Name: Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per lanalisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Scopri una piattaforma microarray cellulare high-throughput per correlare differenziazione e forze di trazione in contesti microambientali variabili. Questo metodo avanzato supporta la ricerca nell'ingegneria tessutale e nella biologia delle cellule staminali.

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Riconosciamo Austin Cyphersmith e Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Istituto di Biologia Genomica, University of Illinois a Urbana-Champaign) per l&#39;assistenza con la microscopia e generosamente accogliere schermo e cattura video al centro di microscopia.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nei nostri esperimenti, abbiamo trovato che i guasti più comuni sono legati alla qualità di array fabbricati e poco caratterizzati risposta del sistema biologico che interessa. Rimandiamo il lettore alla Tabella 1 per modalità di guasto comuni in esperimenti di microarray cellulare e procedure di risoluzione associati. Per quanto riguarda la qualità delle matrici, in particolare, si raccomanda quanto segue. Confermare la qualità tecnica e la robustezza di arraying programmi, parametri e tamponi utilizzando molecole fluorescente come destrano rodamina-coniugati. perni Pulire accuratamente prima o dopo arraying secondo le istruzioni del produttore e inoltre visivamente controllare che i canali di pin sono chiari di detriti utilizzando un microscopio ottico. Confermare la ritenzione biomolecola Arrayed con macchie di proteine ​​generali o immunomarcatura. Notare che biomolecole con peso molecolare inferiore a 70 kDa spesso non sono mantenute nel idrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Convalida Arrayed biomolecola cella-funzionalità utilizzando più tipi di cellule. Si noti che solo le cellule aderenti sono compatibili con gli array; Inoltre, l&#39;adesione ad array dipende sia proprietà specifiche delle celle (ad esempio, integrina profilo di espressione) e le proteine ECM selezionati. A causa di spazio limitato, non abbiamo fornito una vasta trattamento di disegno matrice, il layout e la fabbricazione qui e di rimandare il lettore a lavori precedenti 23, 25. Usiamo generalmente 100 sottoarray Spot (150 micron di diametro posto, 450 micron da centro a centro distanza) composti da 10-20 condizioni di biomolecole unici (cioè, 5-10 punti / condizione). Il numero di sotto-array in un array varia a seconda del numero di condizioni biomolecole di interesse, che può essere scalata comodamente fino a 1.280 su un 25 x 75 mm di traslazione microscopio (~ 6.400 punti in 64 sottoarray)xref &quot;&gt; 25, 31 I parametri sopra ulteriormente variare a seconda delle dimensioni del motivo di interesse;. perni atti a generare i motivi da 75 - 450 micron sono facilmente disponibili. esperimenti di array sono meglio integrate da validazione di alta punteggio condizioni schierati di interesse utilizzando altri formati di cultura, letture di analisi e sistemi modello biologico. In particolare, si consiglia di un&#39;ulteriore validazione effetti di selezionare le condizioni disposte utilizzando colture di massa in combinazione con tecniche di biologia molecolare standard (ad esempio, qRT-PCR, immunoblotting) o di serie TFM. La manipolazione genetica (ad esempio, l&#39;abbattimento o sovraespressione) del fattore di interesse per un adeguato sistema di modello biologico può anche servire per confermare gli effetti osservati negli array. In vivo modelli animali rappresentano un altro mezzo di convalida e sono stati recentemente utilizzati, per esempio, per confermare il ruolo centrale di galectin-3 e galectin-8il tumore del polmone metastatico nicchia, come inizialmente identificato tramite microarray cella 31, 49. Un certo numero di altri metodi sono stati usati per sondare regolazione microambientali di funzioni cellulari, compresa una varietà di bidimensionali sistemi microfabbricati 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 e tridimensionali sistemi biomateriale ingegnerizzati 56, 57, 58 , 59, 60, 61. In confronto con altri metodi, i particolari vantaggi della piattaforma microarray cellule descritte qui costituiti da: (1) produzione finocentinaia o migliaia di diverse combinazioni di fattori, consentendo analisi degli effetti di interazione; (2) accessibili, imaging e analisi automatizzata; (3) l&#39;integrazione di entrambe le letture biochimici e biofisici con presentazione controllata di fattori schierati; (4) capacità di variare le proprietà del materiale del substrato; e (5) l&#39;analisi singola cella ad alta contenuto di destino delle cellule e la funzione. In sintesi, la combinazione di microarrays cellulari con TFM su substrati di sintonizzabile rigidità substrato consente caratterizzazione approfondita dei segnali biochimici e biofisici. Come presentato qui, questa piattaforma è generalizzabile e può essere facilmente applicata ad una varietà di tipi di cellule aderenti e dei contesti di tessuto verso una migliore comprensione della regolazione microambientali combinatoria di differenziazione cellulare e meccanotrasduzione.

