Name: Due tecniche per creare Mice Hypoparathyroid: paratiroidectomia Uso GFP Ghiandole ed difterite-tossina-Mediated paratiroideo Ablazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri due tecniche per creare modelli murini di ipoparatiroidismo acquisito mediante paratiroidectomia guidata da GFP e tossina difterica. Questi metodi preservano la funzione tiroidea e permettono di studiare nuove terapie con analoghi del PTH.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH concede R01-DK100584 e Cina Stato chiave Laboratorio di malattie orali aperta finanziamento SKLOD2015OF01 (RB). Ringraziamo Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, e Kelly Lauter aiuto.

Questo studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del Massachusetts General Hospital. Ottenere l&#39;approvazione istituzionale adeguato per questo studio sugli animali prima di iniziare. Alcune tecniche potrebbero dover essere regolata in base alle esigenze IACUC locali. 1. I topi GFP-PTX <ol><li> Ottenere topi PTHcre + e topi Rosa-mTmG a 8 - 10 settimane per un ulteriore accoppiamento. </li><li> Backcross le PTHcre + topi (mixed 129; FVB sfondo) con C57BL 6 topi / da 6 generazioni di ottenere topi con C57BL / 6 sfondo. </li><li> Topi Inbreed PTHcre + per ottenere PTHcre + / + 17 topi. NOTA: Per eseguire la genotipizzazione, estrarre il DNA dalla punta della coda e usarlo per PCR. I primer PCR per verificare la presenza di eterozigosi e omozigosi del transgene PTHcre sono i seguenti: Forward Primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, invertire innesco A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, fORIZZONTE Primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, invertire Primer B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Croce PTHcre + / + topo 16 con Rosa-mTmG topi 18. Svezzare PTHcre; cuccioli mTmG quando 4 settimane di vita. </li><li> Anestetizzare 8 - 10 settimane PTHcre; topi mTmG mediante iniezione ip di tribromoethanol (Avertin) a 0,6 mg / g di peso corporeo, o altri agenti come ketamina / xylazina. Utilizzare buprenorfina 0,1 mg / kg sc ogni 12 h come analgesico per 48 ore dopo l&#39;intervento secondo un protocollo approvato. Garantire un&#39;adeguata profondità dell&#39;anestesia dal riflesso punta pizzico ritiro o altri mezzi. Posto l&#39;animale in posizione supina. </li><li> Estendere e preparare la regione ventrale del collo con la rasatura della pelle utilizzando lame singolo bordo. Disinfettare la pelle rasata con un tampone antisettico povidone iodio. </li><li> Coprire l&#39;animale con teli chirurgici sterili per ridurre la contaminazione del sito chirurgico e utilizzare il microfono autoclavatostrumenti rosurgical per la procedura chirurgica. </li><li> Tagliare un&#39;incisione di 2 cm longitudinale nella pelle con un bisturi chirurgico. Sezionare fascia e spingere le ghiandole salivari a lato per via smussa con pinze dentellate curve. </li><li> Sotto il microscopio dissezione con luce alogena e un 4 - di ingrandimento 5X, tagliare e separare i muscoli paratracheali con pinze taglienti suggerimenti ed esporre la trachea. </li><li> Identificare la ghiandola tiroidea con il destro e sinistro del lobo situato accanto alla trachea. </li><li> Accendere la sorgente di luce a luce fluorescente e visualizzare le due ghiandole paratiroidi verdi fluorescenti. NOTA: Tipicamente, i due ghiandole paratiroidee sono situati in corrispondenza o in prossimità della superficie delle ghiandole tiroidee, ma occasionalmente, si trovano più lontano. </li><li> Rimuovere con attenzione le ghiandole paratiroidi verdi con pinze chirurgiche e forbice. Utilizzare garza sterile per l&#39;emostasi e controllare attentamente lungo la trachea per garantire che tutti i tessuti verde è stato rimosso. </li&gt; <li> Chiudere i muscoli paratracheali da sutura interrotta utilizzando 6-0 Polyglactin 910 punti di sutura. Chiudere l&#39;incisione cutanea da Halsted sutura utilizzando 6-0 Polyglactin 910 punti di sutura. </li><li> Opzionale: Iniettare 10 ml / g di peso corporeo normale sterile 0,9% soluzione di cloruro di sodio per i topi per la sostituzione del fluido. </li><li> Posizionare animali postchirurgici ad una gabbia separato su un incubatore calda (37 ° C) per il recupero della temperatura corporea. Una volta che i topi sono svegli e nella posizione reclinata, mettere pellet chow e acqua con cibo gelatina sul pavimento della gabbia. </li><li> Dopo un periodo di osservazione