Name: Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Impara l'isolamento di isole pancreatiche murine e il trapianto subcapsulare renale per studiare strategie terapeutiche contro il diabete di tipo 1. Questo metodo permette di valutare la funzione del trapianto monitorando la glicemia.

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<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Optom+Assoc%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li>
<li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes%3A+the+UIC+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li>
<li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+ATF3%2C+an+adaptive-response+gene%2C+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li>
<li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li>
<li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cyclosporin-A%2C+low-temperature+culture%2C+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li>
<li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li>
<li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li>
<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
<li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li>
<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nelle sezioni di cui sopra, abbiamo descritto la procedura dettagliata per l&#39;isolamento e trapianto delle isole pancreatiche del mouse. Qui, brevemente evidenziare i passaggi che sono critico per il successo delle procedure. 1. Isolotto isolamento I passi principali sono identificare un momento ottimale digestione enzimatica (1,4), il posizionamento della pinza emostatica sopra l&#39;apertura duodenale del dotto biliare comune (2.2.3), cannulating il dotto biliare comune (2,3), agitazione vigorosa del pancreas dopo i 37 ° C digerire (3,2), e la rimozione di contaminazione delle cellule esocrine (3.3.7 e 3.3.16). Questi passaggi hanno un influsso drammatico sulla qualità della resa, e la purezza di isolotti. Forse il punto tecnicamente più impegnativo è l&#39;incannulazione del dotto biliare comune. In molti topi, il dotto biliare comune possono essere difficili da visualizzare a causa della fascia circostante. Pertanto, è comune che i tentativi di cannulate il dotto biliare comune risultato in termini di penetrazione del tessuto fascia unica. In questi casi, il Liberase comincia a riempire il tessuto connettivo circostante e non profumato al pancreas. Se questa è osservato, fermare il flusso di Liberase e riposizionare l&#39;ago in modo che penetri nel lume del dotto biliare. Con la pratica, è possibile identificare velocemente la posizione ottimale per il posizionamento dell&#39;ago e per completare la cannulazione senza danneggiare il condotto friabile. 2. Trapianto di isole I passi fondamentali sono l&#39;induzione STZ di diabete (5,1) e la consegna efficiente delle isole nella busta subcapsulare (5.3.14-5.3.16). STZ è un analogo del glucosio naturale che è selettivamente tossica per le cellule che secernono l&#39;insulina β-cellule delle isole 9. Tuttavia, questa tossicità selettiva avviene in un intervallo di concentrazione relativamente ristretti. Ciò è dimostrato dal fatto che alte dosi di STZ può provocare un rapido (2-3 giorni) letalità in assenza di iperglicemia. Pertanto, occorre prestare attenzione per identificare la dose ottimale di STZ per il ceppo di topi e l&#39;età in uso prima di ogni esperimento su larga scala sono iniziati. La consegna fisica delle isole nella busta sottocapsulare è anche un passo fondamentale. Per ottenere risultati costanti, è indispensabile ridurre al minimo la perdita di isolotti nel corso della loro consegna. Ciò può verificarsi se ci sono difetti o rotture della capsula del rene che copre il sacchetto o se il volume iniettato è troppo grande. Danni alla capsula può essere evitato con la manipolazione dolce e attenta, e utilizzando la sonda vetro liscio per preparare il sacchetto sottocapsulare. Inoltre, il volume di iniezione può essere minimizzato con rimozione accurata del surnatante al punto 5.3.6.3. Se il surnatante viene rimosso fino al livello degli isolotti sedimentate, non vi è in genere più di spazio sufficiente nel sacchetto subcapsulari al posto 400-500 isolotti. Tuttavia, se il volume di iniezione è troppo grande, gli isolotti hanno maggiori probabilità di fuoriuscire il sacchetto durante il processo di trapianto, compromettendo la riproducibilità dell&#39;esperimento. All&#39;interno di questo protocollo, è possibile modificare alcuni dei passaggi e ottenere comunque risultati soddisfacenti. Questi includono: (a) l&#39;utilizzo di un enzima diverso per digerire il pancreas, (b) un metodo diverso per la consegna l&#39;enzima al pancreas, (c) l&#39;uso di un continuo Ficoll-sodio-diatrizoato (FSD) gradiente al posto del singolo densità Histopaque1077 passo, e (d) trapianto di isole pancreatiche in luoghi diversi dal subcapsule rene. <ol class="lalpha"><li> In questo protocollo, Liberase è usato per indebolire la cellula-cellula contatti all&#39;interno del pancreas. Liberase è essenzialmente una miscela altamente purificato di collagenasi che si sono dimostrati utili nel liberare isole dal pancreas. Tuttavia, collagenasi meno purificati sono in grado di