High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in Reinhardtii Chlamydomonas

L'obiettivo generale della procedura è quello di utilizzare la robotica e i saggi standardizzati per semplificare l'isolamento delle mutazioni letali sensibili alla temperatura in Chlamydomonas al fine di determinare i geni e i percorsi essenziali in questo organismo. Siamo interessati sia alla conservazione che alla divergenza delle funzioni cellulari essenziali negli eucarioti. E il modo in cui ci piace studiare questo è con le mutazioni che interrompono i geni essenziali in questi processi.

Affinché funzioni bene, hai bisogno di una collezione davvero completa di mutanti e i metodi di cui sentirai parlare sono il nostro modo di generare una tale raccolta. Stiamo lavorando sull'alga verde Chlamydomonas reinhardtii come rappresentante del regno vegetale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le mutazioni letali sensibili alla temperatura possono essere trovate in ogni percorso essenziale.

Il metodo non richiede alcuna conoscenza preliminare o mutagenesi mirata. La funzione molecolare del gene mutato è stata immediatamente suggerita dal fenotipo letale. Questo ci aiuta a selezionare mutazioni interessanti che interrompono diversi percorsi siala al di là del controllo del ciclo cellulare.

Per effettuare la mutagenesi UV, colture di cellule di Chlamydomonas fino a un OD 750 da 0,2 a 0,5 in 100 millilitri di Tris-Acetato-Fosfato, o TAP, sotto luce a 25 gradi Celsius e agitazione a 100 giri/min. La mutagenesi UV viene eseguita indipendentemente in due background genetici secondo il protocollo di testo. Controllare un campione di ciascuna coltura al microscopio per assicurarsi che le cellule siano vitali e prive di contaminazione.

Successivamente, diluire la coltura a un OD 750 di 0,003, quindi avvolgere la bottiglia con un foglio di alluminio per garantire una densità omogenea poiché il ceppo è modale e nuota direzionalmente in risposta alla luce. Dopo aver regolato la densità della sospensione secondo il protocollo di testo, collegare una piccola cassetta per tubi che si adatta a un distributore di liquidi ed eseguire una serie di lavaggi per la sterilizzazione, secondo le istruzioni del produttore, per prevenire la contaminazione. Utilizzando una cassetta dosatrice di liquidi da otto siringhe, erogare quattro gocce per 96 di due microlitri ciascuna di coltura su piastre rettangolari asciutte.

Picchiettare delicatamente sul bordo della piastra per garantire la fusione di tutte le gocce in un sottile foglio di liquido e coprire immediatamente le piastre per evitare l'esposizione alla luce. Una volta essiccate, porre le piastre sotto una lampada UV germicida per periodi di tempo determinati empiricamente per dare una resa ottimale di mutanti ts tra i sopravvissuti. Quindi, trasferisci le piastre al buio per otto-24 ore a temperatura ambiente.

Quindi posizionare le piastre in un'incubatrice a 21 gradi Celsius con illuminazione. Dopo circa 10 giorni in cui le colonie sono cresciute ma non unite, caricare le piastre nell'apposita pila come fonti per il prelievo robotizzato delle colonie. Quindi raccogli le colonie per 384 array su piastre rettangolari e coltivale a 21 gradi Celsius con illuminazione per circa una settimana.

Utilizzando una replica del robot di placcatura, condensare i 384 array in un array 1536 e lasciare che le piastre crescano nell'incubatore a 21 gradi Celsius per circa tre giorni. Replicare gli array 1536 su due piastre ciascuno e posizionarne uno nell'incubatore a 21 gradi Celsius e l'altro in un incubatore a 33 gradi Celsius. Dopo 24 ore a 33 gradi Celsius, replicare le piastre dall'incubatrice a 33 gradi Celsius su una nuova serie di piastre preriscaldate e posizionarle nell'incubatrice a 33 gradi Celsius.

Dopo tre giorni di crescita a 33 gradi Celsius e cinque giorni di crescita a 21 gradi Celsius, usa una fotocamera digitale per fotografare una piastra a griglia contrassegnata da nove indicatori di allineamento. Quindi fotografa le lastre, alternando lastre a 21 gradi Celsius seguite dalle corrispondenti lastre a 33 gradi Celsius con tutte le lastre posizionate in una cornice fissa per preservare l'orientamento esatto. Elabora le immagini accoppiate di 21, 33 lastre con un software di analisi delle immagini di laboratorio opaco personalizzato per eliminare lo sfondo e segmentare le immagini in array 1536.

Il programma determinerà la bio-massa rilevata come intensità totale dei pixel in ciascuna posizione. Carica l'elenco delle colonie selezionate generato dal software come file di istruzioni per il singolo robot di selezione delle colonie. Quindi prepara le piastre sorgente e target secondo le istruzioni della robotica e consenti al robot di prelevare le colonie selezionate in un array.

