Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

L'obiettivo generale di questa procedura è incorporare in modo sicuro ed efficace cellule staminali in capsule di idrogel di alginato e coltivarle all'interno delle capsule per controllare l'aggregazione e il microambiente; ciò si ottiene innanzitutto mescolando una sospensione filtrata di cellule staminali e una soluzione di alginato di sodio. La miscela viene quindi trasferita in una siringa e un ugello coassiale viene installato sulla siringa prima di posizionarla su una pompa per siringhe. Successivamente, le goccioline vengono formate espellendo la sospensione cellulare con un flusso di gas azoto, seguito dalla raccolta e dalla soluzione di cloruro di calcio.

Le capsule vengono quindi trattate con poli-L-lisina per prevenire la fuoriuscita cellulare e con EDTA per fluidificare l'interno delle capsule, prima di coltivare le cellule incapsulate in condizioni di agitazione rotatoria. Infine, le cellule vengono raccolte dalle capsule mediante EDTA e distruzione fisica della membrana. In definitiva, l'incapsulamento in alginato delle cellule staminali pluripotenti impedisce alle cellule di aggregarsi eccessivamente e riduce lo stress da taglio subito dalle cellule in coltura in sospensione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo biologico e biomedico, come l'ampia espansione della trapiantologia cellulare e lo studio della nicchia delle cellule staminali. Iniziare l'incapsulamento cellulare raccogliendo le cellule come descritto nel protocollo testuale, centrifugando a 160 ×g per tre minuti. Lavare il pellet di cellule staminali pluripotenti indotte o cellule IPS mediante Resus, sospendendole in soluzione salina tamponata con HEPES e centrifugando per tre volte dopo il Resus, sospendendo le cellule in soluzione salina tamponata con HEPES.

Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere gli aggregati più grandi, che potrebbero ostruire l'ugello. Successivamente, mescolare due millilitri di sospensione cellulare filtrata e tre millilitri di soluzione di alginato di sodio al 5%. Per ottenere una sospensione cellulare finale di cinque millilitri in alginato di sodio al 3%, la densità cellulare deve essere superiore a 1 milione di cellule per millilitro.

Dopo aver raccolto la sospensione cellulare in una siringa da cinque millilitri, montare un ugello coassiale sulla siringa e posizionarla su una pompa per siringhe; far fuoriuscire un flusso di gas azoto attraverso l'ago esterno dell'ugello coassiale ed espellere la sospensione cellulare attraverso l'ugello interno. Raccogliere le goccioline in 250 millilitri di soluzione di cloruro di calcio allo 0,5% e attendere da 10 a 20 minuti affinché avvenga la gelificazione, sotto agitazione a 60-90 giri al minuto. Dopo il lavaggio con soluzione salina tamponata, le capsule raccolte vengono utilizzate come capsule nude; incubare le capsule di alginato di calcio in una soluzione allo 0,05% peso/volume.

Soluzione di poli-L-lisina per cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con agitazione. Dopo aver raccolto le capsule in un tubo e averle lavate con soluzione salina tamponata, incubarle in DMEM contenente 10% di FBS. Per neutralizzare la carica elettrica sulla loro superficie, utilizzare le capsule ottenute come capsule rivestite per generare capsule cave.

Incubare le capsule in mucchi di soluzione salina tampone contenente EDTA 10 millimolare per cinque minuti. Le capsule trattate con EDTA vengono utilizzate come capsule cave. Incubare le cellule incapsulate a 75 giri al minuto con agitazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 10 giorni; al termine dell'incubazione, raccogliere e incubare le capsule in EDTA 10 millimolare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 10 minuti.

Raccogliere le cellule dalle capsule di alginato senza trattamento con poli-L-lisina mediante centrifugazione a 1000 ×g per tre minuti. Se le capsule di alginato sono state trattate con poli-L-lisina, rompere la membrana di alginato-poli-L-lisina pipettando su e giù circa 10 volte con un ago collegato a una siringa. Il diametro dell'ago deve essere inferiore alla dimensione delle capsule, e in questo esperimento vengono utilizzati aghi da 25 gauge.

Dopo centrifugazione a 1000-5.000 ×g per cinque minuti, raccogliere il pellet cellulare esclusivamente da membrane di alginato poli-L-lisina rotte. Se i campioni di mRNA vengono raccolti dalle cellule, si noti che le membrane residue di alginato poli-L-lisina potrebbero impedire la purificazione dell'mRNA, come visualizzato mediante una telecamera ad alta velocità. La soluzione di alginato espulsa assume immediatamente una forma sferica dopo l'espulsione. Se la sospensione viene espulsa con una portata di azoto inferiore a un litro al minuto, le gocce presentano dimensioni uniformi.

Tuttavia, se il flusso di azoto è superiore a un litro al minuto, la goccia si rompe e le dimensioni delle gocce diventano eterogenee. Per questo motivo, è difficile preparare gocce più piccole di 500 micron utilizzando questo metodo. Nel processo di gelificazione, le gocce di alginato di sodio formano capsule sferiche di alginato di calcio in soluzione di cloruro di calcio.

Tuttavia, se la concentrazione di alginato di sodio è sufficientemente elevata, una bassa concentrazione di alginato di sodio provoca forme irregolari, non sferiche e non uniformi delle capsule, che presentano problemi nel processo di codifica. Anche se la concentrazione di alginato di sodio non è sufficiente, capsule sferiche possono essere formate aumentando la concentrazione di calcio. Tuttavia, una concentrazione di circa 50 millimolari di cloruro di calcio è appropriata per l'incapsulamento, poiché una concentrazione troppo elevata di cloruro di calcio riduce la crescita cellulare e la vitalità.

Le cellule incapsulate possono crescere all'interno delle capsule, ma può verificarsi una fuoriuscita cellulare nelle capsule prive del rivestimento di alginato di poli-L-lisina. Nel caso delle cellule staminali pluripotenti indotte di topo, le cellule formano aggregati di forma discoidale all'interno di ciascuna capsula di alginato di calcio, mentre si raggrumano e formano singoli aggregati sferici all'interno di ciascuna capsula cava. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come incapsulare e coltivare cellule con controllo dimensionale.

L'idrogeno viene catturato senza alcun equipaggiamento speciale e senza assorbenti organici.