realizzare un risultato simile. Pertanto, è possibile utilizzare diversi preparati enzimatici disponibili in commercio per digerire il pancreas, fino a quando la condizione di digestione è ottimizzato per ottenere una qualità elevata delle isole, la resa e la purezza. </li><li> E &#39;anche possibile per digerire il pancreas senza perfusione duttale di enzima. Consegna del Liberase attraverso il dotto biliare comune permette di esposizione massima di zona del pancreas superficie per l&#39;enzima. Ciò si traduce in più anche la digestione del pancreas e una maggiore rilascio di isolette intatte. Tuttavia, altre misure per aumentare la superficie del pancreas per l&#39;enzima può essere utilizzato. Per esempio, macinazione del pancreas prima incubazione in Liberase o direttamente iniettando Liberase attraverso la capsula pancreatica può essere utilizzato per isolare isolotti. Tuttavia, nessun altro metodo di consegna Liberase è efficace come perfusione attraverso il dotto biliare comune. Pertanto, macinazione o iniezione diretta dovrebbe essere riservato come ultima risorsa, se il dotto biliare comune è danneggiato e non perfusable. </li><li> Un metodo alternativo per separare gli isolotti dalle cellule esocrine comporta lal&#39;uso di un gradiente FSD Histopaque1077 invece di 10. La separazione efficiente di isolotti dalle cellule esocrine in questo protocollo è in parte dovuto ad una differenza di densità tra i due tipi di cellule. Histopaque1077 ha una densità di 1,0771 g / ml a 25 ° C. A questa temperatura, HISTOPAQUE è più densa gli isolotti, ma meno densa rispetto alle cellule esocrine. Pertanto, sotto la forza di centrifugazione, Histopaque1077 pellet le cellule esocrine mentre si solleva il isolotti in superficie. In linea di principio, qualsiasi altra sostanza con una densità che che può separare isolotti dalle cellule esocrine possono essere utilizzati in questo passaggio e il gradiente FSD è una sostanza del genere. </li><li> Per quanto riguarda la posizione per il trapianto di isole, la capsula del rene usati in questo protocollo è uno dei pochi siti possibili. Mentre il subcapsule rene è il luogo più comunemente riportati di trapianto nei topi, il trapianto di altri siti sono stati trovati per essere efficace e comprendono la vena porta epatica, spazio sottoretinico, del testicolo, dell&#39;epididimo cuscinetto adiposo, milza e pancreas anche 11-14. Ognuno di questi luoghi, ha i propri vantaggi e le sfide. Pertanto, la scelta di un sito per il trapianto di isole deve essere determinato dal questioni affrontate e le circostanze specifiche degli esperimenti. </li></ol> Si ritiene che le strategie che possono superare i limiti sul trapianto di isole drasticamente aumentare il suo potenziale terapeutico. Pertanto, l&#39;uso di un modello murino come descritto da questo protocollo offre un approccio interessante per identificare tali strategie.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque1077</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Reagente</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari di vetro</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per insulina</td><td>Attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa calibro 27</td><td>Attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton n. 1702</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 10 cm</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 6 cm</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgia 6-0</td><td>Attrezzatura</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>Tubulatura flessibile PE 50</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso da 5 ml</td><td>Attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 ml</td><td>Attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 ml</td><td>Attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Rete in nylon da 0,1 mm</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Rete metallica da 0,419 mm</td><td>Attrezzatura</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a bagnomaria</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Attrezzatura</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Attrezzatura</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Attrezzatura</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Attrezzatura</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>Forbici di McPherson-Vannas</td><td>Attrezzatura</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>Attrezzatura</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche</td><td>Attrezzatura</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizzatore per isoflurano</td><td>Attrezzatura</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga con rotor a cestello oscillante</td><td>Attrezzatura</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>Rotor a cestello oscillante</td><td>Attrezzatura</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Attrezzatura</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td>Punte per caricamento gel</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>Punte p200</td><td>Attrezzatura</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo per isolamento islet murini e trapianto renale subcapsulare

