Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

L'obiettivo generale di questa procedura è incorporare le cellule staminali in capsule di alginato e idrogel in modo sicuro ed efficace e coltivarle all'interno delle capsule per controllare l'aggregazione e il microambiente, ciò si ottiene mescolando prima una sospensione di cellule staminali filtrate e una soluzione di alginato di sodio. La miscela viene quindi trasferita in una siringa e un ugello coassiale viene installato sulla siringa prima di posizionarla su una pompa a siringa. Successivamente, le goccioline vengono preparate espellendo la sospensione cellulare con azoto gassoso che fluisce, seguito dalla raccolta e dalla soluzione di cloruro di calcio.

Le capsule vengono quindi trattate con poli-L lisina per prevenire perdite cellulari e EDTA per fluidificare le capsule interne prima di coltivare le cellule incapsulate in una condizione di agitazione rotativa. Infine, le cellule vengono raccolte dalle capsule mediante EDTA e distruzione fisica della membrana. In definitiva, l'incapsulamento in alginato delle cellule staminali pluripotenti impedisce alle cellule di aggregarsi eccessivamente e limita lo stress puro e puro sperimentato dalle cellule in coltura in sospensione.

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave in campo biologico e biomedico, come la grande espansione del trapianto di cellule e la ricerca sulla nicchia delle cellule staminali. Iniziare l'incapsulamento cellulare raccogliendo le cellule come descritto nel protocollo di testo dopo la centrifugazione a 160 volte G per tre minuti. Lavare il pellet di cellule staminali pluripotenti indotte o IPS mediante Resus, sospendendo in cumuli di soluzione salina tamponata e centrifugando tre volte dopo Resus, sospendendo le cellule e accumulando soluzione fisiologica tamponata.

Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere gli aggregati di grandi dimensioni, che altrimenti potrebbero ostruire l'ugello. Quindi, mescolare due millilitri di sospensione cellulare filtrata e tre millilitri di soluzione di alginato di sodio al 5%. Per ottenere una sospensione cellulare di cinque millilitri in alginato di sodio al 3%, la densità cellulare è DIR superiore a 1 milione di cellule per millilitro.

Dopo aver raccolto la sospensione cellulare in una siringa da cinque millilitri, installare un ugello coassiale sulla siringa e posizionarlo su una pompa a siringa emettere un flusso di azoto gassoso attraverso l'ago esterno dell'ugello coassiale ed espellere la sospensione cellulare attraverso l'ugello interno. Raccogliere le goccioline in 250 millilitri di soluzione di cloruro di calcio allo 0,5% e attendere da 10 a 20 minuti per la dazione mescolando a 60-90 giri/min. Dopo il lavaggio con cumuli di soluzione salina tamponata, le capsule raccolte vengono utilizzate come capsule nude per trattare le capsule incubate in alginato di calcio allo 0,05% in peso per volume.

Soluzione di poli-L lisina per cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con agitazione. Dopo aver raccolto le capsule in una provetta e lavate con cumuli di soluzione salina tamponata, incubarle in DMEM contenente il 10% di FBS. Al fine di neutralizzare la carica elettrica sulla loro superficie, utilizzare le capsule risultanti come capsule rivestite per generare capsule cave.

Incubare le capsule in cumuli di soluzione salina tamponata contenente 10 millimolari di EDTA per cinque minuti. Le capsule trattate con EDTA sono utilizzate come capsule cave. Incubare le cellule incapsulate a 75 RPM con agitazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 10 giorni dopo l'incubazione, raccogliere e incubare le capsule in EDTA da 10 millimolari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 10 minuti.

Raccogliere le cellule dalle capsule di alginato senza trattamento con polilicina mediante centrifugazione a 1000 volte G per tre minuti. Se le capsule di alginato sono trattate con poli-L-lisina, rompere la membrana di poli-L-lisina in alginato pipettando su e giù circa 10 volte con un ago collegato a una siringa. Il diametro dell'ago deve essere inferiore alla dimensione della capsula e in questo esperimento vengono utilizzati aghi da 25 gauge.

Dopo la centrifugazione a una velocità compresa tra 1000 e 5.000 volte G per cinque minuti, raccogliere il pellet cellulare rigorosamente dalle membrane di poli-L licina di alginato rotte Se i campioni di mRNA vengono raccolti dalle cellule, si noti che le restanti membrane di poli-L di l'alginato possono impedire la purificazione dell'mRNA come visualizzato da una telecamera ad alta velocità. La soluzione di alginato espulsa forma una forma sferica subito dopo l'espulsione. Se la sospensione viene espulsa con una portata di azoto inferiore a un litro al minuto, la dimensione delle goccioline è uniforme.

Tuttavia, se il flusso di azoto è superiore a un litro al minuto, la gocciolina si rompe e la dimensione delle goccioline diventa eterogenea. Detto questo, è difficile preparare goccioline più piccole di 500 micron con questo metodo. Nel processo di gelificazione, le goccioline di alginato di sodio formano capsule di alginato di calcio di forma sferica in una soluzione di cloruro di calcio.

Se la concentrazione di alginato di sodio è sufficientemente alta, tuttavia, una bassa concentrazione di alginato di sodio provoca capsule non sferiche e nonoo, che hanno un problema nel processo di codifica. Anche se la concentrazione di alginato di sodio non è sufficiente, le capsule sferiche possono formarsi aumentando la concentrazione di calcio. Tuttavia, circa 50 millimolari di cloruro di calcio sono appropriati per l'incapsulamento perché una concentrazione troppo alta di cloruro di calcio diminuisce la crescita e la vitalità cellulare.

cellule incapsulate possono crescere nelle capsule, ma la perdita cellulare può verificarsi nelle capsule senza il rivestimento in alginato poli L lisina. Nel caso delle cellule IPS di topo, le cellule formano aggregati a forma di disco in ciascuna capsula di alginato di calcio, mentre le cellule si aggregano e formano singoli aggregati sferici in ogni capsula cava. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incapsulare e coltivare le cellule nel controllo delle dimensioni.

L'idrogeno cattura senza attrezzature speciali, senza assorbenti organici.