post-chirurgica di 2 h, tornare mouse per l&#39;impianto animale e seguire le disposizioni locali per la cura post-chirurgica. </li><li> 3 giorni dopo paratiroidectomia, ottenere il sangue coda 10 ml e misurare ionizzato Ca ++ utilizzando un analizzatore di sangue, come il sistema di gas del sangue Ca ++ analizzatore / pH. Risultati paratiroidectomia successo nel sangue ionizzati Ca ++ uguale o inferiore a -2SD di sham-operated contopi trollo (1,20 mmol / L nei nostri esperimenti di n = 30). </li></ol> 2. PTH-Cre-IDTR Mice <ol><li> Ottenere PTHcre + e DTR fl / fl topi a 8 - 10 settimane di vita per l&#39;accoppiamento. </li><li> Backcross i topi PTHcre (misti 129; FVB sfondo) con C57BL 6 topi / da 6 generazioni di ottenere topi con C57BL / 6 sfondo. </li><li> Inbreed il PTHcre + (C57BL / 6 sfondo) topi per ottenere PTHcre + / + 17 topi. NOTA: Per eseguire la genotipizzazione, il DNA di topi punte di coda è stato estratto e utilizzato per la PCR. Primer di genotipizzazione: Forward Primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, invertire innesco A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, Forward Primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, invertire Primer B&#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Mate PTHcre + / + topo 16 con DTR fl / fl topi 19 per ottenere topi PTHcre-IDTR. </li><li> Preparare la soluzione DT diluendo diphtheriuna polvere tossina con soluzione salina sterile ad una concentrazione di 0,5 mg / mL. filtro sterile, e memorizzare aliquote a -80 ° C. </li><li> Scegli 8 - 10 settimane i topi PTHcre-IDTR per esperimento iniezione. Scongelare DT un&#39;aliquota a temperatura ambiente, amministrare DT intraperitoneale a 5 mg / kg (10 ml / g) di peso corporeo dell&#39;animale. Per l&#39;efficienza massima e almeno tossicità, amministrazione DT viene ripetuta per un totale di 2 iniezioni in un intervallo di 3 giorni 17. </li><li> 3 giorni dopo la seconda iniezione, prendere 10 microlitri di sangue coda da ogni PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG mouse e misurare Ca ++ sangue utilizzando un sistema Emogasanalisi Ca ++ analizzatore / pH. NOTA: Definiamo topi con sangue ionizzati Ca ++ inferiore a 1,18 mmol / L come topi hypoparathyroid, che equivale 2SD al di sotto della media dei topi di controllo dei veicoli a iniezione (n = 22). </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Dimostriamo la tecnica della paratiroidectomia GFP-guidato utilizzando topi transgenici con espressione GFP selettivamente nelle ghiandole paratiroidi. Nei PTHcre; topi mTmG, il doppio di fluorescenza (GFP verde nelle cellule Cre-espresse e rosso pomodoro in non-Cre espresso cellule) ci ha permesso di identificare con chiarezza, e di rimuovere con precisione tutte le ghiandole paratiroidee senza rimuovere le tiroide. Mentre noi preferiamo l&#39;uso dei topi mTmG doppio fluorescenza per la capacità di identificare il tessuto non paratiroideo rosso fluorescente, la nostra procedura dovrebbe funzionare bene anche con gli animali fluorescenti singoli, come il rosso del pomodoro (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) HZE / J) del mouse. La procedura è relativamente facile da eseguire, richiede circa 20 minuti per topo, e si traduce in una grave e sostenuta fenotipo hypoparathyroid. Inoltre, un altro vantaggio delle ghiandole paratiroidee GFP-positive è la facilità di rilevazione delle ghiandole paratiroidee aberranti. I nostri studi dimostranomislocalization delle paratiroidi in circa un quarto di topi B6 (Figura 1), che vengono facilmente rilevati nel nostro modello di topo dalla fluorescenza verde. Contrariamente a tiro-paratiroidectomia, la nostra tecnica evita la rimozione della tiroide con conseguente necessità di sostituzione dell&#39;ormone tiroideo e l&#39;effetto sconosciuta di rimozione della tiroide cellule C calcitonina produttrici. ghiandole paratiroidee fluorescente potrebbero essere utilizzati anche per altre indagini che richiedono l&#39;isolamento delle ghiandole paratiroidee. La limitazione di questo modello include il requisito per la chirurgia. sono richieste competenze microchirurgia base e un microscopio dissezione con una sorgente luminosa fluorescente. è dimostrata Una seconda tecnica per generare topi hypoparathyroid che elimina la necessità di un intervento chirurgico. Tossina difterica-topi trattati PTHcre-IDTR mostrano una lieve ipoparatiroidismo fenotipo, ma richiedono semplicemente