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Dal momento che i primi lavori pionieristici di Ballinger e Reckard dimostrando che il trapianto di isole di Langerhans in roditori diabetici potrebbe normalizzare i loro livelli di glucosio nel sangue, il trapianto di isole è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1 1,2. Più recentemente, i progressi nella trapianto di isole umane hanno ulteriormente rafforzato questa visione 1,3. Tuttavia, due limitazioni principali impediscono il trapianto di isole ad essere una realtà diffusa clinico: (a) la necessità di un gran numero di isolotti per paziente, che riduce fortemente il numero dei potenziali destinatari, e (b) la necessità di immunosoppressione pesante, che colpisce in modo significativo la popolazione pediatrica di pazienti a causa della loro vulnerabilità a lungo termine immunosoppressione. Strategie che possono superare questi limiti hanno la potenzialità di migliorare l&#39;utilità terapeutica del trapianto di isole. Trapianto di isole sotto la capsula renale mouse è un modello ampiamente accettato di studiare strategie diverse per migliorare il trapianto di isole. Questo esperimento richiede l&#39;isolamento delle isole di alta qualità e l&#39;impianto di isolotti ai destinatari diabetica. Entrambe le procedure richiedono operazioni chirurgiche che possono essere meglio dimostrato dal video che per il testo. Qui, documentano la procedura dettagliata per queste procedure sia da video e protocollo scritto. Abbiamo anche brevemente il trapianto di modelli diversi: singenico, allogenico, autoimmuni singenici, e allogenico autoimmuni.

Trapianto di isole isolate è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Qui si descrive un metodo per isolare le isole dal pancreas del mouse e trapiantarle allo spazio sottocapsulare del rene.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

A partire dai primi lavori pionieristici di Ballinger e Reckard, che hanno dimostrato come il trapianto di isolotti di Langerhans in roditori diabetici potesse normalizzare...

