Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Il trapianto di occhielli è stato proposto come potenziale trattamento per il diabete di tipo uno. Tuttavia, due importanti limitazioni impediscono che sia una realtà clinica diffusa. Innanzitutto, è necessario un gran numero di occhielli per ricevente.

Poiché gli occhielli sono ottenuti da donatori di organi, il numero di potenziali riceventi è fortemente limitato. Il secondo trapianto richiede un trattamento a vita con potenti immunosoppressori, il che mette il paziente, in particolare la popolazione pediatrica, a rischio di malignità, infezione e insufficienza renale. Il trapianto di occhielli sotto la capsula renale di topo viene eseguito per studiare strategie per migliorare i risultati clinici del trapianto.

Occhielli isolati da topi donatori sani assortiti in gruppi e preparati per il trapianto. Gli occhielli vengono quindi trapiantati nello spazio sottocapsulare del rene. Nei topi riceventi diabetici, la funzione dell'innesto di occhielli viene valutata monitorando i livelli di glucosio nel sangue, che rivelano che circa 250-350 occhielli ripristineranno la glicemia in un topo ricevente di 20 grammi entro 24 ore dal trapianto.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per quanto riguarda le fasi dell'incannulamento. Il dotto biliare comune e il trasferimento degli occhielli nello spazio sottocapsulare del rene sono difficili da imparare. Questi passaggi richiedono l'identificazione delle strutture tissutali, mani ferme e l'uso di tecniche che minimizzino il danno tissutale.

Posizionare un topo soppresso in posizione supina su un tovagliolo di carta al cannocchiale da dissezione e spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Usa le forbici per aprire l'addome con un'incisione a V dalla regione pubica a entrambe le zampe anteriori. Il topo si trova sotto l'oscilloscopio di dissezione.

Posizionarlo con la testa rivolta verso l'osservatore. Localizzare l'ingresso duodenale del dotto biliare comune con un morsetto emostatico, l'apertura duodenale del dotto biliare comune. L'emostatico deve essere posizionato in modo tale che, una volta compresso, corra esattamente lungo il bordo dell'intestino pancreatico.

Qui verranno dimostrati due metodi per incannulare il dotto biliare. Il metodo a mano libera e il metodo del forcipe aiutano a incannulare il dotto biliare. Usando il metodo a mano libera, tirare l'emostatico bloccato sul duodeno lontano dalla testa del topo verso la coda in modo che il dotto biliare comune diventi teso.

C'è una confluenza nel dotto biliare vicino al fegato dove la bile che drena dalla cistifellea e gli enzimi dal fegato si uniscono Prima di entrare nell'intestino, tirare il dotto biliare per esporre l'interno della posizione a V. Un ago piegato calibro 27 collegato a una siringa da cinque millilitri in modo che l'ago scivoli attraverso la V e incannuli direttamente la parte inferiore del condotto. Far scorrere l'ago di diversi millimetri oltre l'estremità dello smusso per evitare il riflusso nel fegato e nella cistifellea.

Una volta che l'incannulamento è andato a buon fine, perfondere il pancreas erogando due millilitri di liasi dalla siringa. Fai attenzione all'espansione del pancreas sopra lo stomaco come indicazione di una cannulamento ottimale. In alternativa, il dotto biliare può essere incannulato.

Utilizzando il metodo della cisti del forcipe. Tirare l'emostatico C bloccato sul duodeno lontano dalla testa del topo verso la coda in modo che il dotto biliare comune diventi torto. Quindi, utilizzando un ago piegato da 27 gauge collegato a una siringa da cinque millilitri, perforare la fascia sotto il dotto biliare comune vicino al fegato.

Utilizzare l'ago per liberare la fascia dal dotto con l'ago ancora in posizione. Appoggia l'emostatico e prendi un paio di pinze. Utilizzare un braccio della pinza aperta per sostenere il dotto biliare nel punto in cui l'ago ha liberato la fascia mentre si tira in avanti il dotto e la pinza.

Far scorrere l'ago nel condotto usando la pinza come antiritorno. Una cannulazione riuscita è indicata da un'espansione uniforme della regione del pancreas sulla parte superiore dello stomaco. Una volta che il pancreas è stato perfuso, rimuovere l'emostatico dal duodeno.

Quindi usa la pinza per sollevare il duodeno e usa un secondo paio di pinze per separare il pancreas dall'intestino. Quindi, libera il pancreas dalla parte superiore dello stomaco e dalla milza. Infine, solleva il pancreas dall'addome e liberalo dalle restanti connessioni della fascia con l'intestino, lo stomaco e la milza.

Metti il pancreas in un tubo conico da 50 millilitri e mettilo sul ghiaccio. Incubare il pancreas a 37 gradi Celsius secondo le istruzioni contenute nel protocollo scritto allegato. Dopo l'incubazione, aggiungere 20 millilitri di terreno alle provette e dissociare il tessuto agitando energicamente le provette 40 volte in 10 secondi.

