Lo studio dei processi dinamici di dimensioni nano oggetti in liquidi di utilizzare la scansione microscopia elettronica a trasmissione

L'obiettivo generale della microscopia elettronica a trasmissione a scansione di fase liquida è quello di osservare strutture e fenomeni di nanomateriali in campioni biologici completamente incorporati in uno strato liquido di spessore fino a diversi micrometri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scienza dei materiali, come il comportamento dei nanomateriali nei liquidi e lo studio di campioni biologici nell'ambiente liquido naturale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni morfologiche su scala nanometrica sui campioni in liquido.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il caricamento del supporto del campione e l'acquisizione delle immagini non sono così semplici come quelli fatti per la prima volta con la microscopia elettronica. Per iniziare la procedura, in una cappa a flusso laminare pulita, pulire un vetrino per microscopia ottica con un fazzoletto privo di fibre ed etanolo puro. Posizionare il vetrino su un fazzoletto per camera bianca in una capsula di Petri con coperchio.

Per manipolare i microchip SiN, utilizzando una pinzetta rivestita di carbonio, afferrare il microchip con decisione ma con attenzione sui lati lunghi, mantenendo sempre la membrana SiN rivolta verso l'alto. Usando questa tecnica, posiziona cinque microchip senza distanziatore e cinque microchip con un distanziatore a 200 nanometri sul vetrino. Chiudere la capsula di Petri e portare i microchip in una cappa aspirante.

Posizionare i microchip in un becher di acetone di grado HPLC con la membrana rivolta verso l'alto. Agitare delicatamente il becher per due minuti per rimuovere il rivestimento protettivo, facendo attenzione a non capovolgere i microchip. Quindi, trasferisci rapidamente i microchip in un becher di etanolo puro.

Coprire il bicchiere con un foglio di alluminio. Far roteare delicatamente il becher per due minuti per completare la rimozione del rivestimento e portarlo in una capsula di Petri chiusa alla cappa a flusso laminare. Posiziona i microchip su un fazzoletto fresco per camera bianca, facendo attenzione a non capovolgere i microchip mentre vengono rilasciati dalle pinzette.

Lasciare asciugare i microchip per qualche minuto. E poi posizionare i microchip sul vetrino nella capsula di Petri. Chiudere la capsula di Petri e portare i microchip in un pulitore al plasma.

Posizionare il vetrino e i microchip nel pulitore al plasma ed eseguire un programma di pulizia di cinque minuti per rimuovere gli idrocarburi dalla membrana SiN. Utilizzando un microscopio ottico, ispezionare i microchip per verificare la presenza di membrane rotte o particelle di sporco. Scartare i microchip danneggiati o sporchi.

Nella cappa a flusso laminare, immobilizzare i microchip in una scatola di trasporto pulita con una superficie interna appiccicosa. Applicare una goccia da un microlitro di una soluzione di nanoparticelle acquose d'oro stabilizzata con citrato a tre molari sulla membrana SiN di ciascun microchip senza distanziatore e lasciare asciugare la soluzione. Quindi, applicare un microlitro di acqua deionizzata sulla membrana per lavare via sale e tensioattivi.

Dopo 30 secondi, utilizzare la carta da filtro per tamponare accuratamente l'acqua e lasciare asciugare i microchip. Posizionare la punta del supporto TEM per il flusso di liquido sotto un microscopio ottico binoculare. Rimuovere il coperchio in titanio dalla punta del supporto e posizionarlo su un foglio di carta stagnola.

Installare una pompa a siringa microfluidica con una siringa di vetro da un millilitro contenente 0,5 millilitri di acqua di grado HPLC. Collegare la siringa al sistema di flusso e avviare la pompa. Quando l'acqua viene scaricata attraverso il sistema, controllare le linee per perdite o restringimenti di flusso.

Al termine del pompaggio, rimuovere il risciacquo dallo scomparto della cella del liquido e asciugare la punta del supporto con carta da filtro. Ispezionare la punta del supporto con il microscopio ottico. Asciugare la punta con un panno per camera bianca e rimuovere la polvere o le fibre con una pinzetta rivestita di PTFE pulita.

Ispezionare il coperchio della punta del supporto, l'O-ring e le viti e rimuovere polvere o fibre con una pinzetta rivestita in PTFE. Posizionare l'O-ring nei gruppi di supporto. Posiziona la prima vite e ruotala un paio di volte in modo che rimanga.

Con una pinzetta curva pulita, posizionare il microchip del campione nella tasca della punta di supporto con la membrana SiN rivolta verso l'alto. Utilizzare il microscopio ottico binoculare per verificare che il microchip sia posizionato correttamente. Versare una goccia da 0,3 microlitri di acqua filtrata pura sul microchip del campione.

