Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le strutture subcellulari nelle ghiandole salivari murine. Ciò si ottiene esponendo prima chirurgicamente le ghiandole salivari senza danneggiarle. Nella seconda fase, l'animale anestetizzato viene immobilizzato sul tavolino del microscopio.

Successivamente, le ghiandole salivari vengono posizionate con cura in modo da non compromettere la loro funzione nella fase finale. Il mouse è stabilizzato con un supporto personalizzato per ridurre al minimo eventuali artefatti di movimento dovuti al battito cardiaco o alla respirazione dell'animale. In definitiva, la dinamica delle strutture subcellulari può essere ripresa mediante microscopia intravitale.

Prima dell'anestesia, pesare i topi per determinare la dose corretta di anestetico. Successivamente, indurre la pre-anestesia mediante inalazione di fluoro. Una volta che gli animali sono incoscienti, confermare la sedazione ogni 15 minuti con un pizzico pop e tenere i topi sotto la lampada termica per tutta la durata dell'intervento.

Monitorare la temperatura corporea degli animali con un termometro a sonda rettale. Ora radere il collo del topo con un paio di tosatrici elettriche, quindi utilizzare una spugna di garza imbevuta di etanolo per pulire il lato ventrale del collo, asciugando l'alcol in eccesso con la salvietta kim. Quindi, usa un paio di pinzette curve opache per sollevare un piccolo pezzo di pelle all'estremità laterale inferiore dei muscoli del massaggiatore e praticare una piccola incisione.

Inserire le forbici nell'incisione, puntando le punte verso l'alto verso la parte inferiore della pelle e aprendo più volte le lame fino a quando la pelle non si è staccata dal tessuto sottostante. Quindi iniziando vicino alla base delle ghiandole salivari dove il dotto nervoso e i vasi sanguigni collegano la ghiandola al resto del corpo. Usa le forbici per tagliare una striscia di pelle allentata larga tre millimetri e lunga 10 millimetri.

Dopo aver pulito l'area della ferita, l'apertura risultante sarà di forma ovale e misurerà circa otto per 12 millimetri. Entrambe le ghiandole salivari saranno visibili. Utilizzare una siringa per applicare il gel di accoppiamento ottico al centro del taglio, quindi utilizzare pezzi freschi di garza sterile per pulire il gel verso l'esterno dell'apertura fino a rimuovere tutto il sangue e i capelli sciolti.

Ora, usa un paio di pinzette numero sette per trovare la punta della ghiandola salivare destra, afferrando il tessuto connettivo a pochi millimetri sopra la parte superiore della ghiandola. Quindi strappare il tessuto connettivo attorno alla ghiandola senza ferire il parenchima. Una volta che la ghiandola è esposta, separare delicatamente il tessuto connettivo dalla ghiandola, lavando via l'eventuale sanguinamento con soluzione fisiologica.

Assicurarsi che tutti i tessuti connettivi siano separati e che la ghiandola sia completamente esposta. Prima di portare l'animale al microscopio, posizionare un pezzo spesso di garza e un impacco termico sul tavolino del microscopio, coprendo anche la parte superiore dell'impacco termico con un sottile pezzo di garza. Posiziona un vetrino coprioggetti al centro del palco.

Quindi posiziona il topo sul lato destro sopra la garza, fissando l'animale con un pezzo di nastro adesivo sul lato ventrale della zampa anteriore destra e una sutura di seta agganciata attorno agli incisivi. Crea un po' di tensione tra il filo e la zampa e attaccali al palco. Con più nastro adesivo, la ghiandola salivare dovrebbe riposare naturalmente.

Al centro del vetrino coprioggetto. Utilizzare cunei di plastica accoppiati al tavolino del microscopio per stabilizzare ulteriormente la testa e il torace del topo. Quindi posizionare un piccolo pezzo di panno per la pulizia delle lenti sopra la ghiandola.

Estendere leggermente il pressacavo e posizionare un supporto personalizzato sopra il pressacavo. Quindi, accoppiare saldamente lo stabilizzatore al palco con un morsetto metallico e del nastro adesivo. Coprire l'animale con una garza e un cuscinetto termico e monitorare la temperatura delle ghiandole esposte con un termometro flessibile dotato di sonda termica accoppiata Immediatamente dopo aver stabilizzato l'animale, utilizzare l'illuminazione a epifluorescenza per concentrarsi sulla superficie della ghiandola.

Valutare il flusso sanguigno nei capillari e la morfologia complessiva del tessuto. Per eccitare il gene GFP, utilizzare un laser a 488 nanometri. Impostare la potenza di picco su 0,5 milliwatt per evitare il fotosbiancamento della proteina di pomodoro tandem.

Utilizzare un laser a 561 nanometri, impostando la potenza di picco su un milliwatt. Ora valuta la stabilità del tessuto pre-scansionando l'area selezionata. Se il preparato non è stabile, regolare l'animale di conseguenza per trovare il piano focale corretto.

Nella modalità pre. Spostare gradualmente l'obiettivo verso il vetrino coprioggetti fino a quando le strutture aser, i granuli secretori e la membrana plasmatica diventano chiaramente visibili. Quindi, per visualizzare la dinamica dei granuli secretori, utilizzare una velocità di scansione da 0,5 a due secondi per fotogramma e 256 x 256 pixel con una scala spaziale di 0,2 micrometri per pixel.

Per visualizzare in modo ottimale i granuli e la membrana plasmatica, impostare lo spessore ottico tra 0,9 e 1,2 micrometri. Successivamente, registrare un'immagine del campo visivo da utilizzare come punto di riferimento. Infine, stimolare l'esocitosi iniettando per via sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo di isoproterenolo e soluzione salina appena preparati.

Un minuto dopo l'iniezione. La fusione dei granuli secretori con la membrana plasmatica sarà rilevata da un aumento della fluorescenza GFP attorno ai granuli e dalla diffusione del peptide del pomodoro tandem nelle loro membrane limitanti. Nel topo pomodoro GFPM, l'asinina appare come strutture chiaramente distinte che esprimono GFP citosolica e peptide di pomodoro tandem mirato alla membrana, come indicato dalle linee spezzate.

Nelle singole asinine, le cellule aser sono delineate dal peptide del pomodoro tandem, come indicato dalle frecce. La GFP viene rilevata anche nei nuclei che sono chiaramente visibili all'interno delle cellule aser. La GFP citosolica indicata dalla punta della freccia è esclusa dai granuli secretori che appaiono come vescicole circolari scure di circa uno a 1,5 micrometri di diametro.

Per visualizzare gli eventi esofitici, dopo l'iniezione dell'isoproterenolo viene mostrata un'area rappresentativa della membrana plasmatica arricchita di granuli secretori come indicato dall'asterisco. Si può osservare un aumento dei livelli di fluorescenza GFP denotato dalle frecce verdi attorno ad alcuni dei granuli secretori che si trovano in prossimità della membrana plasmatica. Inoltre, dopo la fusione con la membrana plasmatica, il peptide di pomodoro tandem si diffonde nelle membrane limitanti dei granuli secretori come evidenziato dalle frecce rosse.

Dopo 30-40 secondi, i granuli secretori collassano gradualmente e le loro membrane limitanti sono integrate nella membrana plasmatica apicale. L'approccio qui presentato rappresenta un importante passo avanti nella biologia cellulare in quanto consente l'imaging delle dinamiche di uno specifico processo di traffico di membrana nei topi viventi.