Questo passaggio è fondamentale per un recupero ottimale delle violette. Le celle di centrifuga sono 800 rotazioni al minuto. Resus spende in 15 millilitri di terreno e condensa i campioni.

Versare l'impasto risospeso attraverso una rete metallica da 0,419 millimetri e incanalarlo in un tubo conico fresco da 50 millilitri. Sciacquare il primo tubo con altri 10 millilitri di terreno contenente il 10% di siero fetale bovino e versarlo attraverso la pellet di rete metallica le cellule mediante centrifugazione reus, piegare il pellet in cinque millilitri di temperatura ambiente il suo opaco 10 77. Quindi agitare delicatamente per diversi secondi, aggiungere altri cinque millilitri del suo opaco all'interno del tubo per lavare gli occhielli dalla parete del tubo Pipettare lentamente per sovrapporre 10 millilitri di RPMI privo di siero lungo il lato del tubo a una velocità di un millilitro per 10 secondi.

Un'interfaccia nitida dovrebbe essere evidente. Quindi centrifugare i campioni in una centrifuga a secchio oscillante a 20 gradi Celsius e 900 volte la gravità per 20 minuti con un'accelerazione molto lenta e nessuna frenata dopo la centrifugazione, le isole saranno separate dalle cellule esocrine utilizzando una pipetta sierologica monouso da 10 millilitri. Trasferire gli occhielli dall'interfaccia del supporto histo Paque a un tubo conico da 50 millilitri nuovo.

A questo punto si possono raggruppare diverse provette per rimuovere i residui di occhielli, riempire le provette opache con siero contenente terreno e pellettare le isole centrifugando le provette per due minuti a 800 rotazioni al minuto. Quindi sospendi le isole in un mezzo fresco. Ripeti questo passaggio almeno due volte. Reus.

Sospendi il pallet in cinque millilitri di supporto. Posizionare un colino per celle di nylon da 0,1 millimetri capovolto su un tubo conico da 15 millilitri. Pipettare l'impasto cellulare risospeso attraverso di esso per raccogliere gli occhielli.

Quindi sciacquare il tubo da 50 millilitri con altri sei millilitri di terreno e passarlo attraverso il colino. Mettere una goccia di tre millilitri di terreno in una capsula di Petri da 10 centimetri. Capovolgere il colino cellulare e immergerlo nella goccia del terreno per raccogliere gli occhielli, pipettare altri cinque-sette millilitri di terreno di coltura attraverso il colino nella capsula di Petri.

Per raccogliere gli occhielli rimanenti dal filtro con un obiettivo quattro volte, prelevare gli occhielli singolarmente con una pipetta P 200 e trasferirli in una provetta micro fuge da 1,5 millilitri. Queste immagini mostrano occhielli isolati da topi neri di 12 settimane C 57 di sei giorni. La purezza e la qualità degli occhielli possono essere stimate al microscopio al termine della procedura di isolamento.

Ad esempio, le due immagini mostrate qui mostrano un campo rappresentativo in cui sono presenti detriti e contaminazione cellulare esocrina. Quando si scelgono gli occhielli per un esperimento, evitare di raccogliere cellule esocrine contaminanti o occhielli che sembrano malsani. Gli occhielli con centri necrotici non sono sani come mostrato in questa figura presa 24 ore dopo l'isolamento, i centri necrotici non saranno visibili immediatamente dopo l'isolamento.

Gli occhielli che sfaldano le cellule sono inevitabili e possono essere utilizzati nel trapianto di occhielli in questo video time lapse di 24 ore di occhielli. Immediatamente dopo l'isolamento, si sviluppano centri necrotici all'interno di molti occhielli. Questi centri necrotici sembrano essere espulsi dall'occhiello verso la fine della registrazione mentre si raccolgono gli occhielli.

Raggruppali in modo che ogni tubo abbia una distribuzione uniforme della qualità e delle dimensioni degli occhielli. Ad esempio, ogni gruppo di 15 occhielli potrebbe contenere quattro occhielli di grandi dimensioni, sei occhielli medi e cinque occhielli piccoli. Luogo. Il tubo su occhielli di ghiaccio può essere utilizzato immediatamente per il trapianto o manipolato.

Prima dell'uso. Posizionare un puntale di caricamento del gel sterile nell'apertura di un tubo microfuso da 1,5 millilitri in modo che vi sia una leggera curvatura, che crea una forma a U nell'estremità stretta del puntale. Entrambe le aperture della punta devono essere rivolte direttamente verso l'esterno del tubo di micro-rifiuti.

Rimuovere delicatamente un tubo di occhielli dal ghiaccio. Assicurarsi che tutti gli occhielli si siano depositati sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta P 200, raccogliere delicatamente gli occhielli in un volume minimo dal fondo della provetta e trasferirli sulla punta curva preparata.