Tenere il microchip in posizione con una pinzetta. Quindi, prendi un microchip distanziatore con una pinzetta curva tenuta capovolta. Ruotare con cautela le pinzette in modo che la membrana del microchip sia rivolta verso il basso.

Posizionare il microchip distanziatore sul microchip del campione. Posizionare il materiale riflettente sotto la punta del supporto e controllare l'allineamento del microchip sotto il microscopio ottico binoculare. Usa una pinzetta per regolare con cura i microchip se le finestre SiN non sono allineate.

Quindi, sollevare il coperchio della camera dei campioni con una pinzetta. Capovolgere il coperchio e, senza toccare i microchip, appoggiare il lato posteriore del coperchio sulla punta del supporto. Posizionare la vite rimanente utilizzando una pinzetta e serrare entrambe le viti in modo iterativo.

Serrare con cura fino a quando non incontrano resistenza. Le finestre possono rompersi facilmente se il serraggio è troppo forte. Avviare un flusso di liquido di quattro microlitri al minuto attraverso il sistema e verificare la presenza di perdite nella punta del supporto.

Quindi, portare il supporto in una stazione di pompaggio del vuoto ed eseguire un controllo delle perdite. Assicurarsi che la pressione raggiunga almeno 10 al quinto mbar negativo entro cinque minuti. Posizionare il supporto nel suo involucro.

E portare il supporto al microscopio elettronico. Impostare il microscopio in modalità STEM. Misurare la densità di corrente del fascio di elettroni con un sottile film di carbonio rivestito con nanoparticelle d'oro come campione di riferimento senza acqua.

Avviare il flusso di acqua pura a una velocità non superiore a due microlitri al minuto. Inserire il supporto TEM del flusso di liquido nel blocco del carico a vuoto e iniziare l'evacuazione. Assicurarsi che la pressione diminuisca normalmente.

Quindi inserire completamente il supporto TEM nel microscopio. Una volta che la pressione è sufficientemente bassa, aprire la valvola a fascio e inserire il rilevatore ADF. Impostare il microscopio in modalità di acquisizione continua e traslare il tavolino del campione nelle direzioni X e Y per trovare la finestra SiN.

Regola il contrasto e la luminosità in modo che i bordi della finestra siano chiaramente visibili. Traslare lo stage nelle direzioni X e Y in modo che un angolo della finestra si trovi al centro del campo visivo. Quindi reimpostare la lente dell'obiettivo.

Regolare la posizione verticale del tavolino per campioni per mettere a fuoco grossolanamente l'angolo. Inclinare il tavolino di cinque gradi avanti e indietro per verificare che il campione sia all'altezza eucentrica. Centrare l'angolo della finestra nel campo visivo e quindi memorizzare la posizione del tavolino nel software.

Traslare lo stadio nelle direzioni X e Y fino a quando le nanoparticelle d'oro sono visibili. E poi mettere a fuoco l'obiettivo. Annotare la densità di corrente e calcolare lo spessore della cella liquida.

Traslare il palco nelle direzioni X e Y per individuare un'area con almeno 20 nanoparticelle d'oro. Imposta i parametri e acquisisci un'immagine. Nanoparticelle d'oro vengono immobilizzate su una membrana di nitruro di silicio e sottoposte a imaging con STEM in fase liquida.

In acqua pura, le nanoparticelle d'oro hanno mantenuto la loro forma durante l'imaging. I prodotti della radiolisi dell'acqua potrebbero ossidare i singoli atomi d'oro, alterando la forma delle nanoparticelle. In un altro esperimento, gli ioni cloruro vengono introdotti nella fase liquida.

Le nanoparticelle d'oro si sono lentamente dissolte attraverso l'esperimento mentre gli atomi d'oro ossidati formavano tetracloroaurato solubile. Per studiare i movimenti delle nanoparticelle d'oro nell'acqua, nell'esperimento successivo, le nanoparticelle non sono state completamente immobilizzate sulla membrana del campione. Le nanoparticelle d'oro si sono agglomerate e, una volta raggiunta una dimensione critica del cluster, si sono spostate fuori dal campo visivo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Saranno necessarie diverse settimane di formazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare con calma e controllare la tenuta del vuoto e lo spessore del liquido.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in Scienza dei Materiali, Chimica e Biologia per esplorare la crescita e il movimento delle nanoparticelle nei liquidi, la struttura dei materiali su scala nanometrica in ambienti liquidi e la funzionalità delle proteine nelle cellule dei mammiferi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre la microscopia elettronica a scansione e trasmissione di nanoparticelle d'oro incorporate in uno strato d'acqua, incluso il corretto caricamento del portacampioni e la regolazione del microscopio. Non dimenticare che lavorare con liquidi nel microscopio elettronico può causare danni se il portacampioni non è caricato correttamente.

Quindi è importante verificare la presenza di perdite di vuoto prima del caricamento.