Modello di topo per il trapianto di Pancreas usando una tecnica modificata polsino

Il mio nome è Benno Cardini, del Laboratorio di Ricerca Daniel Swarovski del Dipartimento di Chirurgia Viscerale, dei Trapianti e Toracica dell'Università Medica di Innsbruck. Oggi vi mostreremo un modello murino per il trapianto di pancreas mediante una tecnica con manicotto modificata. Anestetizzare l'animale donatore mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina, e depilare la regione addominale.

Quindi posizionare il ricevente su un campo operatorio in posizione supina e disinfettare la zona chirurgica tre volte con clorhexidina. Successivamente, eseguire una laparotomia mediana dalla regione pubica fino allo xifode e allargare l'incisione sottocostale su entrambi i lati per ottenere una migliore visione del campo operatorio. Poi esteriorizzare le viscere sul lato sinistro e iniettare eparina nella vena cava infrarenale.

Nel passaggio successivo, identificare l'aorta addominale a monte dell'incrocio con la vena renale sinistra, isolare l'aorta e legarla in quel punto. Successivamente, spostarsi all'ilo epatico, identificare e dissezionare il coledoco in prossimità del fegato e legarlo vicino al pancreas. Infine, sezionare il coledoco al di sopra della legatura.

Successivamente, dissezionare la vena porta vicino al fegato per ottenere una lunghezza sufficiente per un'anastomosi venosa. Come suggerimento, lasciare un piccolo pezzo di fegato sulla vena porta per facilitarne l'identificazione successiva. Poi, isolare la vena renale sinistra nel tessuto periortico e legarla.

Quindi sezione la vena renale e il tessuto periortico, rimanendo sul lato destro della legatura. Successivamente, disseca in modo ottuso l'aorta addominale dal tronco celiaco fino al diaframma, scava sotto l'aorta in prossimità del diaframma e praticane la sezione in quel punto. Poi identifica e coagula tutti i rami lombari e provvedi alla loro sezione.

Ora sezionare l'aorta al di sotto del legamento precedentemente posizionato. Ora perfondere il pancreas attraverso la porzione aortica con soluzione di perfusione fredda di ghiaccio fino a quando non si osserva l'effluente uscire dalla vena porta. In alto si può vedere la vena porta perfusa e più in basso l'aorta perfusa.

Ora reinserire le viscere nella cavità peritoneale e separare in modo graduale il pancreas dall'intestino utilizzando legature di seta 8-0. A partire dalla regione post-pilorica, passare due volte sotto il duodeno e far passare una legatura di seta 8-0 attraverso di essa. Quindi legarla e separare chirurgicamente il pancreas dal duodeno.

Questo approccio viene ripetuto più volte fino a raggiungere il legamento di Treitz. È essenziale non danneggiare il duodeno, poiché ciò escluderebbe l'innesto dagli esperimenti a causa di possibili contaminazioni. Dopo che il pancreas è stato completamente separato dal duodeno, passare al mesenterio, scollarlo, legarlo e quindi sezionarlo.

In analogia ai passaggi precedenti, separare il pancreas dal colon trasverso sottoponendolo a dissezione sottostante, legandolo e infine attraversandolo. Ora, utilizzando lo stesso approccio, separare il pancreas dalla regione biliare mediante dissezione netta dopo la legatura. Successivamente, effettuare la dissezione non netta del pancreas dallo stomaco.

Individuare l'arteria gastrica sinistra, legarla e sezionarla. Alla fine, rimuovere il pancreas con il milza ad esso aderente e immergerlo in soluzione di riperfusione ghiacciata fino al successivo innesto. Utilizzare il milza come maniglia.

In analogia al donatore, anestetizzare l'animale ricevente mediante iniezione intraperitoneale di chetamina e xilazina e rasare la regione cervicale. Successivamente, posizionare l'animale donatore sul campo operatorio in posizione supina e detergere la regione cervicale per tre volte con clorhexidina. In seguito, effettuare un'incisione cutanea dall'incisione giugulare fino all'angolo mandibolare destro.

Successivamente, identificare tutti i rami laterali della vena giugulare esterna destra, mobilizzarli, sottoporli a sottodislocazione e sezionarli dopo coagulazione bipolare. In seguito, afferrare il polo inferiore della ghiandola sottomandibolare destra, sollevarlo in direzione craniale e dissezionarlo dopo la coagulazione bipolare dei suoi vasi nutritivi. A questo punto, sezionare tutti i rami mediali della vena giugulare esterna destra dopo coagulazione bipolare.