Il trapianto di isolotti pancreatici &egrave; stato proposto come un possibile trattamento per il diabete di tipo 1. Tuttavia, due limitazioni principali ne impediscono l'adozione diffusa nella pratica clinica. In primo luogo, &egrave; necessario un numero elevato di isolotti per ogni ricevente.Poiché le isole pancreatiche vengono ottenute da donatori d'organo, il numero di potenziali riceventi è fortemente limitato. Il trapianto di seconda intenzione richiede un trattamento a vita con potenti immunosoppressori, esponendo il paziente, in particolare la popolazione pediatrica, al rischio di neoplasie, infezioni e insufficienza renale. Il trapianto di isole pancreatiche sotto la capsula renale del topo viene effettuato per studiare strategie volte a migliorare gli esiti clinici del trapianto.Occhietti isolati da topi donatori sani, suddivisi in gruppi e preparati per il trapianto. Gli occhietti vengono quindi trapiantati nello spazio sottocapsulare del rene. In topi riceventi diabetici, la funzionalità dell'innesto di occhietti viene valutata monitorando i livelli di glucosio nel sangue, i quali mostrano che circa 250-350 occhietti ripristinano la glicemia normale in un topo ricevente di 20 grammi entro 24 ore dal trapianto.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per i passaggi relativi alla cannulazione. Il dotto biliare comune e il trasferimento degli occhielli nello spazio sottocapsulare del rene sono difficili da apprendere. Questi passaggi richiedono l'identificazione delle strutture tissutali, mano ferma e l'uso di una tecnica che minimizzi i danni ai tessuti.Posizionare un topo eutanasizzato in posizione supina su un tovagliolo di carta sotto la lente di dissezione e spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Utilizzare le forbici per aprire l'addome con un'incisione a V dalla regione pubica fino alle zampe anteriori. Il topo si trova al di sotto della lente di dissezione.Posizionarlo con la testa rivolta verso l'osservatore. Individuare l'ingresso duodenale del dotto biliare comune mediante una pinza emostatica, ovvero l'apertura duodenale del dotto biliare comune. La pinza emostatica deve essere posizionata in modo tale che, quando compressa, si allinei esattamente lungo il margine tra pancreas e intestino.Qui verranno dimostrati due metodi per cannuilare il dotto biliare. Il metodo con mano libera e il metodo con assistenza di pinze per cannuilare il dotto biliare. Utilizzando il metodo con mano libera, tirare con l'emostatico fissato sul duodeno lontano dalla testa del topo verso la coda in modo che il dotto biliare comune diventi teso.Esiste una confluenza nel dotto biliare in prossimità del fegato, dove la bile proveniente dalla cistifellea e gli enzimi provenienti dal fegato si uniscono. Prima che la bile entri nell'intestino, tendere il dotto biliare per esporre l'interno della conformazione a V. Utilizzare un ago da 27 gauge piegato, collegato a una siringa da cinque millilitri, in modo che l'ago penetri esattamente attraverso la V e cannuli direttamente la porzione inferiore del dotto. Far scorrere l'ago di alcuni millimetri oltre la fine della bisellatura per prevenire il reflusso verso il fegato e la cistifellea.Una volta completata con successo la cannulazione, perfondere il pancreas erogando due millilitri di liasi dalla siringa. Osservare l'espansione del pancreas sopra lo stomaco come indicazione di una cannulazione ottimale. In alternativa, è possibile cannulare il dotto biliare.Utilizzando il metodo della cisti con pinzetta. Tirare l'emostatico C fissato sul duodeno lontano dalla testa del topo verso la coda, in modo che il coledoco si tenda. Quindi, utilizzando un ago curvato da 27 gauge collegato a una siringa da cinque millilitri, perforare la fascia al di sotto del coledoco vicino al fegato.Usare l'ago per rimuovere la fascia dal dotto con l'ago ancora in posizione. Appoggiare l'emostatico e prendere un paio di pinze. Utilizzare un braccio delle pinze aperte per sostenere il dotto biliare nel punto in cui l'ago ha rimosso la fascia, tirando contemporaneamente il dotto e le pinze in avanti.Fare scivolare l'ago nel dotto utilizzando la pinzetta come appoggio posteriore. Una cannulazione riuscita è indicata da un espansione uniforme della regione del pancreas situata sopra lo stomaco. Una volta che il pancreas è stato perfuso, rimuovere l'emostatico dal duodeno.Quindi utilizzare la pinzetta per sollevare il duodeno e usare una seconda pinzetta per separare il pancreas dall'intestino. Successivamente, staccare il pancreas dalla parte superiore dello stomaco e dalla milza. Infine, sollevare il pancreas dall'addome e reciderlo dai rimanenti collegamenti fasciali con l'intestino, lo stomaco e la milza.Posizionare il pancreas in un tubo conico da 50 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Incubare il pancreas a 37 gradi Celsius seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato. Dopo l'incubazione, aggiungere 20 millilitri di mezzo ai tubi e dissociare il