fulminante-1), in grado di infettare colture cellulari ha aperto nuove strade per la ricerca replicazione di HCV 11-13. Ceppo genotipo 2a JFH-1 sistemi di coltura infettive basati basati virus chimerici inter-e intra-genotipiche e genotipo 1 HCV sono disponibili pure 14-18. Abbiamo utilizzato con successo JFH-1 ceppo e HCV intragenotype 2a virus chimerico avere la ad alta risoluzione profili funzionali mappa di domini di proteine ​​e cis-acting elementi RNA 19,20. In base a questo, qui si descrive un sistema efficace cultura utilizzato di routine che permettestudiando varie fasi del ciclo di replicazione di HCV e l&#39;interazione ospite-patogeno. Vi presentiamo saggi virologici per valutare la replicazione del genoma virale e infettività de novo di intragenotype 2a HCV e un giornalista HCV basata Renilla luciferasi.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacido non essenziale</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero ridotto Medium, senza fenolo rosso</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>Lo Scripps Research Institute</td><td></td><td>La linea cellulare è stata gentilmente fornita dal Dr. Francis Chisari al Dr. Arumugaswami nell'ambito dell'MTA eseguito tra lo Scripps Research Institute e il Cedars-Sinai Medical Center</td></tr><tr><td>Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc e pFNX-Rluc Pol null).</td><td>Cedars-Sinai Medical Center</td><td></td><td>I plasmidi HCV sono stati sintetizzati dal Dr. Arumugaswami utilizzando oligonucleotidi sovrapposti.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Fagiolo verde nucleasi</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Sistema di produzione di RNA su larga scala</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-dsRNA di topo J2&nbsp;</td><td>Italiano & Consulenza Scientifica Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Pacchetto membrana PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker Latte secco scremato</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo NS3 contro il virus dell'epatite C [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo NS3 contro il virus dell'epatite C [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra coniugate con perossidasi di rafano (HRP)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per il rilevamento di blotting occidentale Amersham ECL Prime&nbsp;</td><td>GE Healthcare Scienze della vita</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di PCR in tempo reale ViiA 7</td><td>Life Technologies</td><td>Kit</td> del sistema di test della luciferasi NA <td></td></tr><tr><td>Renilla Promega</td><td></td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>DNase senza RNasi</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento GloMax-Multi (luminometro)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo per l&#39;analisi dell&#39;epatite c replicazione del virus

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Virus dell&#39;epatite C (HCV) colpisce il 3% della popolazione mondiale e provoca gravi disturbi epatici, tra cui epatite cronica, cirrosi e carcinoma epatocellulare. HCV è un virus a RNA enveloped appartenente alla famiglia Flaviviridae. Terapia attuale non è pienamente efficace e provoca effetti collaterali negativi. Non esiste un vaccino HCV disponibili. Pertanto, è necessaria continuato sforzo per sviluppare un vaccino e migliore terapia. Un sistema di coltura cellulare HCV è fondamentale per studiare varie fasi di crescita HCV tra cui l&#39;ingresso del virus, la replicazione del genoma, imballaggio e uscita. Nella procedura attuale presentata, abbiamo utilizzato un virus wild-type intragenotype 2a chimerico, FNX-HCV, e un virus ricombinante FNX-Rluc portando un Renilla luciferasi gene reporter per studiare la replicazione del virus. Una linea di cellule di epatoma umano (Huh-7 riferiscono) è stato utilizzato per la trasfezione in vitro di trascritti HCV RNA genomici. Surnatanti di coltura privi di cellule, lisati proteici e tRNA otale sono state raccolte in vari momenti punti post-trasfezione per valutare la crescita HCV. HCV stato replicazione del genoma è stata valutata mediante RT-PCR e visualizzando la presenza di HCV RNA a doppio filamento. L&#39;espressione della proteina di HCV è stata verificata da blot e immunofluorescenza saggi occidentali utilizzando anticorpi specifici per le proteine ​​HCV NS3 e NS5A. Cellule trasfettate HCV RNA rilasciate particelle infettive nella cultura surnatante e il titolo virale è stato misurato. Saggi di luciferasi sono stati utilizzati per valutare il livello di replicazione e infettività di HCV giornalista. In conclusione, vi presentiamo vari saggi virologici per la caratterizzazione delle diverse fasi del ciclo di replicazione di HCV.