l&#39;iniezione di DT per via intraperitoneale nel mouse. La parte critica FOR generando questo modello è stato l&#39;ottimizzazione della dose e regime di dosaggio. Alte dosi di DT ha portato alla tossicità ma basse dosi diminuito l&#39;efficacia di questo approccio. Abbiamo determinato che il reggimento dose di 2 iniezioni a 5 mg / kg, somministrata 3 giorni di distanza, ha provocato ipocalcemia affidabile e stabile senza / minimo la mortalità. In definitiva, ci auguriamo che questi due approcci forniscono modelli utili del mouse per ipoparatiroidismo acquisito. Utilizzando un romanzo PTH lunga durata d&#39;azione, abbiamo riportato il primo uso di entrambi questi modelli nel determinare l&#39;efficacia di nuovi farmaci per ipoparatiroidismo 17.

Dal momento che la prima descrizione sistematica delle ghiandole paratiroidi in umano e in diverse altre specie di Sandström nel 1880 1, comprendere il significato di questo piccolo organo endocrino per la fisiologia umana e la malattia ha continuamente migliorato. ghiandole paratiroidee secernono l&#39;ormone paratiroideo (PTH), il principale regolatore del metabolismo del calcio. PTH è anche un ormone importante per l&#39;omeostasi fosfato e turnover osseo 1, 2. Rimozione accidentale o danneggiamento delle paratiroidi durante l&#39;intervento chirurgico al collo è la causa più comune di ipoparatiroidismo, una malattia caratterizzata da bassi livelli di calcio nel sangue, bassi PTH, e fosforo elevati 1. Per una migliore studio acquisito ipoparatiroidismo e nuove terapie di prova, affidabili e facilmente sono necessari modelli di mouse accessibili. I topi sono ampiamente utilizzati nella ricerca perché una grande varietà di strumenti genetici sono unvailable in questa specie che permettono sofisticati studi meccanicistici in vivo. Tuttavia, mentre paratiroidectomia chirurgica (PTX) può essere utilizzato in ratti 2, 3, 4, 5, e mammiferi superiore 6, 7, 8, è tecnicamente molto impegnativo in topi a causa delle piccole dimensioni delle ghiandole e la loro distribuzione anatomica variabile 9. Pertanto, tiro-paratiroidectomia (TPTX) viene in genere eseguita in topi, in cui la tiroide e paratiroidi vengono rimossi insieme 10. Tuttavia, i bassi livelli di ormone tiroideo sono un potenziale fattore confondente in esperimenti, complicando questo modello. Inoltre, cellule C all&#39;interno della ghiandola tiroidea, che producono calcitonina, un ormone importante nella omeostasi del calcio nei roditori, sono anche perso dopo la rimozione dei thyroids 11. Diversi modelli genetici murini di ipoparatiroidismo esistono, che includono il mouse PTH-null 12, il mouse GCM2-null 13, e il mouse Nuf con una mutazione attivante del recettore sensibile al calcio (CaSR) 14, 15. Tuttavia, questi difetti genetici sono già presenti durante lo sviluppo embrionale, e la funzione delle paratiroidi è quindi già alterata durante l&#39;embriogenesi. Questo può influenzare lo sviluppo di organi, come lo scheletro. Questo contrasta con i pazienti con ipoparatiroidismo post-chirurgica che acquisiscono la malattia più tardi nella vita. Inoltre, alcuni di questi modelli di topo esibiscono mortalità precoce e riduzione della fertilità, il che complica ulteriormente il loro uso 12, 13, 14. Abbiamo sviluppato due nuovo mouse modelli per ipoparatiroidismo acquisito. Utilizzando topi geneticamente ingegnerizzati che esprimono GFP in particolare nelle paratiroidi permette alle ghiandole paratiroidee per essere facilmente identificati per la rimozione chirurgica senza rimuovere la ghiandola tiroidea. Questo mouse è stato generato attraversando il mouse PTH-Cre, che esprime Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore 5,5 kb PTH 16 con il mouse ROSA mTmG. I PTHcre risultanti; topi mTmG esprimono la proteina fluorescente verde specificamente in cellule paratiroidee. Il secondo modello di topo utilizza lo stesso PTH-Cre, questa volta per rimuovere una cassetta di STOP dal mouse inducibile DTR, con conseguente espressione del recettore tossina difterica specifico nelle paratiroidi. La somministrazione sistemica di DT distrugge le cellule paratiroidee, rendendo gli animali hypoparathyroid senza intervento chirurgico. I due modelli di mouse presentati in questo studio dimostrano un fenotipo hypocalcemic stabile negli peri di osservazione a tre mesiod. Le procedure sono facili da eseguire, il fenotipo è riproducibile, ed i topi hypoparathyroid presentano un alto tasso di sopravvivenza 17.

