Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sviluppare un metodo per lo screening rapido e automatizzato ad alto rendimento dei protoplasti vegetali, in particolare per affrontare l'attuale collo di bottiglia nello screening precoce di un gran numero di bersagli di editing genomico e silenziamento genico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biotecnologia vegetale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la produzione e la trasformazione automatizzata di protoplasti ad alto rendimento per un rapido screening parallelo della funzione del promotore nell'espressione genica.

Questa procedura sarà dimostrata utilizzando la coltura in sospensione BY-2, ampiamente utilizzata per il tabacco giallo brillante. Inizia coltivando una coltura BY-2 in un pallone di Erlenmeyer, come descritto nel testo del protocollo. Il giorno dell'isolamento dei protoplasti, mescolare accuratamente la coltura in modo che le cellule si stabilizzino rapidamente e trasferire sei millilitri di coltura in una provetta da centrifuga a fondo conico da 15 millilitri.

Lasciare riposare le cellule per almeno 10 minuti. Regolare il volume della cella impaccata al 50% del volume totale rimuovendo il volume appropriato di surnatante. Agitare la provetta capovolgendolo, quindi utilizzare pipette a foro largo per pipettare 500 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti per la digestione.

Il primo passo di questa procedura consiste nell'accendere tutti i componenti del sistema robotico, che sono il motore per micropiastre, il gestore di liquidi, il lettore di piastre multimodale, il dispenser multimodale, il riscaldatore o refrigeratore per piastre e i computer. Quindi, apri il software di pianificazione delle attività del traslocatore delle lastre che integra il traslocatore delle micropiastre con le altre apparecchiature per consentire il trasferimento delle lamiere tra ogni apparecchiatura. Nel software di spostamento delle lastre, definire le specifiche tecniche per il materiale di laboratorio utilizzato nel protocollo.

Fare clic su Configurazione nella barra degli strumenti principale e selezionare il comando Gestisci tipi di contenitore. Selezionare il tipo di contenitore appropriato dall'elenco dei tipi di contenitore esistenti. Definisci le specifiche tecniche per tutti gli articoli da laboratorio che il traslocatore incontrerà.

Il passaggio successivo consiste nel definire le posizioni di inizio e fine per ogni contenitore. Fare clic sulla scheda Inizio/Fine in un protocollo specifico. Seleziona la posizione iniziale di ciascun contenitore e seleziona la casella Coperchio, Senza coperchio sia nella posizione iniziale che in quella finale.

Dopo aver definito le posizioni iniziale e finale per ogni pezzo di materiale da laboratorio, caricare manualmente tutte le piastre nella posizione iniziale per l'intero flusso di lavoro. Caricare le piastre di screening fluorescenti a 96 pozzetti nell'hotel due, le piastre a sei pozzetti con celle BY-2 nell'hotel tre, una piastra a 96 pozzetti profonda che verrà utilizzata per la trasformazione sul nido due del riscaldatore o del refrigeratore a piastre e un tubo conico da 50 millilitri contenente la soluzione enzimatica sul dispenser multimodale. Per eseguire la trasformazione nel protocollo, precaricare ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti con 10 microlitri di DNA plasmatico contenente la proteina reporter fluorescente arancione e incubare sul riscaldatore o sul refrigeratore della piastra a quattro gradi Celsius.

Caricare tutte le forniture e le piastre sulla piattaforma automatizzata di movimentazione dei liquidi nelle posizioni designate. Caricare una piastra da 96 pozzetti precaricata con 200 microlitri di una soluzione di polietilenglicole al 40% per pozzetto nella colonna uno. Caricare una scatola di puntali per pipette nel nido otto.

Per definire la posizione di ciascun elemento nel software delle piattaforme automatizzate per la manipolazione dei liquidi, selezionare Strumenti dal menu e fare clic su Labware Editor. Selezionare il tipo di materiale da laboratorio dal menu a discesa. Selezionare la scheda Protocollo principale e fare clic su Configura materiale da laboratorio per definire la posizione di ciascun componente di materiale da laboratorio.

Fare clic su Esegui per inizializzare tutti i dispositivi che verranno utilizzati nel protocollo. Infine, nella finestra Esplora lavoro, fare clic su Aggiungi unità di lavoro per verificare tutto il materiale di laboratorio nel sistema e avviare il protocollo automatizzato. La parte più delicata della procedura è la trasformazione del protoplasto.