Il virus dell&#39;epatite C è un virus a RNA. Così per scopo di manipolazione genetica, l&#39;HCV cDNA genomico è stato clonato in un plasmide vettore batterico. Una sequenza del promotore T7 RNA polimerasi è stata introdotta immediatamente prima estremità 5 &#39;del genoma di HCV. Uno schema generale di workflow analisi HCV è presentato nella figura 1. Per generare HCV RNA genomico con precisione 3 &#39;, il genoma di HCV contenente plasmide è tagliato con l&#39;enzima di restrizione XbaI e lo...

Il virus dell'epatite C (HCV) è un importante agente patogeno umano che causa disturbi del fegato, tra cui cirrosi e cancro. Un sistema di coltura cellulare infettiva per l'HCV è essenziale per comprendere il meccanismo molecolare della replicazione dell'HCV e sviluppare nuovi approcci terapeutici. Qui descriviamo un protocollo per studiare le varie fasi del ciclo di replicazione dell'HCV.

Un protocollo per l&#39;analisi dell&#39;epatite C replicazione del virus

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le diverse fasi del ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. Questo viene ottenuto innanzitutto generando trascritti di RNA genomico di HCV a partire da costrutti plasmidici di HCV linearizzati. Il secondo passaggio consiste nel trasfettare le cellule con H-C-V-R-N-A. Successivamente, le cellule vengono seminate per diversi punti temporali e sottoposte a vari saggi. L'ultimo passaggio prevede la raccolta del supernatante della coltura cellulare per la misurazione del titolo virale e il recupero delle cellule trasfettate per l'estrazione di proteine e RNA. Infine, vengono eseguiti la retrotrascrizione-PCR, il Western blot, il saggio di immunofluorescenza e la determinazione del titolo di HCV, dimostrando così un sistema robusto di coltura cellulare infettiva per HCV.Il principale vantaggio di questo sistema di coltura cellulare del virus dell'epatite C infettivo rispetto al sistema di replicone dell'HCV è che possono essere studiati i passaggi di entrata virale, assemblaggio del virione e fuoriuscita. Questo protocollo può aiutare a rispondere alle domande fondamentali nel campo della virologia dell'epatite C, come la morfogenesi del virione e l'interazione tra patogeno e ospite. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di vaccini, poiché consente la caratterizzazione di ceppi virali attenuati che possono essere valutati come possibili candidati vaccinali.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul virus dell'epatite C, può essere applicato anche ad altri virus a RNA della famiglia dei Flaviviridae. In generale, le persone nuove a questo metodo dovranno affrontare la sfida di generare un RNA genomico di HCV di alta qualità. Lo studio dell'intero ciclo replicativo dell'HCV è diventato possibile in coltura cellulare dopo la scoperta di un ceppo giapponese di epatite fulminante di genotipo 2A dell'HCV. La dimostrazione visiva del saggio virologico è fondamentale poiché il saggio richiederà competenze sia nelle tecniche molecolari che cellulari. Utilizzando un virus chimera intragenotipo 2A, F-N-X-H-C-V e F-N-X-H-C-V privo di polimerasi per la valutazione della replicazione virale, linearizzare i plasmidi virali precedentemente generati mediante digestione con l'enzima di restrizione XBA-uno in un tubo da due millilitri. Successivamente, trattare i plasmidi con la nuclease di mung bean per generare estremi ottusi.Purificare i plasmidi digeriti mediante cromatografia a scambio anionico. Verificare l'integrità del plasmide linearizzato sottoponendo il DNA a elettroforesi su gel di agarosio. Successivamente, aggiungere il plasmide linearizzato come stampo di DNA in una provetta da 0,2 millilitri contenente i componenti della reazione della RNA polimerasi T-sette per sintetizzare trascritti di RNA genomico dell'HCV.Purificare l'RNA appena sintetizzato e trattato con DNasi utilizzando un kit di purificazione dell'RNA. Successivamente, verificare la produzione di RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio. Dopodiché, quantificare l'RNA mediante spettrofotometria.Staccare le cellule aderenti di tipo Huh-7 mediante trattamento enzimatico con tripsina e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo due successive centrifugazioni, risospendere il pellet cellulare in mezzo con basso contenuto di siero freddo. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, risospendere le cellule in mezzo con basso contenuto di siero a una concentrazione di 1 × 10⁷ cellule per millilitro.Successivamente, mescolare un totale di 10 microgrammi di RNA virale trascritto con 400 microlitri di cellule risospese in una cuvetta di elettroporazione preraffreddata da 0,4 centimetri. Introdurre l'RNA virale nelle cellule mediante elettroporazione a 270 volt, 100 ohm e 950 microfarad. Al termine, risospendere le cellule elettroporate in 10 millilitri di terreno di crescita completo con 15% di FBS. A questo punto, seminare le cellule sia in fiasche T25 a circa 1,2 × 10⁶ cellule per fialca sia in piastre a 48 pozzetti a 1 × 10⁴ cellule per pozzetto, per i tempi di 4, 48 e 96 ore. Sostituire il terreno dalle quattro alle otto ore dopo la trasfezione con terreno di crescita fresco supplementato con 10% di FBS, per rimuovere i detriti cellulari morti dalle fiasche e piastre coltivate.Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere i supernatanti della coltura cellulare ai tempi di 48 e 96 ore in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, rimuovere i detriti cellulari dai campioni raccolti mediante centrifugazione a 15.000 rpm per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, conservare i supernatanti privi di cellule a meno 80 gradi Celsius.Lisare le cellule per l'analisi di proteine e RNA mediante western blot e PCR quantitativa con trascrittasi inversa o RT-qPCR ai tempi indicati. Trascrivere al contrario un microgrammo di RNA cellulare totale utilizzando l'enzima trascrittasi inversa e un primer specifico per il filamento senso dell'HCV che si lega alla regione non tradotta a cinque primi in un tubo da 0,2 millilitri. Trascrivere inoltre F-N-X-H-C-V-R-N-A con numero di copie genomiche noto utilizzando un primer per il filamento senso dell'HCV. Mediante un sistema di PCR in tempo reale, eseguire la qPCR utilizzando 50 nanogrammi del cDNA trascritto risultante, impiegando primer specifici per l'HCV e una miscela super qPCR contenente un colorante verde legante del DNA. Utilizzare le seguenti condizioni durante l'esecuzione della qPCR per determinare il numero di copie di H-C-V-R-N-A. Dopo la qPCR, risolvere il lisato cellulare ottenuto dalla transfezione di RNA virale a 96 ore post transfezione mediante elettroforesi SDS-PAGE. Successivamente, trasferire le proteine risolte nel gel su una membrana di difluoruro di polivinilidene mediante metodo trans-blot turbo. Bloccare la membrana utilizzando una soluzione di bloccaggio contenente latte scremato al 5% e tween-20 allo 0,2% in PBS, posizionandola in un contenitore.Incubare la membrana con l'anticorpo monoclonale murino primario NS3 in una diluizione di uno a 1000 e con beta-actina in una diluizione di uno a 5.000 in una stanza fredda a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere immunoglobulina G anti-topo da capra coniugata con perossidasi di rafano in una diluizione di uno a 5.000 e rivelare mediante chemiluminescenza.A questo punto, fissare le cellule trasfettate con H-C-V-R-N-A utilizzando metanolo per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius per il saggio di immunofluorescenza. Al termine, lavare le cellule con PBS per tre volte. Dopo il blocco con il buffer bloccante per saggio di immunofluorescenza, utilizzare l'anticorpo primario policlonale anti-NS5A da coniglio e l'anticorpo monoclonale da topo anti-DSRNA J2 in un rapporto di diluizione di uno a 200 e incubare per cinque ore fino all'indomani in una stanza fredda a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con PBS per tre volte dopo l'anticorpo primario. Successivamente, aggiungere l'anticorpo