<table><tbody><tr><td>Topi ROSAmT/mG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7676</td><td></td></tr><tr><td>PTH-Cre topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5989</td><td></td></tr><tr><td>iDTRmice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>6-0 poliglactin 910 sutura con ago</td><td>Ethicon, Inc</td><td>J510G</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio di sicurezza a filo singolo</td><td>American Safety Razor Company</td><td>66-0089</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio di sicurezza monouso in piuma di bisturi</td><td>Co., LTD</td><td>72042-11</td><td></td></tr><tr><td>Pastiglie per la preparazione dello iodio povidone</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>Busse di garza</td><td>a strati. Inc</td><td>BHD707</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%</td><td>HOSPIRA Worldwide, Inc</td><td>07983-09</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 1 ml 29 g</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>Teli chirurgici per incisione</td><td>3M</td><td>6640EZ</td><td></td></tr><tr><td>Dumstar Pinza per biologia</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-4984</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla per micro dissezione</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>MILTEX., Inc</td><td>V98-42</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrometanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-2-Butanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td> Per sciogliere la polvere di tossina difterica <td>2,2,2-tribrometanolo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td>Sciogliere in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% a 1 mg/mL come soluzione madre in -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Provette capillari per la raccolta del sangue Multicap</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td> 855578 <td>Per la raccolta del sangue nell'analisi iCa2+ utilizzando RapidLab 348 Analizzatore Ca2+/pH</td><td></td></tr><tr><td>RapidLab 348 Ca2+/pH Analizzatore</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td>Per l'analisi iCa2+</td></tr></tbody></table>

due tecniche per creare mice hypoparathyroid: paratiroidectomia uso gfp ghiandole ed difterite-tossina-mediated paratiroideo ablazione

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

L'ipoparatiroidismo (HP) è un disturbo caratterizzato da bassi livelli di PTH che portano a ipocalcemia, iperfosfatemia e basso turnover osseo. La causa più comune della malattia è la rimozione accidentale delle ghiandole paratiroidi durante la chirurgia della tiroide. Sono necessarie nuove terapie per l'HP, ma la loro sperimentazione richiede modelli animali affidabili di HP acquisita. 
Qui, dimostriamo la generazione di due modelli murini di HP acquisiti. Nel modello GFP-PTX, i topi con proteina fluorescente verde (GFP) espressa specificamente nelle paratiroidi (PTHcre-mTmG) sono stati creati incrociando topi PTHcre+ con topi Rosa-mTmGfl/fl. Le ghiandole paratiroidi fluorescenti verdi sono facilmente identificabili al microscopio da dissezione a fluorescenza e la paratiroidectomia viene eseguita in meno di 20 minuti. Dopo la chirurgia guidata dalla fluorescenza, i topi sono profondamente ipocalcemici. Contrariamente alla tradizionale tireo-paratiroidectomia, questo preciso approccio chirurgico lascia intatte le ghiandole tiroidee e la funzione tiroidea. Il secondo modello, che non richiede un intervento chirurgico, si basa su un approccio difterite-tossina. I topi PTHcre-iDTR, che esprimono il recettore della tossina difterica (DT) specificamente nelle paratiroidi, sono stati generati incrociando il topo DTR inducibile con il topo PTHcre. Le cellule paratiroidi sono quindi rese sensibili alla tossina difterica (DT) e possono essere distrutte selettivamente iniettando sistemicamente nei topi DT. Il fenotipo ipocalcemico risultante è stabile.

