Name: Lo studio dei processi dinamici di dimensioni nano oggetti in liquidi di utilizzare la scansione microscopia elettronica a trasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Scopri la microscopia elettronica a scansione in fase liquida per osservare processi dinamici nanometrici di AuNPs in acqua. Questo metodo consente di studiare nanomateriali in ambiente liquido con risoluzione nanometrica.

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Ringraziamo E. Arzt per il suo supporto attraverso INM. La ricerca è stata in parte sostenuta dal Concorso Leibniz 2014.

<ol><li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy.</a> Science. 350, 9881-9889 (2015).</li>
<li>de Jonge, N., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+specimens+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of specimens in liquid.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).</li>
<li>Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+single+colloidal+platinum+nanocrystal+growth+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories.</a> Science. 324, 1309-1312 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+growth+of+nanoparticles+from+solution+with+in+situ+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).</li>
<li>Alloyeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+kinetic+and+thermodynamic+effects+on+the+growth+of+gold+nanoplates+by+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).</li>
<li>Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+carbonate+nucleation+driven+by+ion+binding+in+a+biomimetic+matrix+revealed+by+in+situ+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy.</a> Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).</li>
<li>de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macromolecular+complexes+with+in+situ+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1085-1090 (2012).</li>
<li>Dukes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microchip+design+and+application+for+in+situ+transmission+electron+microscopy+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules.</a> Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li>
<li>de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/278397751_Practical_Aspects_of_Transmission_Electron_Microscopy_in_Liquid">Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid.</a> Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).</li>
<li>Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptionally+slow+movement+of+gold+nanoparticles+at+a+solid%3Aliquid+interface+investigated+by+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy.</a> Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).</li>
<li>Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp507400n">Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).</li>
<li>Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+induced+chemistry+of+gold+nanoparticles+in+saline+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution.</a> Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).</li>
<li>Schuh, T., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S163107051300203X">Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids.</a> C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).</li>
<li>Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+chip+system+with+a+microfluidic+channel+for+in+situ+electron+microscopy+of+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids.</a> Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).</li>
<li>Creemer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/5428851/">A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions.</a> J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).</li>
<li>Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microscopy+of+nanoscale+cluster+growth+at+the+solid-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface.</a> Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+cells+and+tissues+under+fully+hydrated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Reimer, L., Kohl, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReimer%2C+L+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
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<li>Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+conventional+and+video-speed+scanning+probe+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes.</a> Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).</li>