Dopo che gli occhielli si sono sedimentati, rimuovere la maggior parte possibile del terreno dalla punta aspirando il terreno attraverso l'ampia apertura della punta di caricamento del gel con occhiello con una punta di caricamento del gel fresca collegata a una pipetta P 200. Collegare l'estremità non smussata del tubo all'apertura stretta della punta di caricamento del gel del cuscinetto dell'isola. Quindi collegare il puntale a una pipetta P 200 e spingere delicatamente le isole nel tubo.

Quindi, collegare il bordo non smussato del tubo PE 50 all'ago di una siringa Hamilton da 25 microlitri. Con lo stantuffo ritirato, premere lo stantuffo della siringa fino a quando gli occhielli si trovano a circa 0,5 centimetri di distanza dall'apertura smussata. Mettere da parte la siringa in modo che gli occhielli possano depositarsi in un'unica massa vicino all'apertura smussata del tubo mentre il rene viene preparato a ricevere gli occhielli.

Preparare il sito chirurgico tagliando i capelli e strofinando la pelle con Betadine alternando tre volte alcol isopropilico al 70%. Inizia la procedura di trapianto di occhielli eseguendo un pizzico di dita dei piedi per confermare l'anestesia nel topo ricevente. Posizionare l'asta di una bacchetta di vetro direttamente sotto il topo e sotto il rene perpendicolarmente al midollo spinale.

Quindi localizzare il rene attraverso la pelle e posizionare un telo chirurgico sterile. Una volta individuato il rene, usa le forbici McFerson banis per praticare un'incisione di due centimetri attraverso il derma direttamente sopra di esso perpendicolarmente al midollo spinale. Questa incisione esporrà la parete peritoneale con le forbici.

Praticare un'incisione di un centimetro attraverso la parete peritoneale nella stessa direzione del taglio attraverso lo strato dermico utilizzando l'asta dell'asta di vetro come antiritorno, forzare il rene attraverso l'apertura peritoneale premendo sulla superficie adiacente. Bagnare la superficie del rene esposto con PBS sterile ghiacciato utilizzando un applicatore con punta di cotone imbevuto. Ripetere il passaggio ogni pochi minuti secondo necessità per evitare che la capsula renale si secchi.

Utilizzando un ago calibro 27, praticare un'incisione di 0,2 centimetri attraverso la capsula renale attraverso la superficie anteriore del rene. Spostandosi dal lato laterale sinistro verso il lato laterale destro, inserire un tubo capillare in vetro tirato a fiamma. Sonda l'incisione praticata in precedenza e spostala in direzione posteriore lungo la superficie laterale dorsale del rene.

Per creare una sacca tra la capsula renale e il parenchima renale, spostare gli occhielli nella siringa Hamilton da 25 millilitri preparata fino al bordo dell'apertura smussata del tubo flessibile. Quindi inserire il bordo smussato rivolto verso l'alto nella busta sottocapsulare. Il bordo lungo è a contatto con il parenchima renale.

Spostare il tubo all'estremità più posteriore della capsula. Quindi trasferire lentamente gli occhielli dal tubo di PE 50 nella sacca sottocapsulare premendo lo stantuffo della siringa. Mentre gli occhielli si riempiono la sacca, fai uscire lentamente il tubo flessibile per fare più spazio.

Dopo aver rimosso il tubo dalla sacca, far scorrere la sonda di vetro lungo la superficie esterna del rene anteriormente a quella posteriore per inserire delicatamente gli occhielli nell'estremità prossimale della sacca. Usando una pinza per il braccio piegato, sollevare il rivestimento peritoneale adiacente all'apertura praticata per il rene. Quindi utilizzare un applicatore con punta in cotone imbevuto di PBS per spingere delicatamente il rene nella cavità peritoneale.

Chiudere il topo applicando punti di sutura alla parete peritoneale e clip della ferita allo strato dermico. Rimetti il mouse nella sua gabbia e nel monitor. Per il recupero, l'acqua aceto meine dovrebbe essere fornita per l'intestino del topo.

C occhielli di topo isolati. Utilizzando i metodi descritti in questo video, è stata trapiantata una dose curativa in topi allogenici C 57 black six. I livelli di glucosio nel sangue non a digiuno sono stati monitorati a partire dal primo giorno postoperatorio.

Il rigetto si osserva intorno al giorno 17 nei topi riceventi di 20 grammi che hanno ricevuto 300 occhielli da un donatore allogenico Qui. Il recupero è stato monitorato nei topi che hanno ricevuto 150 occhielli o 300 occhielli da donatori singenici. In questo trapianto non si osserva alcun rigetto poiché gli occhielli provengono da donatori singenici.

La dose somministrata misura la funzione primaria degli occhielli immediatamente dopo il trapianto. Mentre un recupero marginale è stato osservato con 150 occhielli, il recupero completo è stato osservato quando sono stati trapiantati 300 occhielli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire i passaggi critici necessari per isolare gli occhielli di topo e trapiantare tali occhielli sotto lo spazio subcapsulare del rene.

Con la pratica, svilupperai la capacità di incannulare rapidamente il dotto biliare comune, che è il passaggio più difficile di questo protocollo.