High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in

L'obiettivo generale della procedura è utilizzare la robotica e saggi standardizzati per ottimizzare l'isolamento di mutazioni letali sensibili alla temperatura in Chlamydomonas, al fine di identificare i geni e i percorsi essenziali in questo organismo. Siamo interessati sia alla conservazione che alla divergenza delle funzioni cellulari essenziali nei eucarioti. Il nostro approccio preferito per studiare questi aspetti si basa su mutazioni che alterano geni essenziali in tali processi.

Perché ciò funzioni bene, è necessaria una raccolta davvero completa di mutanti e i metodi di cui sentirete sono il nostro modo per generare una tale collezione. Stiamo lavorando con l'alga verde Chlamydomonas reinhardtii come rappresentante del regno vegetale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che mutazioni letali sensibili alla temperatura possono probabilmente essere individuate in ogni via essenziale.

Il metodo non richiede alcuna conoscenza pregressa né mutagenesi mirata. La funzione molecolare del gene mutato viene suggerita immediatamente dal fenotipo letale. Ciò ci aiuta a selezionare mutazioni interessanti che interrompono diversi percorsi di segnalazione, oltre al controllo del ciclo cellulare.

Per eseguire la mutagenesi UV, coltivare le cellule di Chlamydomonas fino a un OD 750 compreso tra 0,2 e 0,5 in 100 millilitri di Tris-Acetate-Phosphate, o TAP, sotto luce a 25 gradi Celsius e agitazione a 100 giri al minuto. La mutagenesi UV viene eseguita indipendentemente in due diversi background genetici secondo il protocollo descritto nel testo. Analizzare un campione di ciascuna coltura al microscopio per verificare che le cellule siano vitali e prive di contaminazioni.

Successivamente, diluire la coltura fino a un OD 750 di 0,003, quindi avvolgere la bottiglia con carta d'alluminio per garantire una densità omogenea, poiché il ceppo è mobile e nuota in modo direzionale in risposta alla luce. Dopo aver regolato la densità della sospensione secondo il protocollo descritto nel testo, fissare una piccola cassetta di tubi adatta a un distributore di liquidi ed eseguire una serie di lavaggi per la sterilizzazione, seguendo le istruzioni del produttore, al fine di prevenire contaminazioni. Utilizzando una cassetta distributrice per otto siringhe, distribuire quattro serie da 96 gocce di due microlitri ciascuna di coltura su piastre rettangolari asciutte.

Battere leggermente sul bordo della piastra per assicurare la fusione di tutte le gocce in un sottile strato liquido e coprire immediatamente le piastre per evitare l'esposizione alla luce. Dopo l'essiccazione, posizionare le piastre sotto una lampada UV germicida per un periodo di tempo determinato empiricamente per ottenere un rendimento ottimale di mutanti ts tra i sopravvissuti. Successivamente, trasferire le piastre al buio per un periodo compreso tra otto e 24 ore a temperatura ambiente.

Quindi posizionare le piastre in un incubatore a 21 gradi Celsius con illuminazione. Dopo circa 10 giorni, quando le colonie sono cresciute ma non si sono fuse, caricare le piastre nello stack corrispondente come sorgenti per la selezione robotizzata delle colonie. Successivamente, selezionare le colonie per matrici 384 su piastre rettangolari e coltivarle a 21 gradi Celsius con illuminazione per circa una settimana.

Utilizzando un robot per la replicazione su piastra, condensare le piastre 384 in una piastra 1536 e lasciare crescere le colture nell'incubatrice a 21 gradi Celsius per circa tre giorni. Replicare le piastre 1536 su due piastre ciascuna e posizionarne una nell'incubatrice a 21 gradi Celsius e l'altra in un'incubatrice a 33 gradi Celsius. Dopo 24 ore a 33 gradi Celsius, replicare le piastre provenienti dall'incubatrice a 33 gradi Celsius su un nuovo set di piastre preriscaldate e collocarle nell'incubatrice a 33 gradi Celsius.

Dopo tre giorni di crescita a 33 gradi Celsius e cinque giorni di crescita a 21 gradi Celsius, utilizzare una fotocamera digitale per fotografare una piastra a griglia contrassegnata con nove indicatori di allineamento. Successivamente, fotografare le piastre, alternando le piastre a 21 gradi Celsius con le corrispondenti piastre a 33 gradi Celsius, posizionando tutte le piastre in un telaio fisso per mantenere un'orientazione esatta. Elaborare le coppie di immagini delle piastre a 21 e 33 gradi Celsius mediante un software personalizzato di analisi delle immagini in ambiente matte lab, al fine di eliminare lo sfondo e suddividere le immagini in un array da 1536.

Il programma determinerà la biomassa rilevata come intensità totale dei pixel in ciascuna posizione. Caricare l'elenco delle colonie selezionate generato dal software come file di istruzioni per il robot prelevatore di singole colonie. Successivamente, preparare le piastre di origine e di destinazione secondo le istruzioni del robot e consentire al robot di prelevare le colonie selezionate in un array.