<li>Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instr%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy in liquid.</a> Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo descritto consente STEM di AuNPs in un liquido, compreso l&#39;osservazione dei processi dinamici. L&#39;assemblaggio del supporto è una tecnica facile da imparare. Tuttavia, diversi aspetti devono essere considerati quando si lavora con il titolare TEM flusso di liquido. Per esempio, bordi rotti di microchip Si o particelle di grandi dimensioni sugli O-ring possono causare perdite della cella liquido. D&#39;altra parte, le particelle più grandi (&gt; 200 nm, per esempio, polvere o detriti Si) sulla membrana SiN può portare ad un aumento dello spessore della cella di liquido, che conduce ad un basso contrasto imaging o ad una bassa risoluzione spaziale e può anche causare finestre peccato rompere. Importante, residui di sale o altre sostanze chimiche possono influenzare l&#39;esito degli esperimenti in modo indesiderato. Pertanto, è fondamentale che le diverse fasi di preparazione del campione e gruppo porta vengono eseguiti accuratamente e in un ambiente pulito e privo di polvere. Lo spessore del ce liquidoll determina la risoluzione ottenibile, nonché il contrasto delle immagini ottenute 17. Questo spessore può essere regolato tramite distanziali situato su uno dei due microchip Si. A seconda delle dimensioni del campione, diversi spessori della cella liquido può essere realizzato. Per lo studio della AuNPs, è possibile utilizzare piccoli distanziatori (200-500 nm), mentre intere cellule eucariotiche necessitano grandi distanziatori fino a 5 micron. Lo spessore della cella liquido viene ulteriormente influenzata dalla sporgenza dei finestrini membrana SiN risultanti dalla differenza di pressione tra la cella liquido e il vuoto circostante. Questo effetto diventa più pronunciato con le finestre membrana SiN più grandi. Pertanto, al fine di ridurre al minimo lo spessore della cella di liquido, si raccomanda di utilizzare piccole finestre membrana SiN. Nel caso è difficile trovare una sovrapposizione tra due piccole finestre, che può essere montato in una configurazione incrociata utilizzando un diverso microchip base. configurazioni alternative largely prevenire rigonfiamento e sono composti da un microchip 18 o membrana monolitici Windows supportati da colonne 19, ma quelli svantaggi presentano per quanto riguarda il caricamento del campione. Uno degli aspetti più impegnativi della tecnologia attuale è la mancanza di un controllo preciso sulla spessore liquido. Spesso, il liquido è molto più spesso di quello che ci si aspetta dalle dimensioni distanziali utilizzati, come è stato mostrato qui. Diversi gruppi utilizzati camere chiuse liquidi 4, 20, 21, 22; questi sistemi hanno alcuni vantaggi rispetto risoluzione spaziale, come lo spessore liquido può essere ridotto inducendo una bolla nel liquido. In alternativa, le finestre SiN possono essere costretti a collassare, portando ad un livello di liquido diluente. In terzo luogo, il recinto di altre finestre sottili esiste (ad esempio, grafene) 23, con conseguente anche nei liquidi molto più sottilidi quello che è possibile con il sistema descritto in questo protocollo. Tuttavia, è impossibile flusso liquido in tali sistemi. Come per qualsiasi tecnica di microscopia alta risoluzione, deve essere considerato un certo numero di aspetti sperimentali. L&#39;aspetto più importante è l&#39;interazione del fascio elettronico con il liquido o il campione. Oltre ai danni da radiazioni, che limita la risoluzione spaziale ottenibile per vari campioni solidi 24, i campioni liquidi sono inoltre influenzati dal fascio di elettroni generati prodotti radiolisi 15, 25. Dal momento che questi prodotti possono influenzare l&#39;esperimento, l&#39;interpretazione dei dati accurati e disegno sperimentale sono essenziali 26. Le impostazioni microscopio devono essere scelti in base agli obiettivi di uno studio particolare. STEM ADF è più potente per le nanoparticelle di imaging di un elevato numero atomico (Z) in grandi spessori della cellula liquido, WHILe TEM fornisce un migliore contrasto su materiali a basso-Z ed è in genere più veloce, ma richiede più sottili strati liquidi 3. Invece di utilizzare il rilevatore di ADF, la (BF) rilevatore di campo luminoso è talvolta usato per l&#39;immagine della cella di liquido, in quanto BF STEM è vantaggioso