tessuto agitando vigorosamente i tubi 40 volte in 10 secondi.Questo passaggio è fondamentale per un recupero ottimale delle viole. Centrifugare le cellule a 800 giri al minuto. Risospendere in 15 millilitri di mezzo e concentrare i campioni.Versare la sospensione attraverso un setaccio in filo metallico da 0,419 millimetri e convogliarla in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare il primo tubo con ulteriori 10 millilitri di mezzo contenente il 10% di siero fetale bovino e versare il liquido attraverso il setaccio in filo metallico. Pellettizzare le cellule mediante centrifugazione, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di His opaque 10 77 a temperatura ambiente. Vortexare delicatamente per alcuni secondi, aggiungere ulteriori cinque millilitri di His opaque lungo la parete interna del tubo per lavare le cellule dalle pareti del tubo. Pipettare lentamente per sovrapporre 10 millilitri di RPMI privo di siero lungo la parete del tubo a una velocità di un millilitro ogni 10 secondi.Deve essere evidente un'interfaccia netta. Successivamente, centrifugare i campioni in una centrifuga con rotor a cestello oscillante a 20 gradi Celsius e 900 volte la forza di gravità per 20 minuti, con accelerazione molto lenta e senza frenata al termine della centrifugazione; le isole verranno separate dalle cellule esocrine utilizzando una pipetta sierologica monouso da 10 millilitri. Trasferire le isole dall'interfaccia del mezzo histo Paque a un nuovo tubo conico da 50 millilitri.È possibile raggruppare diversi tubi a questo punto per rimuovere i residui di anellini, riempire i tubi opachi con mezzo contenente siero e pelletizzare le isole centrifugando i tubi per due minuti a 800 giri al minuto. Successivamente, risospendere le isole in mezzo fresco. Ripetere questo passaggio almeno due volte.Sospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo. Posizionare un filtro in nylon da 0,1 millimetri al contrario su un tubo conico da 15 millilitri. Pipettare la sospensione cellulare attraverso il filtro per raccogliere gli anellini.Quindi risciacquare il tubo da 50 millilitri con ulteriori sei millilitri di mezzo e farli passare attraverso il filtro. Posizionare una goccia di mezzo da tre millilitri in una piastra di Petri da 10 centimetri. Capovolgere il filtro cellulare e immergerlo nella goccia di mezzo per raccogliere gli inserti; pipettare ulteriori cinque-sette millilitri di mezzo di coltura attraverso il filtro nella piastra di Petri.Per raccogliere eventuali anelli rimanenti dal setaccio sotto un obiettivo 4x, prelevare gli anelli singolarmente con una pipetta P200 e trasferirli in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Queste immagini mostrano anelli isolati da topi C57BL/6 di 12 settimane. La purezza e la qualità degli anelli possono essere stimate al microscopio al termine della procedura di isolamento.Ad esempio, le due immagini mostrate qui riportano un campo rappresentativo in cui sono presenti detriti e contaminazione da cellule esocrine. Quando si selezionano gli isolotti per un esperimento, evitare di raccogliere cellule esocrine contaminanti o isolotti che appaiono non sani. Gli isolotti con centri necrotici sono non sani, come mostrato in questa figura scattata 24 ore dopo l'isolamento; i centri necrotici non saranno visibili immediatamente dopo l'isolamento.Le occhielli costituiti da cellule in desquamazione sono inevitabili e possono essere utilizzati nel trapianto di occhielli, come mostrato in questo video con lapse temporale di 24 ore. Immediatamente dopo l'isolamento, si sviluppano centri necrotici all'interno di molti occhielli. Verso la fine della registrazione, durante la selezione degli occhielli, questi centri necrotici sembrano essere espulsi dall'occhiello.Raggrupparli in modo che ogni tubo presenti una distribuzione uniforme di qualità e dimensioni degli occhielli. Ad esempio, ogni gruppo di 15 occhielli potrebbe contenere quattro occhielli di dimensioni grandi, sei occhielli medi e cinque piccoli. Posizionare il tubo sul ghiaccio; gli occhielli possono essere utilizzati immediatamente per il trapianto o manipolati.Prima dell'uso, inserire una punta sterile per caricamento gel nell'apertura di una provetta microfusa da 1,5 millilitri in modo da formare una curva leggera, che crei una forma a U nell'estremità stretta della punta. Entrambe le aperture della punta devono essere rivolte direttamente verso l'alto, fuori dalla provetta microfusa.Rimuovere delicatamente un tubo di occhielli dal ghiaccio. Assicurarsi che tutti gli occhielli si siano depositati sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta P200, raccogliere delicatamente gli occhielli in un volume minimo dal fondo del tubo e trasferirli sulla punta curva preparata.Dopo che gli occhielli si sono sedimentati, rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo aspirandolo attraverso l'apertura larga dell'estremità per caricamento gel contenente gli occhielli, utilizzando una nuova estremità per