Le interazioni tra cellule e fattori circostanti microambiente mediare una grande varietà di processi biologici durante lo sviluppo, l&#39;omeostasi, e patogenesi della malattia 1, 2, 3, 4. Queste interazioni microambientali includono la consegna di fattori solubili alle cellule, vincolante cellula-matrice, e le interazioni cellula-cellula tramite legame ligando-recettore. In aggiunta alle considerazioni biochimiche precedenti, i parametri biofisici, come le proprietà meccaniche del substrato (ad esempio, il modulo di Young, porosità) e la forma delle cellule, e meccanotrasduzione valle associati hanno sempre ottenuto il riconoscimento come mediatori chiave del differenziamento cellulare 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. I segnali derivanti da tali interazioni microambientali servono come input per reti geniche e vie di segnalazione. Inoltre, questi componenti cellulari intrinseca anche fornire un feedback al microambiente tramite fattori secreti ed enzimi che degradano matrice, completando un ciclo di coregolamentazione complesso tra i programmi genetici di cellule-intrinseca e dei fattori del microambiente delle cellule-estrinseca 5, 11, 12. L&#39;utilizzo di sistemi ingegnerizzati per la presentazione controllata di fattori microambientali è dimostrato utile in una varietà di contesti diversi 13, 14, 15. Sistemi di microfabbricazione, in particolare, hanno facilitato preciso patterning spaziale delle proteine e cellule, nonché l&#39;analisi altamente parallelo tramite la miniaturizzazione 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays cellulari rappresentano un tale sistema microfabbricazione in cui combinazioni di biomolecole sono contatti stampati su una poliacrilammide idrogel elastica substrato 23, 24, 25. L&#39;inclusione di componenti cellulari-adesivo (cioè proteine ​​della matrice) consente l&#39;adesione sostenuta delle cellule e la cultura su microarray, che è spesso seguita da analisi a valle tramite immunocitochimica e giornalisti fluorescenti. Microarrays cellulari sono stati produttivo orientato verso il raggiungimento di una migliore comprensione del fenotipo delle cellule del fegato 23, 26, neural precursore differenziazione 27, Mammardecisioni y progenitore destino 28, sulle cellule staminali embrionali di manutenzione / differenziazione 23, 29, 30, cancro al polmone metastasi 31, e la risposta terapeutica nel melanoma 32. Abbiamo recentemente dimostrato l&#39;utilizzo di microarray cellulari per definire il ruolo di matrice extracellulare (ECM) composizione proteica nella specifica endoderma 33, fegato progenitore differenziazione 34, 35, e tumori polmonari risposta farmacologica cellule 36. In questi lavori, ci siamo concentrati sulle estendere le capacità combinatorie della piattaforma matrice e ad esplorare le intersezioni di segnalazione cellulare-intrinseco con la composizione della matrice extracellulare e della biomeccanica. Inoltre, abbiamo implementato letture biofisici in questa piattaforma matrice per fornire la capacità di quantitativamente caratterize il ruolo della contrattilità cellulare nel differenziamento elabora 35. Per fare ciò, abbiamo integrato la forza di trazione microscopia (TFM) con microarray cellulari per consentire la valutazione high-throughput di trazione cellule generate. TFM è un metodo ampiamente utilizzato per misurare le forze di trazione cellule generate e fornisce analisi significative circa il coordinamento di singola cellula e la funzione a livello dei tessuti con la composizione e biomeccanica del microambiente locale 37, 38, 39, 40. Così, combinando TFM con microarray cellulari fornisce un sistema high-throughput per la misura chiave, fisiologicamente rilevanti parametri biofisici. La piattaforma microarray cellule qui descritto si compone di quattro sezioni: la fabbricazione di substrati poliacrilammide, fabbricazione di array, colture cellulari e test di lettura e analisi dei dati. VedereFigura 1 per una sintesi schematica delle prime tre sezioni sperimentali; vedi figura 2 per una sintesi schematica della sezione finale con una particolare attenzione per l&#39;analisi dei dati di immunofluorescenza. Al fine di adattare la piattaforma microarray cella per studi di biomeccanica interazioni cellula-substrato, abbiamo utilizzato substrati poliacrilammide di sintonizzabile modulo di Young ma porosità simili, per Wen et al. 41. Per consentire misurazioni TFM delle forze esercitate da cellule sulla loro substrato, abbiamo implementato un Petri formato piatto fondo di vetro in aggiunta al microscopio in vetro spessore diapositive frequentemente utilizzata da altri gruppi. Così, questa piattaforma microarray cellulare è in grado di misurazioni parallele di differenziazione cellulare tramite immunofluorescenza su vetrini da microscopio e le forze di cellule generate tramite TFM sui piatti con fondo di vetro separate. Abbiamo inoltre applicato diversi miglioramenti per l&#39;approccio analitico comunemente utilizzato con microarrays di cellule. specificalmente, invece di parametrico Z-scoring di intensità complessiva dell&#39;isola, si misura l&#39;intensità cella singola e applicare la normalizzazione quantile al fine di tenere conto di distribuzioni non normali e più accuratamente descrivere il comportamento cellulare. Riteniamo che questi miglioramenti forniscono particolare utilità nei confronti indagini dei processi biologici in cui spunti sia biochimici e biofisici giocano importanti ruoli, che si intersecano. Inoltre, i nostri miglioramenti analitici consentono l&#39;applicazione di microarray cellulari per gli studi di una serie di funzioni cellulari per i quali a cella singola e il comportamento a livello di popolazione divergono.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m filtro per siringhe</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Abbinalo a siringhe in plastica Luer lock di dimensioni adeguate.