Location della paratiroideo Ghiandole In primo luogo, abbiamo registrato la distribuzione delle ghiandole paratiroidi di 54 topi PTHcre-mTmG come osservato al microscopio a fluorescenza dissezione. 74% (40/54) topi aveva due ghiandole paratiroidi verdi (Figura 1A, C, E), 26% (14/54) topi ha avuto un ulteriore terzo ghiandola paratiroidea (Figura 1B, D, F). Non sono state osservate mouse con una sola ghiandola o più di tre ghiandole. Di solito, ghiandole paratiroidi si trovavano vicino al confine superiore della ghiandola tiroidea (58%, 71/122, la figura 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) ghiandole erano situate vicino al bordo inferiore della ghiandola tiroidea (Figura 1C (1), D (3), F (1)), e il 13% (16/122) sono stati trova lontano dal tghiandola hyroid (Figura 1B (3), E (1), F (2)). I nostri risultati sono coerenti con precedenti ed estendere i risultati di varie posizioni delle ghiandole paratiroidi 20. I topi GFP-PTX L&#39;intero intervento chirurgico da anestesia per chiudere l&#39;incisione cutanea ha preso circa 20 minuti per ogni mouse. Il tasso di sopravvivenza dei topi post-chirurgiche nel corso di un periodo di osservazione di 3 mesi è stata del 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) topi GFP-PTX esposti i livelli di calcio ionizzato che erano 2 DS al di sotto della media dei topi di controllo sham o inferiore. Il fenotipo hypoparathyroid nei topi GFP-PTX (ipocalcemia, basso PTH e di fosfato elevata) è rimasto stabile per tutto il periodo di osservazione di 3 mesi. È importante sottolineare che la funzione tiroidea non era diverso dagli animali sham-operati 3 mesi dopo l&#39;intervento (TSH = 42 ± 24 vs 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 3.0 ± 0,6 contro 3,1 ± 0,9 mg / dL, p = 0,707 (Figura 2). PTH-cre-IDTR Mice DT iniettato topi PTH-Cre-IDTR ipoparatiroidismo sviluppato (calcio nel sangue basso ionizzato, elevata di fosforo nel sangue, e inappropriatamente basso normali livelli di PTH). Abbiamo precedentemente riportato che le cellule positive pochi PTH sfuggire l&#39;ablazione con tossina difterica, spiegando il misurabile circolante PTH e quindi la un po &#39;più mite fenotipo di questi topi 17. Ipoparatiroidismo nei topi GFP-PTX e PTH-cre-IDTR Mice Sono state osservate significative riduzioni di Ca ++ nel sangue e livelli di PTH sierici di GFP-PTX topi 3 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico, rispetto ai livelli trovati in topi sham (Ca ++ = 1.05 ± 0.40 vs. </em&gt; 1.30 ± 0.03 mmol / L, p &lt;0.05; PTH = 32 ± 22 vs 580 ± 137 pg / mL, p &lt;0,05). Il fenotipo ipoparatiroidismo è rimasta stabile nel corso del periodo di osservazione a 3 mesi (Figura 3A, ristampato con il permesso (riferimento # 17)). Dopo 2 iniezioni di 5 mg / kg DT ad intervalli di 3 giorni, la dose e il regime ottimizzato per utilizzare la quantità minima di DT per dare il fenotipo hypoparathyroid massima, il DT iniettato topi-IDTR PTH-cre mostrato ipocalcemia significativa e ridotta PTH rispetto ai topi di controllo del veicolo, che persistevano nel corso del periodo di osservazione di 90 giorni (Ca ++ = 1.10 ± 0.07 mmol / L vs 1.26 ± 0.05 mmol / L, p &lt;0.05; PTH = 218 ± 156 pg / mL vs 572 ± 164 pg / mL, p &lt;0,05) (Figura 3B, ristampato con il permesso (riferimento # 17)). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; rappresentativi immagini delle varie località del paratiroidi in 54 topi PTHcre-mTmG sotto fluorescente dissezione microscopio. I topi aveva uno due (A, C, E) o tre (B, D, F) ghiandole paratiroidee verdi. La maggior parte delle ghiandole paratiroidi si trovavano vicino al confine superiore (A (1,2), B (1,2), (2) C, D (1,2), E (2), F (3) o in prossimità del bordo inferiore della ghiandola tiroidea (C (1), D (3), F (1)). In rari casi, alcuni sono stati trova ectopica (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> Figura 2: TSH e T4 Livello di topi GFP-PTX. 3 mesi dopo la GFP-PTX, il siero è stato ottenuto per il TSH e T4 measurem<html> Ent. GFP-PTX topi hanno mostrato concentrazioni di TSH (42 ± 24 mU / L) concentrazioni