per l&#39;imaging materiali a bassa-Z in strati spessi 27. Con l&#39;aumento dello spessore della cella liquido, è necessaria più attuale. Tuttavia, questo aumenta anche le concentrazioni di prodotti radiolisi e aumenta il danno di radiazione. Va inoltre osservato che una inversione di contrasto si osserva nel rivelatore ADF per liquidi molto spessi (&gt; 10 micron per l&#39;acqua). Le condizioni liquide sono state modificate tra i nostri esperimenti rimuovendo il supporto dal microscopio e scambiando sia il campione e il liquido. Oltre a modificare la concentrazione di sale, è facilmente possibile modificare altre proprietà del liquido che scorre in diversi liquidi (ad esempio, uno puòusare soluzioni tampone al fine di impostare un pH specifico 16 o possono introdurre soluzioni organiche o altri additivi). E &#39;anche possibile cambiare il liquido mentre il supporto è ancora inserito nel microscopio fluendo liquidi attraverso il sistema microfluidico. Tuttavia, in questo caso, non è noto al momento che punto il liquido cambia campione. E &#39;anche degno di nota che i microchip di supporto elettrodi sono disponibili, in modo da esperimenti su scala nanometrica elettrochimica possono essere effettuate 28. Gli oggetti di studio non sono limitati a AuNPs in acqua, ma un&#39;ampia varietà di campioni possono essere studiate usando il protocollo descritto sopra, compresa la silice, ossido di titanio, e polimeri. Se i movimenti degli oggetti sono troppo veloci per catturare in un&#39;immagine all&#39;interno l&#39;acquisizione, la viscosità può essere ridotto di un ordine di grandezza usando una miscela di 50% glicerolo e acqua al 50%. Dai punti suddetti,una serie di vantaggi, possibilità, e anche svantaggi diventa evidente. Quando si lavora con stelo in fase liquida, gli inconvenienti più importanti da considerare sono che: 1) ogni esperimento è influenzata dall&#39;interazione dinamica del fascio elettronico con l&#39;intero campione (l&#39;oggetto sotto osservazione, il liquido e le membrane SiN); 2) la manipolazione del campione è noioso, ed è spesso difficile ottenere un sottile strato liquido perché il campione o il microchip contiene alcune particelle di dimensioni micrometriche; 3) lo spessore liquido solito varia notevolmente dallo spessore previsto fissato dal distanziatore; e 4) la risoluzione spaziale e di contrasto dipendono fortemente dallo spessore del liquido e la differenza tra la densità cambiamento dell&#39;oggetto sotto osservazione e il liquido. Attualmente, esistono ampi metodi per la microscopia di oggetti in un liquido con risoluzione spaziale nanometrica. La microscopia elettronica in ghiaccio amorfo è una tecnica potente 29,ma le procedure sperimentali coinvolti sono delicati, non tutti gli esperimenti consentono la preparazione del campione in ghiaccio, ed esperimenti risolte nel tempo sono impossibili. Microscopia a 30 X-ray, 31 potrebbe in linea di principio essere utilizzato, ma ha una risoluzione spaziale limitata e non è ampiamente disponibile nei laboratori. Atomic microscopia a forza in un liquido è stata stabilita, ma è una superficie tecnica solo 32, 33, 34, 35. La microscopia ottica non presenta risoluzione spaziale sufficiente. Attualmente, microscopia elettronica in un liquido sembra la tecnica più potente per microscopia diretta di oggetti e processi su scala nanometrica in liquidi. TEM in fase liquida e STEM non sono ancora tecniche di analisi di routine, ma sono ancora in via di sviluppo. Il numero di parametri da prendere in considerazione è considerevole, ed è often difficile riprodurre i risultati sperimentali. Inoltre, dati quantitativi è difficile da ottenere perché gli effetti in esame si intrecciano con i processi che si verificano come risultato del fascio di elettroni. Il protocollo qui descritto si propone di standardizzare il protocollo sperimentale, che rappresentano quindi per tutti gli aspetti di base rilevanti di questo esperimento. Ci auguriamo che questo protocollo porterà ad una migliore riproducibilità del lavoro sperimentale in questo settore emergente.