</td></tr><tr><td>100 &volte; penicillina&ndash; soluzione di streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 60 mm coverglasses</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetossisilil)propil metacrilato (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Conservare sotto gas inerte secondo le istruzioni del produttore. L'esposizione del 3-TPM all'aria potrebbe compromettere la silanizzazione dei substrati di vetro. ATTENZIONE: 3-TPM è un liquido combustibile. Tenere lontano da fonti di calore, scintille, fiamme libere e superfici calde e utilizzare solo in una cappa chimica.</td></tr><tr><td>3-[(3-Colamidopropil)dimetilammonio]-1-propansulfonato idrato (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri con fondo di vetro da 35 mm</td><td>Cella E& G</td><td>GBD00002-200</td><td>Pozzetto da 13 mm costituito da vetro di copertura #1.5. Abilita l'imaging TFM e su cellule vive.</td></tr><tr><td>Micropiastra con fondo a V in polipropilene a 384 pozzetti, non sterile</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre in polistirene a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Le piastre Petri con fondo in vetro da 35 mm si inseriscono nei pozzetti della micropiastra, facilitando la fabbricazione dell'array.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>ATTENZIONE: L'esposizione all'acrilammide può provocare tossicità acuta e irritazione. Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.</td></tr><tr><td>Collagene I, coda di ratto</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Collagene III,</td><td>EMD umano Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Collagene IV,</td><td>EMD umano Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, rodamina B-coniugata, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Utilizzato come marcatore per la posizione dell'array.</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Alcol etilico</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-ricombinante DLL1,</td><td>mouse R& D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-ricombinante DLL4, topo</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-ricombinante JAG1, ratto</td><td>R& D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente, invertito</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Assicurarsi che il microscopio sia dotato di un tavolino robotico sia per l'imaging fluorescente automatizzato che per il TFM. Controllo ambientale (i.e., 37 &deg; C e 5% di CO2) è altamente consigliabile per il TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G con DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>ATTENZIONE: L'acido acetico è infiammabile e corrosivo. Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, topo</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Scanner per microarray</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>I fluorofori devono essere compatibili con Cy3 o Cy5.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>Altri microarrayer di capacità simili o superiori possono essere facilmente sostituiti.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, 25 volte 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0,9 &ndash; 1,1 mm di spessore.</td></tr><tr><td>N,N&prime; -Methylenebisacrylamide (bisacrilammide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>ATTENZIONE: L'esposizione all'acrilammide può provocare tossicità acuta e irritazione. Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA), 16% v/v</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>RT15710</td><td>Preparare PFA fresco (non conservare) per una fissazione ottimale. ATTENZIONE: L'esposizione al PFA può provocare tossicità acuta e può anche irritare o corrodere la pelle al contatto. Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi e utilizzare solo in una cappa chimica.</td></tr><tr><td>Proteina A/G, ricombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di essiccazione in Pyrex, 2.000&nbsp; mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura rettangolare a 4 camere</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>Per colture cellulari su vetrini da microscopio arrayed.</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>ATTENZIONE: NaOH è altamente caustico e può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.</td></tr><tr><td>Pin invisibile per l'array</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Pulire i pin dopo ogni esecuzione dell'array seguendo le istruzioni del produttore. Produce domini da 150 micron; Acquista altre dimensioni di pin (75&ndash; 450 micron) in base alla vostra particolare applicazione.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare differenziazione e forze di trazione

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

microarrays cellulari microfabbricazione, che consistono in combinazioni di contatti stampati di biomolecole su una superficie elastica idrogel, forniscono un elevato throughput di sistema ingegnerizzato strettamente controllato per misurare l&#39;impatto dei segnali biochimici schierati sulla differenziazione delle cellule. I recenti sforzi utilizzando microarray di cellule hanno dimostrato la loro utilità per gli studi combinatorie in cui molti fattori microambientali sono presentati in parallelo. Tuttavia, questi sforzi si sono concentrati principalmente sulla studio degli effetti di segnali biochimici su risposte delle cellule. Qui vi presentiamo una piattaforma microarray cella con le proprietà del materiale regolabili per valutare sia la differenziazione cellulare mediante immunofluorescenza e biomeccanico cellula-substrato interazioni con la forza di trazione microscopia. Per fare questo, abbiamo sviluppato due diversi formati utilizzando idrogel di poliacrilamide di varia il modulo di Young fabbricato su entrambi i vetrini da microscopio o piatti con fondo di vetro Petri. Forniamo best pratiche e risoluzione di problemi per la realizzazione di microarray su questi substrati idrogel, la successiva coltura cellulare su microarray, e l&#39;acquisizione di dati. Questa piattaforma è particolarmente adatto per l&#39;utilizzo nelle indagini di processi biologici per i quali sia biochimica (ad esempio, la composizione della matrice extracellulare) e biofisica (ad esempio, il substrato rigidità) spunti possono svolgere significativo, si intersecano ruoli.