secondario policlonale caprino anti-immunoglobulina-G 488 da coniglio e l'anticorpo secondario policlonale caprino anti-immunoglobulina 594 da topo in un rapporto di diluizione di uno a 1000 e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore da banco. Dopo aver lavato le cellule con PBS per tre volte, colorare i nuclei utilizzando il colorante Hoechst e osservare al microscopio a fluorescenza. Piastrare successivamente cellule Huh7.5.1 naive a circa tre volte 10 alla terza cellule per pozzetto utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Il giorno successivo, effettuare una diluizione seriale decimale del supernatante di coltura privo di cellule, raccolto da cellule trasfettate con H-C-V-R-N-A, utilizzando il mezzo di crescita e inocularlo in triplice copia su cellule Huh7.5.1. Fissare le cellule a 72 ore post-infezione utilizzando metanolo per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver rimosso le cellule dal congelatore, eseguire la colorazione per la proteina NS5A dell'H-C-V nelle condizioni precedentemente descritte. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, contare i focolai cellulari positivi per NS5A nel pozzetto con la diluizione virale più elevata e calcolare il numero medio di unità formanti focolai per millilitro. La qualità del plasmide lineare dell'HCV è stata valutata mediante elettroforesi su gel. L'H-C-V-D-N-A è stato sottoposto a trascrizione in vitro mediata dalla RNA polimerasi T-sette, che ha prodotto un singolo prodotto di RNA di 9,6 chilobasi. I risultati della RT-qPCR hanno indicato che il virus di tipo selvaggio replica il genoma in modo efficiente. Il tipo selvaggio ha mostrato un livello di replicazione del genoma da uno a tre logaritmi più elevato rispetto al virus pol-null.Il virus di tipo selvaggio ha prodotto la proteina NS3 coinvolta nel taglio delle proteine virali e nella replicazione del genoma. Il virus di tipo selvaggio ha inoltre espresso la proteina NS5A e la proteina NS5A e l'RNA a doppio filamento si sono co-localizzati nel citoplasma cellulare delle cellule trasfettate con il tipo selvaggio, suggerendo una replicazione virale attiva. Le misurazioni del titolo virale hanno indicato che il virus di tipo selvaggio è infettivo e produce oltre 10.000 unità formanti focolai per millilitro di particelle infettive. A sei ore dal transfezione, sia il virus di tipo selvaggio che il virus pol-null hanno mostrato attività simili della luciferasi, indicando un livello simile di traduzione dell'RNA trasfettato. Tuttavia, a 48 e 96 ore dal transfezione, il virus di tipo selvaggio ha mostrato livelli di replicazione del genoma superiori rispetto al virus pol-null. Il virus di tipo selvaggio ha inoltre prodotto la proteina virale NS3. Il virus poll null ha mostrato un'attività basale della luciferasi, mentre il virus di tipo selvaggio ha mostrato un livello di replicazione da due a tre log superiore rispetto al virus reporter pol-null. Una volta padroneggiati, i saggi virologici per l'epatite C possono essere eseguiti in due settimane se effettuati correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale disporre di cellule robuste e di trascritti di RNA genomico HCV di alta qualità. Dopo questa procedura, ceppi di HCV caratterizzati possono essere testati in sistemi modello animale per indagare la fitness in vivo e le interazioni tra ospite e patogeno.Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare infettivo per l'HCV ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare i passaggi della morfogenesi del virione e dell'uscita virale nel ciclo di replicazione dell'HCV. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire vari saggi virologici per caratterizzare le diverse fasi del ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite C può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni di sicurezza, come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, durante l'esecuzione di questa procedura.

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