di (A) e T4 (3,0 ± 0,6 mg / dL) (B) che non erano differenti da topi di controllo (TSH = 30 ± 15 mU / L, P = 0,171, n = 11, T4 = 3.1 ± 0.9, p = 0,707, n = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> Figura 3: Blood Ca ++ e livelli di PTH nei topi GFP-PTX e DT per colata PTH-cre-IDTR topi. Entrambi i topi GFP-PTX (A) e DT iniettati PTH-cre-IDTR topi (B) esposto ipocalcemia stabile e ridotti livelli di PTH oltre 3 mesi periodo di osservazione (N = 6-8, *** p &lt;0,001) (ristampato con il permesso di riferimento # 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I topi con ipoparatiroidismo acquisito sarebbero utili per studiare nuove terapie farmacologiche per l'ipoparatiroidismo. Vengono dimostrate due procedure per creare tali topi. Il topo GFP-PTX è generato mediante paratiroidectomia chirurgica guidata da ghiandole paratiroidi fluorescenti verdi. Un secondo approccio, non chirurgico, si basa sull'espressione paratiroidea specifica del recettore della tossina difterica.

Due tecniche per creare Mice Hypoparathyroid: paratiroidectomia Uso GFP Ghiandole ed difterite-tossina-Mediated paratiroideo Ablazione

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare due modelli murini di ipoparatiroidismo acquisito facili da utilizzare, che producano un fenotipo stabile e che lascino intatta la funzione tiroidea. Il principale vantaggio di questi due modelli è che permettono la rimozione precisa delle paratiroidi nei topi, sia mediante chirurgia guidata da fluorescenza, sia sfruttando l'espressione specifica dell'ormone paratiroideo (PTH) del recettore della tossina difterica, consentendo così di colpire in modo selettivo e distruggere le cellule senza interferire con la ghiandola tiroidea adiacente. Speriamo che i nostri modelli murini possano rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ipoparatiroidismo.Ad esempio, le terapie con analoghi della PTH possono aiutare a mantenere livelli normali di calcio sierico senza aumentare l'escrezione urinaria di calcio? Questi modelli possono essere utilizzati anche per studiare altre domande cliniche nell'ipoparatiroidismo. Ad esempio, la resistenza ossea è compromessa dall'ipoparatiroidismo e cambia con il trattamento?Domande di questo tipo sono difficili da rispondere nei pazienti, ma questi modelli murini possono essere utilizzati per affrontarle. Iniziare anestetizzando topi di otto-dieci settimane, che esprimono GFP specificamente nelle paratiroidi secondo un protocollo approvato. Posizionare l'animale in posizione supina e verificare un'adeguata profondità dell'anestesia attraverso l'assenza del riflesso di ritrazione alla pressione sulle dita dei piedi o con altri metodi.Estendere la regione ventrale del collo e prepararsi all'intervento chirurgico rasando il pelo. Disinfettare la cute rasata con una compressa antisettica a base di iodopovidone, quindi preparare il sito dell'incisione utilizzando una soluzione detergente chirurgica e un risciacquo con alcol, seguendo il protocollo approvato. Successivamente, coprire l'animale con teli chirurgici sterili per ridurre il rischio di contaminazione del sito operatorio.Dopo aver praticato un'incisione longitudinale di 2 centimetri con un bisturi chirurgico, utilizzare pinze curve e seghettate per dissezionare la fascia e spostare le ghiandole salivari lateralmente. Quindi, osservando il sito chirurgico attraverso un microscopio da dissezione, usare le punte di pinze affilate per tagliare e separare i muscoli paratraqueali ed esporre la trachea. Identificare i lobi destro e sinistro della ghiandola tiroidea situati accanto alla trachea.Quindi passare alla sorgente luminosa a luce fluorescente e visualizzare le due ghiandole paratiroidi fluorescenti verdi. I roditori hanno tipicamente solo due ghiandole paratiroidi. Se non si riescono a identificare le due ghiandole paratiroidi accanto alla tiroide su ciascun lato, si dovrebbe sospettare la presenza di ghiandole paratiroidi ectopiche, e andrebbe effettuata un'accurata ricerca lungo la trachea.Successivamente, utilizzare pinze chirurgiche e forbici per