Posizionare le piastre bersaglio nell'incubatrice a 21 gradi Celsius per circa cinque giorni per ottenere una piastra stock. Dopo aver eseguito un secondo saggio di accumulo di biomassa e replicato 100 piastre a blocco secondo il protocollo descritto nel testo, replicare la versione fresca delle 100 piastre a blocco in tre copie. Dopo l'allestimento della terza piastra nel robot e il posizionamento dei ceppi, acquisire microfotografie di una regione di ciascun punto delle piastre di screening ai tempi zero e posizionare le piastre a 33 gradi Celsius per l'incubazione.

In diversi momenti temporali successivi alla rimozione delle piastre di screening dall'incubatore a 33 gradi Celsius, acquisire rapidamente delle microfotografie, assicurandosi che il supporto della piastra e il controllore dello stage siano calibrati con precisione per ottenere immagini delle stesse cellule a ogni punto temporale. Analizzare le immagini microscopiche e selezionare i mutanti in base ai criteri desiderati. Piastrare il set finale selezionato in una piastra di agar in formato 96 a matrice, assicurandosi che ogni piastra contenga mutanti dello stesso tipo di accoppiamento e con la stessa resistenza al farmaco.

Trasferire grandi quantità delle colonie disposte in una piastra microtitolazione a 96 pozzetti contenente mezzo di induzione dei gameti privo di azoto. Incubare le piastre alla luce per circa cinque ore per consentire la gametogenesi. Sospendere i ceppi con tipi di accoppiamento opposti che contengono cassette di resistenza alternative in provette contenenti mezzo di induzione dei gameti privo di azoto per la gametogenesi.

Mescolare i campioni da una piastra bersaglio in un volume di miscela di accoppiamento pari a 20 microlitri. Dopo circa 10 minuti di esposizione alla luce, depositare cinque microlitri da ciascun pozzetto due volte: una volta su una piastra TAP per il test di linkage e una volta su una piastra TAP aggiunta di cinque micromoli di paro e nove micromoli di hygro per il test di complementazione.

Dopo l'incubazione delle piastre per il test di complementazione, replicare le piastre in due copie per l'identificazione del fenotipo ts. Testare le colonie per il fenotipo ts secondo il protocollo descritto nel testo. Dopo l'irradiazione di singole cellule di Chlamydomonas, le cellule vengono fatte crescere per dieci giorni a temperatura permissiva, quindi isolate in un formato ordinato, come mostrato qui.

Le piastre risultanti nel formato 384 vengono unite in un array da 1536. Sono stati testati tre tempi di esposizione ai raggi UV per generare mutanti ts di Chlamydomonas. Empiricamente, il tempo di esposizione di 1,5 minuti ha prodotto il maggior numero di mutanti ts.

Tuttavia, di gran lunga, il tempo di esposizione di un minuto ha prodotto la maggior parte dei candidati del ciclo cellulare. In questo esperimento, sono stati eseguiti due saggi fenotipici di tipo ts in sequenza ed è stato isolato e caratterizzato fenotipicamente circa 3000 mutanti ts mediante microscopia a intervalli di tempo. Come mostrato qui, per rimuovere i geni altamente ricorrenti dalla successiva procedura, sono stati effettuati test di complementazione e di associazione genetica con geni già caratterizzati che presentavano più di due alleli, confrontandoli con i nuovi candidati raccolti.

Queste colonie non mostrano complementazione con il ceppo in esame e sono quindi nuovi alleli termosensibili per il gene analizzato. Questi vengono generalmente esclusi da ulteriori caratterizzazioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in alto rendimento.

È possibile isolare migliaia di mutanti termosensibili in soli due o tre cicli di mutagenesi. Un passaggio fondamentale dopo l'isolamento dei mutanti termosensibili è la selezione di un sottoinsieme per ulteriori studi, ed è particolarmente interessante osservare la varietà di fenotipi letali. Il fenotipaggio fornisce indizi sulla funzione molecolare e aiuta anche a stabilire una gerarchia di priorità per i mutanti da analizzare ulteriormente.

Tenere presente che i mutanti possono presentare centinaia o migliaia di mutazioni nei loro genomi. Di solito solo una è causativa, anche se a volte sono necessarie due mutazioni per il fenotipo ts, il che può essere determinato mediante analisi tetra. Seguendo questa procedura, le mutazioni causative possono essere identificate tramite analisi di sequenziamento di nuova generazione su campioni raggruppati. I geni identificati a volte presenteranno mutazioni che suggeriscono una funzione, oppure potranno essere sequenze nuove e sconosciute, il che risulta interessante ed entusiasmante.

Chlamydomonas è stato un ottimo sistema modello per lo studio della biologia cellulare nel regno vegetale. Le procedure di cui avete sentito parlare dovrebbero rendere possibile lo studio di questo organismo per processi essenziali finora relativamente inesplorati, e speriamo che i risultati ottenuti siano rilevanti anche per il più ampio regno vegetale.