Conventional Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) è limitata dalla gamma di campioni appropriati per l'analisi, in particolare i campioni secchi e solidi adatti per il posizionamento in alto vuoto. Tuttavia, molte questioni scientifiche e tecnologiche riguardano materiali e processi in ambiente liquido nanoscala. I campioni pienamente incorporati in un liquido possono ora essere studiati con staminali utilizzando un concetto che implica una camera di microfluidica assemblata nel supporto del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e lo stelo 1. Questa tecnica di nuova concezione è diventato sempre più popolare, in quanto fornisce una nuova visione importanti processi di vari temi di ricerca, tra cui la crescita, la dissoluzione, e processi di aggregazione delle nanoparticelle 2, 3, 4, 5, 6. Non solo i metalli, ma anche biominerals 7 e sistemi biologici possono essere studiati 8, 9, 10, 11. Il caricamento del campione e l'acquisizione di immagini per STEM in fase liquida è diverso per STEM di campioni secchi e comportano un protocollo che richiede una formazione dedicato. Il sistema microfluidica è costituito da due microchip silicio sostegno del nitruro di silicio finestre (SiN) membrana trasparente per il fascio di elettroni a 200 keV di energia 12 (vedere Figura 1A). Dettagli delle dimensioni e del trattamento di questi microchip possono essere trovati altrove 12, 13. Il campione di solito contiene oggetti su scala nanometrica. In questo lavoro abbiamo osservato nanoparticelle d'oro (AuNPs). I AuNPs sono immobilizzati alla finestra superiore (rispetto ad un fascio di elettroni discendente-traslazione) o galleggiano sapone liquidid. Risoluzione spaziale su scala nanometrica in STEM si ottiene la scansione del fascio di elettroni negli AuNPs e la raccolta di elettroni diffusi trasmessi utilizzando il rivelatore 9 anulare scuro Field (ADF). I due microchip sono collocati in una piccola fessura nella punta del titolare TEM flusso di liquido 1 (il titolare opera sia STEM e TEM, ma è indicato come titolare TEM). Uno dei microchip contiene un distanziatore in modo che un vano liquido è formato tra i microchip. O-ring su entrambi i lati delle due microchip forniscono sigillatura sotto vuoto del vano liquido 13 (vedere Figura 1B). Lo scopo di questo articolo è dimostrare i passi di base di caricamento del campione ed acquisizione dati in modo che gli utenti interessati possono trovare facile accesso a questa nuova tecnica emergente. Un sistema disponibile da un'azienda specifico è utilizzato, ma il protocollo è valido anche per i sistemi di altre aziende. La tecnica èpiù complesso di TEM convenzionale e stelo, e un certo numero di aspetti pratici deve essere considerato quando si lavora con un sistema di supporto liquido 13. Più importante di tutto è garantire che il compartimento liquido viene montato correttamente, fornendo così un sottile strato di liquido ed una tenuta di vuoto. Pertanto, è molto importante lavorare in modo pulito e prevenire la formazione di polvere durante la preparazione e l'assemblaggio del supporto TEM flusso di liquido. In particolare, gli O-ring e le due microchip di silicio devono essere liberi da ogni contaminazione. Anche piccole particelle di polvere in un'unica dei microchip possono seriamente aumentare lo spessore della cella assemblata, che può impedire il raggiungimento di una risoluzione spaziale utile. Una guarnizione di vuoto è importante che trasmettano o danneggiamento sarà lasciato al microscopio elettronico dopo l'esperimento. Questo protocollo descrive la procedura di caricamento e diverse prove necessarie. Il funzionamento del microscopio elettronico è semplice, but richiede alcuni passaggi aggiuntivi rispetto al microscopio di campioni solidi. Con l'aumento spessori liquidi, più elettroni vengono assorbiti e dispersi dal liquido; una misurazione dello spessore liquido è essenziale. Infine, il protocollo spiega come le immagini sono prese e come i processi dinamici può essere studiato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig1.jpg"> Figura 1: cella di flusso liquido per la scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM). (A) Rappresentazione schematica della cella liquido assemblato. Due microchip di silicio con finestre a membrana del nitruro di silicio (SiN) sono posizionati tra due o-ring. Il liquido è racchiuso tra la membrana SiN e quindi è separato dal vuoto al microscopio elettronico. A focalizzato scansioni fascio di elettroni sul campione. Il contrasto è ottenuto da elettroni sparsi. nanoparticelle di oro (AuNPs) sono immobilizzati all'interno del liquido nella membrana SiN ma può anche muoversi nellaliquido. (B) Schema sezione trasversale vista laterale della pila di due microchip con O-ring. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscopio ottico binoculare</td><td>Leica</td><td>M60 CMO</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione a trasmissione con correttore di aberrazione sferica</td><td>JEOL</td><td>ARM200F</td><td></td></tr><tr><td>Flusso di liquido TEM portacampioni DENS</td><td>Solutions</td><td>Ocean</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa microfluidica</td><td>Harvard Scientific</td><td>PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Gatan</td><td>Solarus950</td><td></td></tr><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone, Rotisolv&nbsp; Plus per HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7328.2</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, chromasolv Plus per HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, Rotisolv HPLC grado</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>Oro citrato colloidale stabilizzato, diametro 30 nm</td><td>British-Biocell</td><td>EM. GC20<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base microchip di silicio con membrane in nitruro di silicio di 50 nm di spessore e dimensioni di 20 &; m x 0,40 mm</td><td>Soluzioni DENS</td><td>per il sistema</td><td></td>oceanico</tr><tr><td>Microchip di silicio distanziatore con membrane in nitruro di silicio di 50 nm di spessore, dimensioni di 20 &; m x 0,40 mm e spessore del distanziatore di 200 nm</td><td>Soluzioni DENS</td><td>per il sistema</td><td></td>oceanico</tr><tr><td>Tubi in peek microfluidico</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td> con punte sostituibili</tr> <tr><td>in plastica (corpo in acciaio inossidabile antimagnetico antiacido con punte ESD PVDF (SV)</td>pinzette in acciaio piegato <td>rivestite in</td> teflon <td>ideal-tek</td> 2ASVR.SA <td></td></tr> (<tr><td>EMS SA con "PTFE" Rivestimento)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>78322-7Te</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta in acciaio a becco largo rivestita in teflon (rivestimento EMS 2A "PTFE")</td>Siringa Hamilton <td>di Microscopia elettronica</td><td>78322-2ATe</td><td></td></tr><tr><td>1 mL, a tenuta di gas (Modello 1001 TLLX SYR)</td><td>Hamilton</td><td>81323</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto per camera bianca Sontara Micropure AP (224 x 224mm)</td><td>DuPont</td><td>Sontara MicroPure</td><td></td></tr></tbody></table>

lo studio dei processi dinamici di dimensioni nano oggetti in liquidi di utilizzare la scansione microscopia elettronica a trasmissione

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

I campioni pienamente incorporati in un liquido può essere studiato con una risoluzione spaziale su scala nanometrica con la scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM), utilizzando una camera di microfluidica assemblata nel supporto del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e lo stelo. Il sistema di microfluidica è costituito da due microchip di silicio di supporto sottili finestre membrana del nitruro di silicio (SiN). Questo articolo descrive i passaggi fondamentali di caricamento dei campioni e acquisizione dati. Più importante di tutto è garantire che il compartimento liquido viene montato correttamente, fornendo così un sottile strato di liquido ed una tenuta di vuoto. Questo protocollo include anche un certo numero di prove necessarie per eseguire durante il caricamento del campione in modo da garantire un corretto montaggio. Una volta caricato il campione al microscopio elettronico, lo spessore del liquido deve essere misurato. montaggio scorretto può causare un liquido troppo spessa, mentre un liquido troppo sottile può indicare l&#39;assenza di liquido, come quando si forma una bolla. Infine, il protocollospiega come le immagini sono prese e come i processi dinamici può essere studiato. Un campione contenente AuNPs viene ripreso sia in acqua pura e in soluzione salina.