rimuovere con cura le ghiandole paratiroidi verdi e controllare attentamente lungo la trachea per assicurarsi che tutti i tessuti verdi siano stati rimossi. Utilizzare garza sterile per l'emostasi. Chiudere i muscoli paratracheali con punti di sutura interrotti.Chiudere l'incisione cutanea con punti di Halstead. Collocare l'animale post-chirurgico in una gabbia separata su un tappetino riscaldante per il recupero della temperatura corporea. Una volta che il topo è sveglio, posizionare sul fondo della gabbia mangime in pellet, acqua e cibo con gelatina.Dopo un periodo di osservazione postoperatoria di due ore, riportare il topo presso la struttura per animali. A tre giorni dalla paratiroidectomia, analizzare 10 microlitri di sangue prelevato dalla coda per determinare il calcio ionizzato, utilizzando un analizzatore come il sistema per gas ematici, analizzatore di calcio e pH. Se la paratiroidectomia ha avuto successo, il calcio ionizzato nel sangue sarà uguale o inferiore a due deviazioni standard rispetto a quello dei topi di controllo sottoposti a intervento fittizio.Iniziare preparando la soluzione di tossina difterica diluendo la polvere di tossina difterica con soluzione salina sterile fino a una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro. Filtrare sterilmente la soluzione e suddividerla in aliquote. Iniettare cinque microgrammi per chilogrammo di peso corporeo di tossina difterica in topi di otto-dieci settimane di età, che esprimono i recettori per la tossina difterica specificamente nelle paratiroidi.Trascorsi tre giorni dalla seconda iniezione di tossina difterica, analizzare 10 microlitri di sangue prelevato dalla coda per determinare il calcio ionizzato, come in precedenza. Di seguito sono riportate immagini rappresentative delle diverse posizioni delle paratiroidi in topi che esprimono GFP specificamente nelle paratiroidi. I topi presentavano due o tre ghiandole paratiroidi verdi.La maggior parte delle ghiandole paratiroidi si trovava vicino al margine superiore o vicino al margine inferiore della ghiandola tiroidea. In rari casi, alcune ghiandole paratiroidi erano localizzate in posizione ectopica. Uno dei vantaggi del nostro modello murino è che la ghiandola tiroidea rimane integra.Questa figura mostra i livelli di TSH nei topi GFP-PTX a tre mesi dalla paratiroidectomia. Questa figura mostra le misurazioni di T4. I topi GFP-PTX presentano concentrazioni di TSH e concentrazioni di T4 non diverse rispetto ai topi di controllo.Questa immagine mostra i livelli ematici di calcio e i livelli di PTH nei topi GFP-PTX. Questa immagine mostra i livelli ematici di calcio e i livelli di PTH nei topi PTHcre-iDTR a cui è stata somministrata tossina difterica. Sia i topi GFP-PTX che i topi PTHcre-iDTR trattati con tossina difterica hanno mostrato un'ipocalcemia stabile e livelli ridotti di PTH durante un periodo di osservazione di tre mesi.Una volta padroneggiata, la paratiroidectomia guidata dalla GFP può essere eseguita in circa 20 minuti per l'intero intervento. Una singola iniezione di tossina difterica richiede non più di un minuto, se eseguita correttamente. Dopo questo intervento, questi topi sviluppano ipoparatiroidismo e possono essere utilizzati come modello preclinico della malattia.È possibile affrontare domande riguardo l'efficacia di diversi analoghi dell'ormone PTH nel trattamento dell'ipoparatiroidismo. Non dimenticare che la tossina difterica è pericolosa e che gli operatori dovrebbero aver ricevuto le consuete immunizzazioni contro la tossina difterica. L'equipaggiamento di protezione individuale, come maschere e guanti, deve essere sempre indossato durante l'esecuzione di queste procedure.

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Due tecniche per creare Mice Hypoparathyroid: paratiroidectomia Uso GFP Ghiandole ed difterite-tossina-Mediated paratiroideo Ablazione (Video) | JoVE Journal

Due tecniche per creare Mice Hypoparathyroid: paratiroidectomia Uso GFP Ghiandole ed difterite-tossina-Mediated paratiroideo Ablazione

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