Poiché la trasformazione viene eseguita dal sistema robotico, è fondamentale che i protocolli automatizzati siano impostati correttamente. Ai fini di questo video, verranno mostrati solo i passaggi selezionati nei protocolli automatizzati. Durante il protocollo di trasformazione, la piattaforma automatizzata per la manipolazione dei liquidi aspira 70 microlitri della soluzione protoplastica dalla piastra a sei pozzetti e la dispensa nella piastra a 96 pozzetti profondi nel nido sei.

Quindi, vengono utilizzati nuovi puntali per pipette per aspirare lentamente 70 microlitri della soluzione di polietilenglicole altamente viscoso dalla piastra a pozzetti profondi precaricata e a erogare completamente la soluzione nei pozzetti applicabili della piastra a pozzetti profondi. Successivamente, la piattaforma automatizzata per la movimentazione dei liquidi sposta la piastra a pozzetti profondi dai sei successivi al nido nove, dove il motore delle piastre preleva la piastra e la sposta alla stazione di scuotimento delle piastre e la agita a 1500 giri/min per 30 secondi. Dopo un'incubazione di 20 minuti senza agitazione per consentire l'equilibrio dei protoplasti, il motore della piastra sposta la piastra a 96 pozzetti profondi verso l'erogatore multimodale e attiva il protocollo di lavaggio.

Quando il protocollo automatizzato di isolamento e trasformazione dei protoplasti è completo, rimuovere la piastra con i protoplasti trasformati dall'hotel uno del sistema robotico. Accendere il microscopio invertito, la fotocamera e la lampada fluorescente. Selezionare l'obiettivo 10X per la messa a fuoco iniziale dei protoplasti.

Accendere la lampada alogena e chiudere l'otturatore della lampada fluorescente. Caricare la piastra sul sistema del microscopio e mettere a fuoco i protoplasti utilizzando il campo chiaro. Quindi, spegni la lampadina alogena e apri l'otturatore della lampada fluorescente.

Selezionare il set di filtri Cy3/TRITC per la visualizzazione della proteina fluorescente arancione espressa dai protoplasti transgenici. Scansiona ogni pozzetto per determinare il numero di protoplasti che esprimono il marcatore fluorescente. La digestione enzimatica dei protoplasti alle condizioni specificate in questo protocollo ha portato a 2.820.000 protoplasti per piastra a sei pozzetti.

È stata valutata la perdita di concentrazione di protoplasti dopo ogni fase di trasferimento del protocollo. Dopo il protocollo di digestione, 11.500 protoplasti sono stati trasferiti in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti profondi. Una volta completato il protocollo di trasformazione, 1.230 protoplasti sono stati trasferiti sulla piastra di screening fluorescente a 96 pozzetti.

Per garantire che più fasi di pipettaggio non danneggiassero i protoplasti, la loro vitalità è stata testata mediante colorazione con ioduro di propidio. I risultati non hanno mostrato differenze significative nella vitalità dopo la digestione, dopo il trasferimento alla piastra di screening fluorescente a 96 pozzetti e dopo il protocollo di trasformazione. Il protocollo di trasformazione ha avuto successo nella generazione di cellule transgeniche che esprimono la proteina fluorescente arancione sebbene l'efficienza di trasformazione fosse bassa, solo circa il 2% Ciò è dovuto al grande plasma binario utilizzato e al fatto che il protocollo non è stato ottimizzato specificamente per i protoplasti BY-2.

Le metriche ottenute per l'andamento temporale del protocollo hanno mostrato che l'investimento maggiore di tempo viene speso durante la fase di digestione. La durata completa dell'isolamento e della trasformazione dei protoplasti è stata di tre ore, 50 minuti e 53 secondi senza bisogno di input esterni da parte dell'operatore. Una volta impostata correttamente, questa tecnica può essere eseguita dal robot in meno di quattro ore.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica sta aprendo la strada ai ricercatori nel campo delle biotecnologie vegetali per eseguire procedure genomiche delle colture ad alto rendimento, come l'editing del genoma e lo screening del promotore.