Il titolare TEM flusso liquido è stato utilizzato per studiare il comportamento di AuNPs in liquido. AuNPs erano stabilmente immobilizzati sulla membrana SiN in acqua pura e sono stati ripresi con risoluzione nanometrica utilizzando STEM fase liquida (Figura 6). Eccellente contrasto è stato ottenuto l'oro fortemente scattering. La densità di corrente sullo schermo fosforo misurato per un campione secco era di 20 pA / cm², mentre è pari a 8 pA / cm² con il supporto TEM flusso del liquido inserito. Con l'equazione 1, t acqua = 2.4 ± 0.5 micron, molto più grande di quanto ci si aspettava in base allo spessore distanziale di 200 nm. Tuttavia, lo spessore non è troppo grande per la rappresentazione delle AuNPs con risoluzione spaziale nanometrica. Lo spessore liquido era più spesso del 200 nm impostato dal distanziale a causa rigonfiamento delle membrane peccato, non planarità dei microchip, e detriti che risiedono sui microchip. 16, anche se i prodotti radiolisi reattivi (e - aq, H •, H +, OH •) provenienti dalla interazione del fascio di elettroni con acqua può ossidare atomi d'oro singole, portando ad un cambiamento della forma della AuNPs 15. Tuttavia, quando il sistema di flusso liquido è stato utilizzato per introdurre ioni cloruro in un secondo esperimento, la stabilità dei AuNPs cambiato. Gli ioni cloruro sono in grado di stabilizzare atomi d'oro ossidato in forma di tetrachloroaureat, AuCl 4 -. La figura 7 mostra che i AuNPs lentamente dissolti nel corso di una serie di time-lapse immagini STEM, simili ai risultati riportati in precedenza 16. Per la dose di elettroni utilizzato, ci sono voluti ~ 300 s per sciogliere i 30 nm AuNPs dimensioni. I movimenti di AuNPs Tardi r sono stati studiati in un terzo esperimento (Figura 8). Prima dell'esperimento, il titolare TEM flusso di liquido è stata pulita per rimuovere eventuali tracce di sale. A differenza del primo esperimento, un approccio alternativo preparazione del campione è stata utilizzata per realizzare un collegamento più debole delle AuNPs alla membrana SiN 14. In questo esperimento, la soluzione AUNP è stata posta sul microchip silicio e montato nel supporto TEM flusso di liquido senza lasciare che la soluzione asciugare. In questo modo, i AuNPs facilmente rimossi dalla membrana SiN su immagini alla dose utilizzata. Alcuni dei AuNPs spostato lontano dal campo visivo nelle soluzioni all'ingrosso, mentre i rimanenti AuNPs rimasti entro il campo visivo in prossimità della finestra di SiN. sono stati osservati movimenti di questi AuNPs, e alla fine hanno agglomerati. Dopo un po ', questi agglomerati anche staccati dalla membrana SiN e portate fuori dal campo visivo e nella soluzione. S copi "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig6.jpg"> Figura 6: la scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM) Micrografia di AuNPs 30 nm di diametro in testa di uno strato di acqua pura. L'immagine mostrata è un'area selezionata dell'immagine originale. La dimensione dell'immagine è 1.024 x 1.024 pixel, il tempo di permanenza dei pixel è di 19 ms, la dimensione dei pixel è stato 0,73 nm, e l'ingrandimento era 400,000X. La dose di elettroni era quindi 7,1 x 10 4 e - / nm². La densità di corrente misurata sullo schermo fosforo era 8 pA / cm 2, per cui lo spessore del liquido è stata calcolata pari a 2.4 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig7.jpg"> Figura 7: Serie Time-lapsedi Micrografie stelo di AuNPs a Saline. (AD) immagini estratte dalla serie time-lapse di immagini STAMINALI ad intervalli di 30 s. I AuNPs gradualmente dissolvono in un liquido come conseguenza della presenza di ioni cloruro. Il tempo di pixel di permanenza è stato di 2 ms, il lasso di tempo della serie lasso di tempo è stato 1,75 s, la dimensione dei pixel è stato 0,44 nm, e l'ingrandimento era 500,000X. La dose di elettroni per ogni immagine era 1,2 x 10 4 e - / nm². Lo spessore liquido era 2,4 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig8.jpg"> Figura 8: STEM Micrografia di AuNPs movimento in acqua pura. (A) membrana SiN con AuNPs, molti dei quali sono selezionati con le frecce. (B) le tracce di movimentodei AuNPs selezionati (vedi A). Alcuni AuNPs allontanarsi dal campo di vista durante il tempo di imaging. I restanti AuNPs si muovono lateralmente lungo la membrana peccato e iniziano agglomerazione. Dopo aver raggiunto una dimensione di cluster critica, si inviano dalla membrana e si allontanano dal campo di view.The tempo pixel di permanenza è stato di 1 ms, il lasso di tempo è stato di 0,52 s, la dimensione dei pixel è stato 1,8 nm, e l'ingrandimento era 120,000X. La dose di elettroni per ogni immagine era 3,5 x 10 2 e - / nm² e lo spessore liquido era 2,4 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive il funzionamento di un portacampioni flusso di liquido per la scansione di trasmissione microscopia elettronica di AuNPs in acqua, usati per l&#39;osservazione dei processi dinamici nanoscala.