Posizionare le piastre target nell'incubatore a 21 gradi Celsius per circa cinque giorni per far crescere una piastra di serie. Dopo aver eseguito un secondo saggio di accumulo di bio-massa e aver replicato 100 piastre a blocchi secondo il protocollo di testo, replicare la nuova copia delle 100 piastre a blocchi in tre copie. Dopo l'impostazione della terza piastra nel robot e l'individuazione delle colonie, scattare foto-micrografie di una regione di ciascun punto delle piastre di screening a volte zero e posizionare le piastre a 33 gradi Celsius per l'incubazione.

In momenti diversi dopo aver rimosso le piastre di vagliatura dall'incubatore a 33 gradi Celsius, eseguire rapidamente foto-micrografie, assicurandosi che il supporto della piastra e il controller del tavolino siano calibrati con precisione per ottenere immagini delle stesse celle in ogni punto temporale. Analizza le immagini microscopiche e seleziona i mutanti in base ai criteri desiderati. Individua il set finale selezionato in una piastra di agar a 96 dislivelli, assicurandoti che ogni piastra contenga mutanti dello stesso tipo di accoppiamento e resistenza ai farmaci.

Trasferire grandi quantità di colonie in array in un terreno di induzione di gameti privo di azoto su micropiastre a 96 pozzetti. Incubare le piastre alla luce per circa cinque ore per consentire la gametogenesi. Sospendere le query con i tipi di accoppiamento opposti che ospitano le cassette di resistenza alternative in provette con mezzo di induzione di gameti privi di azoto per la gametogenesi.

Mescolare i campioni da una piastra target in un volume di miscela di accoppiamento di 20 microlitri. Dopo circa 10 minuti sotto la luce, individuare due volte cinque microlitri da ciascun pozzetto. Una volta su una piastra TAP per il test di linkage e una volta su un TAP più cinque micromoli paro più nove micromoli igrometrici per il test di complementazione.

Dopo aver incubato le piastre per il test di complementazione, replicare le piastre in due copie per l'identificazione del fenotipo. Testare le colonie per il fenotipo ts secondo il protocollo di testo. Dopo l'irradiazione di singole cellule di Chlamydomonas, le cellule vengono lasciate crescere per dieci giorni a una temperatura permissiva, quindi raccolte in un formato arrayed, come si vede qui.

Le piastre risultanti nel formato 384 vengono unite in un array 1536. Sono stati testati tre tempi di esposizione ai raggi UV per generare mutanti di Chlamydomonas ts. Empiricamente il tempo di esposizione di 1,5 minuti ha prodotto il maggior numero di mutanti ts.

Tuttavia, di gran lunga, il tempo di esposizione di un minuto ha prodotto la maggior parte dei candidati del ciclo cellulare. In questo esperimento, sono stati eseguiti due saggi sequenziali del fenotipo ts e circa 3000 mutanti ts sono stati isolati e caratterizzati fenotipicamente mediante microscopia time-lapse. Come si vede qui, per rimuovere geni altamente ricorrenti dalla pipeline a valle, sono stati eseguiti test di complementazione e linkage con geni già caratterizzati con più di due alleli contro candidati appena raccolti.

Queste colonie non mostrano alcuna complementazione con la query e sono quindi un nuovo allele ts per il gene interrogato. Questi sono generalmente esclusi da un'ulteriore caratterizzazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita ad alta produttività.

Migliaia di mutanti ts possono essere isolati in soli due o tre cicli di mutagenesi. Un passo fondamentale dopo l'isolamento dei mutanti ts è quello di selezionare un sottoinsieme per ulteriori studi ed è molto interessante vedere la gamma di fenotipi letali. La fenotipizzazione fornisce suggerimenti sulla funzione molecolare e ci aiuta anche a dare priorità ai mutanti per ulteriori studi.

Tieni presente che i mutanti possono avere centinaia o migliaia di mutazioni nei loro genomi. Di solito solo una è causale, anche se a volte sono necessarie due mutazioni per il fenotipo ts e questo può essere determinato dall'analisi dei tetra. Seguendo questa procedura, le mutazioni causative possono essere identificate mediante l'analisi di sequenziamento di nuova generazione di I geni identificati a volte avranno mutazioni che suggeriscono una funzione o possono essere sequenze nuove e sconosciute, il che è interessante ed eccitante.

Chlamydomonas è stato un formidabile sistema modello per lo studio della biologia cellulare nel regno vegetale. Le procedure di cui avete sentito parlare dovrebbero aprire lo studio di questo organismo per processi essenziali che sono stati relativamente poco esaminati e speriamo che i risultati siano rilevanti anche per il più ampio regno vegetale.