caricamento gel collegata a una pipetta P200. Collegare l'estremità non smussata del tubo all'apertura stretta dell'estremità per caricamento gel contenente gli isolotti. Quindi fissare l'estremità alla pipetta P200 e spingere delicatamente gli isolotti all'interno del tubo.Successivamente, collegare il bordo non smussato del tubo PE 50 all'ago di una siringa Hamilton da 25 microlitri. Con lo stantuffo ritratto, premere lo stantuffo della siringa finché gli occhielli si trovino a circa 0,5 centimetri dall'apertura smussata. Mettere da parte la siringa in modo che gli occhielli possano accumularsi in un unico ammasso vicino all'apertura smussata del tubo, mentre il rene viene preparato per ricevere gli occhielli.Preparare il sito chirurgico tagliando i peli e strofinando la pelle con Betadine alternato ad alcol isopropilico al 70% per tre volte. Iniziare la procedura di trapianto dell'occhiello eseguendo una pinzatura del dito del piede per confermare l'anestesia nel topo ricevente. Posizionare l'asta di una bacchetta di vetro direttamente sotto il topo e al di sotto del rene, perpendicolarmente al midollo spinale.Quindi individuare il rene attraverso la cute e posizionare un campo chirurgico sterile. Una volta localizzato il rene, utilizzare forbici McFerson banis per praticare un'incisione di due centimetri attraverso il derma direttamente al di sopra di esso, perpendicolarmente al midollo spinale. Questa incisione esporrà la parete peritoneale con le forbici.Eseguire un'incisione di un centimetro attraverso la parete peritoneale nella stessa direzione del taglio attraverso lo strato dermico, utilizzando l'asta della bacchetta di vetro come appoggio; far fuoriuscire il rene attraverso l'apertura peritoneale premendo sulla superficie adiacente. Inumidire la superficie del rene esposto con PBS sterile e freddo su ghiaccio utilizzando un applicatore di cotone imbevuto. Ripetere l'operazione ogni pochi minuti secondo necessità per evitare che la capsula renale si secchi.Utilizzando un ago da 27 gauge, praticare un'incisione di 0,2 centimetri attraverso la capsula renale lungo la superficie anteriore del rene. Partendo dal lato laterale sinistro verso il lato laterale destro, inserire un capillare di vetro tirato a fiamma. Introdurre il capillare nell'incisione precedentemente effettuata e spostarlo in direzione posteriore lungo la superficie laterale dorsale del rene.Per creare una tasca tra la capsula renale e il parenchima renale, posizionare le asole della siringa Hamilton da 25 millilitri preparata fino all'estremit&agrave; dell'apertura smussata del tubo flessibile. Inserire quindi il bordo smussato con la parte inclinata rivolta verso l'alto nella tasca sottocapsulare. Il bordo pi&ugrave; lungo &egrave; a contatto con il parenchima renale.Spostare la provetta all'estremità più posteriore della capsula. Quindi trasferire lentamente gli anellini dalla provetta PE 50 nella tasca sottocapsulare premendo lo stantuffo della siringa. Mentre gli anellini riempiono la tasca, ritirare lentamente la provetta flessibile per creare più spazio.Dopo aver rimosso il tubo dalla borsa, far scorrere la sonda di vetro lungo la superficie esterna del rene, dalla parte anteriore a quella posteriore, per inserire delicatamente gli occhielli nell'estremit&agrave; prossimale della borsa. Utilizzando pinze con braccio piegato, sollevare il rivestimento peritoneale adiacente all'apertura praticata per il rene. Quindi usare un applicatore di cotone imbevuto di PBS per spingere delicatamente il rene all'interno della cavit&agrave; peritoneale.Chiudere la cavità dell'animale applicando punti di sutura alla parete peritoneale e clip da ferita allo strato dermico. Restituire il topo alla sua gabbia e monitorarlo. Per il recupero, fornire acqua con acetomine per l'intestino del topo.Occhioli di mouse C isolati. Utilizzando i metodi descritti in questo video, è stata trapiantata una dose curativa in topi allogenici C57 Black Six. I livelli di glucosio nel sangue non a digiuno sono stati monitorati a partire dal primo giorno postoperatorio.Il rigetto si osserva intorno al giorno 17 in topi riceventi di 20 grammi che hanno ricevuto 300 occhielli da un donatore allogenico. Qui è stato monitorato il recupero in topi che hanno ricevuto 150 o 300 occhielli da donatori sinnigenici. Nessun rigetto è osservato in questi trapianti poiché gli occhielli provengono da donatori sinnigenici.La dose di campanule somministrata misura la funzione primaria delle campanule immediatamente dopo il trapianto. Mentre si è osservato un recupero marginale con 150 campanule, si è assistito a un recupero completo quando sono state trapiantate 300 campanule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire i passaggi fondamentali necessari per isolare le campanule del topo e trapiantarle nello spazio sottocapsulare del rene.Con la pratica, svilupperete la capacità di cannuccolare rapidamente il dotto biliare comune, che è il passaggio più difficile di questo protocollo.