Ligare la vena giugulare esterna due volte il più cranialmente possibile e sezionarla tra i legami. Far passare l'estremità prossimale della vena giugulare esterna attraverso un manicotto di polietilene. È importante che la maniglia del manicotto sia rivolta verso il chirurgo operatorio.

Come passo successivo, posizionare la pinza microvascolare venosa proveniente dal lato laterale. Ora inumidire la vena con eparina, rimuovere il legaccio ed estrarre delicatamente la vena sopra il manicotto in polietilene. Alla fine, fissare la vena sul manicotto con un legaccio in seta 8-0 disposto in senso circolare, con un nodo sul retro e tre davanti.

Per accedere all'arteria carotide comune destra, mobilizzare e sezionare il muscolo sternocleidomastoideo destro dopo la coagulazione prossimale e distale. Successivamente, mobilizzare delicatamente l'arteria carotide comune, avendo cura di non danneggiare le strutture adiacenti come il nervo vago. Per analogia con la vena, legare due volte l'arteria carotide comune, il più cranialmente possibile, e dividerla tra i due legamenti.

Ora far passare il vaso attraverso la cuffia arteriosa. Infine, fissare la cuffia arteriosa con la pinza microvascolare, proveniente dal lato mediale. Successivamente, rimuovere il legaccio ed allargare il lume dell'arteria utilizzando dilatatori vascolari.

Dopo un sufficiente allargamento del lume, far scivolare l'arteria sopra la cuffia arteriosa. Alla fine, in analogia alla vena, fissare l'arteria con il ligamento di seta 8-0. Qui si possono osservare la vena e l'arteria riparate per l'anastomosi arterovenosa.

Per l'impianto, posizionare l'innesto su una garza Ace inumidita nella regione cervicale. Successivamente, far passare la vena porta attraverso un laccio di seta 8-0, accorciare la vena per ottenere un'anastomosi senza tensione e quindi far scivolare la vena porta sopra il manicotto venoso. Infine, fissare la vena con un laccio circolare di seta 8-0.

In analogia alla vena, far passare il moncone aortico attraverso un laccio di legatura e accorciare l'aorta. Successivamente, tirare l'aorta sopra il manicotto arterioso e infine fissarla con un laccio di seta 8-0 circolare. Prima della ripristino della perfusione, identificare i vasi splenici, legarli e infine dissezionarli con un taglio netto rimuovendo il milza.

Per la riperfusione, rimuovere prima il morsetto venoso, seguito da quello arterioso. Una riperfusione adeguata del trapianto mostra una pulsazione visibile dell'arteria e un colore roseo dell'intero trapianto. Inumidire il trapianto con soluzione salina normoterma.

Prima della chiusura della ferita, rimuovere il manico del manicotto venoso per evitare una flessione del vaso. Alla fine, chiudere la ferita con punto continuo 6-0 e iniettare 0,5 millilitri di soluzione salina normoterma per via sottocutanea. Per convalidare il modello, abbiamo testato la funzione endocrina del pancreas trapiantato.

I topi sono stati resi ipoglicemici mediante trattamento precoce con streptozotocina quattro giorni prima dell'intervento chirurgico e sono stati considerati ipoglicemici se i livelli di glucosio nel sangue erano superiori al 300 milligrammi per cento. Questa linea mostra i livelli di glucosio nel sangue dei topi di controllo vitali non trapiantati in rosso, nonché dei riceventi innesti non esposti a un tempo prolungato di ischemia fredda in blu. Inoltre, i livelli di glucosio nel sangue dei riceventi di innesti pancreatici esposti a 16 ore di ischemia fredda sono mostrati in verde.

I topi vivi sono rimasti ipoglicemici per tutto il periodo di osservazione. Al contrario, il trapianto di innesti pancreatici non sottoposti a un prolungato tempo di ischemia fredda ha determinato il ripristino della glicemia normale entro 24 ore, confermando la funzione endocrina dell'innesto. Il trapianto di innesti esposti a un tempo di ischemia fredda di 16 ore non ha ripristinato la glicemia normale nei riceventi.

Inoltre, in questo gruppo tutti i topi sono dovuti essere sacrificati entro 48 ore a causa di danni precoci del trapianto associati a lesione da ischemia-riperfusione. In questo video abbiamo presentato un metodo per il trapianto di pancreas nei topi mediante una tecnica con manicotto senza sutura. Questa tecnica è fattibile dal punto di vista microchirurgico e tecnico, con tassi di successo eccellenti.

Tuttavia, data la fibrosi progressiva del pancreas, dovuta all'occlusione del dotto, riteniamo che questo modello sia più adatto per aree di ricerca incentrate sui danni al trapianto associati alla lesione da ischemia-riperfusione in fase precoce.