Lo studio dei processi dinamici di dimensioni nano oggetti in liquidi di utilizzare la scansione microscopia elettronica a trasmissione

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

L'obiettivo generale della microscopia elettronica a trasmissione a scansione di fase liquida è quello di osservare strutture e fenomeni di nanomateriali in campioni biologici completamente incorporati in uno strato liquido di spessore fino a diversi micrometri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scienza dei materiali, come il comportamento dei nanomateriali nei liquidi e lo studio di campioni biologici nell'ambiente liquido naturale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni morfologiche su scala nanometrica sui campioni in liquido.In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il caricamento del supporto del campione e l'acquisizione delle immagini non sono così semplici come quelli fatti per la prima volta con la microscopia elettronica. Per iniziare la procedura, in una cappa a flusso laminare pulita, pulire un vetrino per microscopia ottica con un fazzoletto privo di fibre ed etanolo puro. Posizionare il vetrino su un fazzoletto per camera bianca in una capsula di Petri con coperchio.Per manipolare i microchip SiN, utilizzando una pinzetta rivestita di carbonio, afferrare il microchip con decisione ma con attenzione sui lati lunghi, mantenendo sempre la membrana SiN rivolta verso l'alto. Usando questa tecnica, posiziona cinque microchip senza distanziatore e cinque microchip con un distanziatore a 200 nanometri sul vetrino. Chiudere la capsula di Petri e portare i microchip in una cappa aspirante.Posizionare i microchip in un becher di acetone di grado HPLC con la membrana rivolta verso l'alto. Agitare delicatamente il becher per due minuti per rimuovere il rivestimento protettivo, facendo attenzione a non capovolgere i microchip. Quindi, trasferisci rapidamente i microchip in un becher di etanolo puro.Coprire il bicchiere con un foglio di alluminio. Far roteare delicatamente il becher per due minuti per completare la rimozione del rivestimento e portarlo in una capsula di Petri chiusa alla cappa a flusso laminare. Posiziona i microchip su un fazzoletto fresco per camera bianca, facendo attenzione a non capovolgere i microchip mentre vengono rilasciati dalle pinzette.Lasciare asciugare i microchip per qualche minuto. E poi posizionare i microchip sul vetrino nella capsula di Petri. Chiudere la capsula di Petri e portare i microchip in un pulitore al plasma.Posizionare il vetrino e i microchip nel pulitore al plasma ed eseguire un programma di pulizia di cinque minuti per rimuovere gli idrocarburi dalla membrana SiN. Utilizzando un microscopio ottico, ispezionare i microchip per verificare la presenza di membrane rotte o particelle di sporco. Scartare i microchip danneggiati o sporchi.Nella cappa a flusso laminare, immobilizzare i microchip in una scatola di trasporto pulita con una superficie interna appiccicosa. Applicare una goccia da un microlitro di una soluzione di nanoparticelle acquose d'oro stabilizzata con citrato a tre molari sulla membrana SiN di ciascun microchip senza distanziatore e lasciare asciugare la soluzione. Quindi, applicare un microlitro di acqua deionizzata sulla membrana per lavare via sale e tensioattivi.Dopo 30 secondi, utilizzare la carta da filtro per tamponare accuratamente l'acqua e lasciare asciugare i microchip. Posizionare la punta del supporto TEM per il flusso di liquido sotto un microscopio ottico binoculare. Rimuovere il coperchio in titanio dalla punta del supporto e posizionarlo su un foglio di carta stagnola.Installare una pompa a siringa microfluidica con una siringa di vetro da un millilitro contenente 0,5 millilitri di acqua di grado HPLC. Collegare la siringa al sistema di flusso e avviare la pompa. Quando l'acqua viene scaricata attraverso il sistema, controllare le linee per perdite o restringimenti di flusso.Al termine del pompaggio, rimuovere il risciacquo dallo scomparto della cella del liquido e asciugare la punta del supporto con carta da filtro. Ispezionare la punta del supporto con il microscopio ottico. Asciugare la punta con un panno per camera bianca e rimuovere la polvere o le fibre con una pinzetta rivestita di PTFE pulita.Ispezionare il coperchio della punta del supporto, l'O-ring e le viti e rimuovere polvere o fibre con una pinzetta rivestita in PTFE. Posizionare l'O-ring nei gruppi di supporto. Posiziona la prima vite e ruotala un paio di volte in modo che rimanga.Con una pinzetta curva pulita, posizionare il microchip del campione nella tasca della punta di supporto con la membrana SiN rivolta verso l'alto. Utilizzare il microscopio ottico binoculare per verificare che il microchip sia posizionato correttamente. Versare una goccia da 0,3 microlitri di acqua filtrata pura sul microchip del campione.Tenere il microchip in posizione con una pinzetta. Quindi, prendi un microchip distanziatore