Due tecniche per creare Mice Hypoparathyroid: paratiroidectomia Uso GFP Ghiandole ed difterite-tossina-Mediated paratiroideo Ablazione

L'obiettivo generale di questa procedura è generare due modelli murini di ipoparatiroidismo acquisito che siano facili da usare, producano un fenotipo stabile e lascino intatta la funzione tiroidea. Il vantaggio principale di questi due modelli è che consentono la rimozione precisa delle ghiandole paratiroidi nei topi, sia mediante chirurgia guidata da fluorescenza, sia mediante l'espressione specifica del recettore della tossina difterica, consentendo alle cellule di essere selettivamente mirate e distrutte senza interferire con la ghiandola tiroidea vicina. Speriamo che i nostri modelli murini siano in grado di rispondere a domande chiave nel campo dell'ipoparatiroidismo.

Ad esempio, le terapie analoghe al PTH possono aiutare a mantenere normali livelli sierici di calcio senza aumentare l'escrezione urinaria di calcio? Questi modelli possono essere utilizzati anche per studiare altre questioni cliniche nell'ipoparatiroidismo. Ad esempio, la forza ossea è influenzata dall'ipoparatiroidismo e cambia con il trattamento?

Domande come queste sono difficili da rispondere nei pazienti, ma questi modelli murini possono essere utilizzati per affrontarle. Inizia anestetizzando topi di età compresa tra 8 e 10 settimane, esprimendo GFP specificamente nelle paratiroidi secondo un protocollo approvato. Posizionare l'animale in posizione supina e garantire un'adeguata profondità di anestesia in assenza di un riflesso di ritiro del pizzico delle dita dei piedi o di altri mezzi.

Estendi la regione ventrale del collo e preparati per l'intervento chirurgico radendo la pelliccia. Disinfetta la pelle rasata con un tampone antisettico allo iodio povidone, quindi prepara il sito dell'incisione utilizzando uno scrub chirurgico e un risciacquo con alcol secondo il protocollo approvato. Successivamente, coprire l'animale con teli chirurgici sterili per ridurre la contaminazione del sito chirurgico.

Dopo aver praticato un'incisione longitudinale di 2 centimetri con un bisturi chirurgico, utilizzare una pinza curva e seghettata per sezionare la fascia e spingere le ghiandole salivari di lato. Quindi, mentre si osserva il sito chirurgico attraverso un microscopio da dissezione, utilizzare le punte di una pinza affilata per tagliare e separare i muscoli paratracheali ed esporre la trachea. Identificare i lobi destro e sinistro della ghiandola tiroidea situati vicino alla trachea.

Quindi passa la sorgente luminosa alla luce fluorescente e visualizza le due ghiandole paratiroidi fluorescenti verdi. I roditori in genere hanno solo due ghiandole paratiroidi. Se non è possibile identificare le due ghiandole paratiroidi accanto alla tiroide su ciascun lato, si dovrebbe sospettare che le ghiandole paratiroidi si trovino ectopicamente e dovrebbe essere eseguita un'attenta ricerca lungo la trachea.

Successivamente, usa pinze chirurgiche e forbici per rimuovere con cura le ghiandole paratiroidi verdi e controlla attentamente lungo la trachea per assicurarti che tutto il tessuto verde sia stato rimosso. Utilizzare una garza sterile per l'emostasi. Chiudere i muscoli paratracheali con suture interrotte.

Chiudere l'incisione cutanea con le suture di Halstead. Posiziona l'animale post-chirurgico in una gabbia separata su un cuscinetto riscaldante per il recupero della temperatura corporea. Una volta che il topo è sveglio, metti il cibo in pellet e l'acqua con un po' di gelatina sul pavimento della gabbia.

Dopo un periodo di osservazione post-operatoria di due ore, riportare il topo alla struttura per animali. Tre giorni dopo la paratiroidectomia, analizzare 10 microlitri di sangue della coda per il calcio ionizzato utilizzando un analizzatore come il sistema dei gas ematici, il calcio e l'analizzatore di pH. Se la paratiroidectomia ha successo, il calcio ionizzato nel sangue sarà uguale o inferiore a meno due deviazioni standard di quello dei topi di controllo finti.

Inizia preparando la soluzione di tossina difterica diluendo la polvere di tossina difterica con soluzione fisiologica sterile a una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro. Filtrare sterile la soluzione e alloquot. Iniettare cinque microgrammi per chilogrammo di peso corporeo di tossina difterica in topi di età compresa tra 8 e 10 settimane, esprimendo i recettori della tossina difterica specificamente nelle paratiroidi.

Tre giorni dopo una seconda iniezione di tossina difterica, analizzare 10 microlitri di sangue della coda per il calcio ionizzato, come prima. Di seguito sono riportate immagini rappresentative delle varie posizioni delle ghiandole paratiroidi nei topi che esprimono GFP specificamente nelle paratiroidi. I topi avevano due o tre ghiandole paratiroidi verdi.

La maggior parte delle ghiandole paratiroidi si trovava vicino al bordo superiore o vicino al bordo inferiore della ghiandola tiroidea. In rari casi, alcune ghiandole paratiroidi erano localizzate ectopicamente. Uno dei vantaggi del nostro modello murino è che la ghiandola tiroidea rimane intatta.

Questa figura mostra i livelli di TSH dei topi GFP-PTX tre mesi dopo la paratiroidectomia. Questa figura mostra le misurazioni del T4. I topi GFP-PTX mostrano concentrazioni di TSH e concentrazioni di T4 che non erano diverse dai topi di controllo.

Questa immagine mostra i livelli di calcio nel sangue e i livelli di PTH nei topi GFP-PTX. Questa immagine mostra i livelli di calcio nel sangue e i livelli di PTH nei topi PTHcre-iDTR iniettati con tossina difterica. Sia i topi GFP-PTX che i topi PTHcre-iDTR iniettati con DT hanno mostrato un'ipocalcemia stabile e livelli ridotti di PTH per un periodo di osservazione di tre mesi.

Una volta padroneggiata, la paratiroidectomia guidata da GFP può essere eseguita in circa 20 minuti per l'intera procedura. Una singola iniezione di tossina difterica non richiede più di un minuto se eseguita correttamente. Dopo questa procedura, questi topi sviluppano ipoparatiroidismo e possono essere utilizzati come modello preclinico di malattia.

Possono essere affrontate domande come l'efficacia di diversi analoghi dell'ormone PTH nel trattamento dell'ipoparatiroidismo. Non dimenticate che la tossina difterica è pericolosa e che i lavoratori dovrebbero sottoporsi alle solite vaccinazioni contro la tossina difterica. Durante l'esecuzione di queste procedure devono essere sempre indossati dispositivi di protezione individuale come maschere e guanti.