Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le strutture subcellulari nelle ghiandole salivari di topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto esponendo chirurgicamente le ghiandole salivari senza danneggiarle. Nel secondo passaggio, l'animale anestetizzato viene immobilizzato sul palchetto del microscopio.

Successivamente, le ghiandole salivari vengono posizionate con attenzione per non comprometterne la funzione nel passaggio finale. Il topo viene stabilizzato mediante un supporto personalizzato per ridurre al minimo gli artefatti di movimento dovuti al battito cardiaco o alla respirazione dell'animale. Infine, la dinamica delle strutture subcellulari può essere visualizzata mediante microscopia intra vitale.

Prima dell'anestesia, pesare i topi per determinare la dose corretta di anestetico. Successivamente, indurre la pre-anestesia mediante inalazione di isoflurano. Una volta che gli animali sono incoscienti, verificare la sedazione ogni 15 minuti con il test del pizzicamento della patta plantare e mantenere i topi sotto una lampada a calore per tutta la durata dell'intervento chirurgico.

Monitorare la temperatura corporea degli animali con un termometro a sonda rettale. A questo punto, rasare il collo del topo utilizzando un paio di forbici elettriche, quindi usare una garza imbevuta di etanolo per pulire la superficie ventrale del collo, asciugando l'eccesso di alcol con un fazzoletto di carta. Successivamente, utilizzare un paio di pinzette curve smussate per sollevare una piccola porzione di pelle all'estremità inferiore dei muscoli masseteri ed effettuare una piccola incisione.

Inserire le forbici nell'incisione, orientando le punte verso l'alto, in direzione della superficie inferiore della pelle, e aprire e chiudere le lame più volte finché la pelle non si sarà separata dal tessuto sottostante. Quindi, partendo dalla base delle ghiandole salivari, dove il dotto nervoso e i vasi sanguigni collegano la ghiandola al resto del corpo, utilizzare le forbici per tagliare una striscia di pelle allentata larga tre millimetri e lunga dieci millimetri.

Dopo aver pulito l'area della ferita, l'apertura risultante avrà una forma ovale e misurerà circa otto per dodici millimetri. Entrambe le ghiandole salivari saranno visibili. Utilizzare una siringa per applicare del gel di accoppiamento ottico al centro del taglio, quindi usare pezzi freschi di garza sterile per spalmare il gel verso l'esterno dell'apertura finché non viene rimossa tutta la sporcizia e i peli liberi.

Ora, utilizzare un paio di pinzette numero sette per individuare l'estremità della ghiandola salivare destra, afferrando il tessuto connettivo alcuni millimetri al di sopra della parte superiore della ghiandola. Quindi strappare il tessuto connettivo intorno alla ghiandola senza danneggiare il parenchima. Una volta esposta la ghiandola, separare delicatamente il tessuto connettivo dalla ghiandola, lavando via qualsiasi sanguinamento con soluzione fisiologica.

Assicurarsi che tutti i tessuti connettivi siano separati e che la ghiandola sia completamente esposta. Prima di posizionare l'animale sul microscopio, collocare un pezzo spesso di garza e una borsa riscaldante sulla piastra del microscopio, coprendo la parte superiore della borsa riscaldante con un sottile strato di garza. Posizionare un vetrino coprioggetto al centro della piastra.

Quindi posizionare il mouse sul suo lato destro, sopra la garza, fissando l'animale con un pezzo di nastro adesivo sulla superficie ventrale della zampa anteriore destra e un filo di seta agganciato ai denti incisivi. Creare una certa tensione tra il filo e la zampa e fissarli sul supporto. Con ulteriore nastro adesivo, la ghiandola salivare dovrebbe assumere una posizione naturale.

Al centro del vetrino. Utilizzare cunei di plastica abbinati alla piastra del microscopio per stabilizzare ulteriormente la testa e il torace del topo. Successivamente, posizionare un piccolo pezzo di tessuto per la pulizia delle lenti sopra la ghiandola.

Allungare leggermente la ghiandola e posizionare un supporto personalizzato sopra la ghiandola. Quindi fissare saldamente lo stabilizzatore alla piastra con una pinza metallica e del nastro adesivo. Coprire l'animale con una garza e un cuscinetto riscaldante e monitorare la temperatura della ghiandola esposta mediante un termometro dotato di sonda flessibile a contatto termico. Immediatamente dopo aver stabilizzato l'animale, utilizzare l'illuminazione a fluorescenza episcopica per mettere a fuoco la superficie della ghiandola.

Valutare il flusso sanguigno nei capillari e la morfologia complessiva del tessuto. Per eccitare il gene GFP, utilizzare un laser a 488 nanometri. Impostare la potenza di picco a 0,5 milliwatt per evitare il fotoblecamento della proteina tandem tomato.

Utilizzare un laser a 561 nanometri, impostando la potenza di picco a un milliwatt. Valutare ora la stabilità del tessuto eseguendo una pre-scansione dell'area selezionata. Se il preparato non è stabile, regolare l'animale di conseguenza per trovare il corretto piano focale.

In modalità pre. Spostare gradualmente l'obiettivo verso il vetrino fino a quando le strutture del complesso di Golgi, i granuli secretori e la membrana plasmatica diventano chiaramente visibili. Per acquisire le dinamiche dei granuli secretori, utilizzare una velocità di scansione compresa tra 0,5 e due secondi per fotogramma e una risoluzione di 256 per 256 pixel con una scala spaziale di 0,2 micrometri per pixel.

Per visualizzare in modo ottimale i granuli e la membrana plasmatica, impostare lo spessore ottico tra 0,9 e 1,2 micrometri. Successivamente, acquisire un'immagine del campo visivo da utilizzare come punto di riferimento. Infine, stimolare l'esocitosi iniettando sottocute 0,1 milligrammi per chilogrammo di isoproterenolo appena preparato in soluzione salina.

Un minuto dopo l'iniezione. La fusione dei granuli secretori con la membrana plasmatica verrà rilevata da un aumento della fluorescenza GFP attorno ai granuli e dalla diffusione del peptide tandem tomato nelle loro membrane limitanti. Nel topo GFPM tomato, le strutture asiniche appaiono come entità chiaramente distinte che esprimono GFP citosolico e peptide tandem tomato mirato alla membrana, come indicato dalle linee tratteggiate.

In singole cellule asinine di aser, i confini sono definiti dal peptide tandem tomato, come indicato dalle frecce. Il GFP è inoltre rilevato nei nuclei, chiaramente visibili all'interno delle cellule aser. Il GFP citosolico, indicato dalla testa di freccia, è escluso dai granuli secretori che appaiono come vescicole circolari scure di circa 1-1,5 micrometri di diametro.

Per visualizzare gli eventi esofitici, viene mostrata un'area rappresentativa della membrana plasmatica arricchita di granuli secretori, indicata dall'asterisco, dopo l'iniezione di isoproterenolo. È possibile osservare un aumento dei livelli di fluorescenza GFP indicato dalle frecce verdi attorno ad alcuni granuli secretori in prossimità della membrana plasmatica. Inoltre, dopo la fusione con la membrana plasmatica, il peptide tandem tomato si diffonde nelle membrane limitanti dei granuli secretori, come evidenziato dalle frecce rosse.

Dopo 30-40 secondi, i granuli secretori collassano gradualmente e le loro membrane limitanti vengono integrate nella membrana plasmatica apicale. L'approccio qui presentato rappresenta un notevole progresso nella biologia cellulare, poiché consente l'acquisizione di immagini sulla dinamica di un processo specifico di traffico delle membrane in topi vivi.