con una pinzetta curva tenuta capovolta. Ruotare con cautela le pinzette in modo che la membrana del microchip sia rivolta verso il basso.Posizionare il microchip distanziatore sul microchip del campione. Posizionare il materiale riflettente sotto la punta del supporto e controllare l'allineamento del microchip sotto il microscopio ottico binoculare. Usa una pinzetta per regolare con cura i microchip se le finestre SiN non sono allineate.Quindi, sollevare il coperchio della camera dei campioni con una pinzetta. Capovolgere il coperchio e, senza toccare i microchip, appoggiare il lato posteriore del coperchio sulla punta del supporto. Posizionare la vite rimanente utilizzando una pinzetta e serrare entrambe le viti in modo iterativo.Serrare con cura fino a quando non incontrano resistenza. Le finestre possono rompersi facilmente se il serraggio è troppo forte. Avviare un flusso di liquido di quattro microlitri al minuto attraverso il sistema e verificare la presenza di perdite nella punta del supporto.Quindi, portare il supporto in una stazione di pompaggio del vuoto ed eseguire un controllo delle perdite. Assicurarsi che la pressione raggiunga almeno 10 al quinto mbar negativo entro cinque minuti. Posizionare il supporto nel suo involucro.E portare il supporto al microscopio elettronico. Impostare il microscopio in modalità STEM. Misurare la densità di corrente del fascio di elettroni con un sottile film di carbonio rivestito con nanoparticelle d'oro come campione di riferimento senza acqua.Avviare il flusso di acqua pura a una velocità non superiore a due microlitri al minuto. Inserire il supporto TEM del flusso di liquido nel blocco del carico a vuoto e iniziare l'evacuazione. Assicurarsi che la pressione diminuisca normalmente.Quindi inserire completamente il supporto TEM nel microscopio. Una volta che la pressione è sufficientemente bassa, aprire la valvola a fascio e inserire il rilevatore ADF. Impostare il microscopio in modalità di acquisizione continua e traslare il tavolino del campione nelle direzioni X e Y per trovare la finestra SiN.Regola il contrasto e la luminosità in modo che i bordi della finestra siano chiaramente visibili. Traslare lo stage nelle direzioni X e Y in modo che un angolo della finestra si trovi al centro del campo visivo. Quindi reimpostare la lente dell'obiettivo.Regolare la posizione verticale del tavolino per campioni per mettere a fuoco grossolanamente l'angolo. Inclinare il tavolino di cinque gradi avanti e indietro per verificare che il campione sia all'altezza eucentrica. Centrare l'angolo della finestra nel campo visivo e quindi memorizzare la posizione del tavolino nel software.Traslare lo stadio nelle direzioni X e Y fino a quando le nanoparticelle d'oro sono visibili. E poi mettere a fuoco l'obiettivo. Annotare la densità di corrente e calcolare lo spessore della cella liquida.Traslare il palco nelle direzioni X e Y per individuare un'area con almeno 20 nanoparticelle d'oro. Imposta i parametri e acquisisci un'immagine. Nanoparticelle d'oro vengono immobilizzate su una membrana di nitruro di silicio e sottoposte a imaging con STEM in fase liquida.In acqua pura, le nanoparticelle d'oro hanno mantenuto la loro forma durante l'imaging. I prodotti della radiolisi dell'acqua potrebbero ossidare i singoli atomi d'oro, alterando la forma delle nanoparticelle. In un altro esperimento, gli ioni cloruro vengono introdotti nella fase liquida.Le nanoparticelle d'oro si sono lentamente dissolte attraverso l'esperimento mentre gli atomi d'oro ossidati formavano tetracloroaurato solubile. Per studiare i movimenti delle nanoparticelle d'oro nell'acqua, nell'esperimento successivo, le nanoparticelle non sono state completamente immobilizzate sulla membrana del campione. Le nanoparticelle d'oro si sono agglomerate e, una volta raggiunta una dimensione critica del cluster, si sono spostate fuori dal campo visivo.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Saranno necessarie diverse settimane di formazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare con calma e controllare la tenuta del vuoto e lo spessore del liquido.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in Scienza dei Materiali, Chimica e Biologia per esplorare la crescita e il movimento delle nanoparticelle nei liquidi, la struttura dei materiali su scala nanometrica in ambienti liquidi e la funzionalità delle proteine nelle cellule dei mammiferi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre la microscopia elettronica a scansione e trasmissione di nanoparticelle d'oro incorporate in uno strato d'acqua, incluso il corretto caricamento del portacampioni e la regolazione del microscopio. Non dimenticare che lavorare con liquidi nel microscopio elettronico può causare danni se il portacampioni non è caricato correttamente.Quindi è importante verificare la presenza di perdite di vuoto prima del caricamento.

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