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Il nostro protocollo è stato sviluppato per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi. Le cellule sono concentrate in pellet nel tubo finale utilizzato per il trapianto delle cellule sotto la capsula renale. La facilità di questa tecnica riduce lo stress per le cellule e il mouse.

Il trapianto di isole pancreatiche nella capsula renale di topi diabetici

Trapianto renale nei topi è una procedura tecnicamente impegnativo, che richiede un'attenta assistenza post-operatoria e terapia per il successo.

Murino procedura trapianto renale

In questo video, descriviamo una procedura per infondere cellule delle isole pancreatiche nella vena porta epatica, seguita dall'applicazione di schiuma di gel per prevenire con successo il sanguinamento. Il sanguinamento postoperatorio è una causa comune di elevata mortalità durante il trapianto di isole.

Modello murino di trapianto di isole: un metodo chirurgico per infondere le isole pancreatiche nella vena porta e prevenzione del sanguinamento postoperatorio

Un nuovo approccio che combina il trapianto intraoculare e la microscopia confocale permette longitudinale, non invasivo imaging in tempo reale con singola cella di risoluzione all'interno di tessuti...

Trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio per longitudinale, non invasiva<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging con Single-cella di risoluzione in tempo reale

L'obiettivo di questo manoscritto è descrivere i passaggi necessari per eseguire un trapianto di rene in un topo, prestando particolare attenzione ai dettagli dell'anastomosi arteriosa.

Rene Murine Tecnica trapianto

Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

È stato introdotto un metodo per il trapianto omentale di isolotti in un mouse. Gli isolotti isolati sono mescolati con idrogel e la miscela viene inserita nel sacchetto omentale di un topo diabetico. Quindi, il glucosio nel sangue è controllato e viene eseguita l'analisi immuno-istochimica.

Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Forniamo un metodo semplice ed efficiente per trapiantare 2'-deossiguanosina trattata E18.5 tiromusnella capsula renale di un topo nudo. Questo metodo dovrebbe aiutare nello studio sia della funzione epiteliale timica che della maturazione delle cellule T.

Trapianto di subcapsulare renale di 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi

In questo protocollo, viene descritto un metodo di isolamento murine ilet e trapianto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale. Le isole di murine singeniche isolate vengono trapiantate in un recipiente murino utilizzando un idrogel di membrana sotterranea. Viene monitorato il livello di glucosio nel sangue dei destinatari e viene eseguita l'analisi istologia degli innesti di islet.

Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Impara l'isolamento di isole pancreatiche murine e il trapianto subcapsulare renale per studiare strategie terapeutiche contro il diabete di tipo 1. Questo metodo permette di valutare la funzione del trapianto monitorando la glicemia.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

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