Utilizzando questa piattaforma, abbiamo studiato il ruolo di entrambi i segnali biochimici e biofisici nella specifica sorte dei progenitori del fegato 34, 35. Proteina A / G Notch coniugato ligandi hanno mostrato una migliore ritenzione e il clustering in idrogel di poliacrilamide (figura 3A) e sono stati, inoltre, in grado di pilotare la differenziazione dei progenitori del fegato verso un destino delle cellule del dotto biliare (Figura 3B). Utilizzando l&#39;analisi singola cellula, abbiamo quantificato la risposta ai ligandi Notch per le proteine ECM collagene, collagene III, collagene IV, fibronectina e laminina (Figura 3C), trovando che la risposta dei progenitori epatici al ligando dipende anche dalla contesto ECM. Ultimo, abbiamo utilizzato shRNA atterramento di generare progenitori epatici senza i ligandi DLL1 e JAG1. La risposta al ligando Notch schierati variava a seconda del presence di entrambi ligando, confermando che la risposta allo ligando cellulare estrinseco è anche una funzione dell&#39;espressione ligando cellulare intrinseca (Figura 3D). Inoltre, abbiamo osservato una sottopopolazione distinto di doppio-positivo (ALB + / + OPN) cellule nel atterramento DLL1 (Figura 3D). Insieme, questi risultati mostrano rappresentative: (1) le capacità combinatorie del formato array, come esemplificato dalla coppia di molteplici schierati proteine ​​ECM e ligandi Notch con l&#39;atterramento di singoli leganti; (2) la funzionalità non solo schierato proteine ​​ECM ma anche schierato ligando cellula-cellula con Proteina A / coniugazione G-mediata; e (3) l&#39;attuazione della nostra analisi singola cellula e la sua capacità di discernere sottopopolazioni unici. Abbiamo anche osservato che la differenziazione di progenitori epatici dipende sia la rigidità del substrato e la composizione ECM (Figura 4A </str<html> ong&gt;), in particolare trovando che il collagene IV è favorevole differenziazione su supporti morbidi e rigidi, mentre fibronectina supporta solo differenziazione su substrati rigidi (Figura 4B). Mappe di calore di misurazioni rappresentative TFM ha suggerito che lo stress prolungato di trazione a bassa rigidità del substrato sul collagene IV provocato differenziazione in cellule del dotto biliare (Figura 4C), un risultato confermato da valori medi di root-mean-square (Figura 4D). Insieme, questi risultati mostrano rappresentative: (1) il successo dell&#39;integrazione di TFM con microarrays di cellule su substrati con una rigidità sintonizzabile per valutare sia il fenotipo cellulare e lo stress di trazione; (2) il coordinamento del destino cellule progenitrici epatiche sia con la composizione della matrice e la rigidità del substrato; e (3) l&#39;attuazione della nostra analisi e tipici profili di stress trazione TFM in microarray cellulari. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Schema che mostra le prime tre sezioni sperimentali. Nella sezione 1, substrati di vetro vengono puliti e silanizzate per facilitare la realizzazione di idrogel di poliacrilamide. Nella sezione 2, le combinazioni di biomolecole di interesse sono preparati in una micropiastra fonte 384 pozzetti. Un Arrayer robotica viene poi caricato con perni pulito, la micropiastra fonte e gli idrogel di poliacrilamide e inizializzato, fabbricare le matrici sulle idrogel. Nella sezione 3, le cellule vengono seminate su domini Arrayed e ha permesso di aderire, al termine del quale viene eseguito il protocollo di cultura di interesse. Al punto finale, le cellule sono fissate per immunoistochimica / immunofluorescenza o analizzati utilizzando TFM. Barre di scala sono 75 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> entro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figura 2: elaborazione ed analisi dei dati da immunofluorescenza Array. (A) piastrella, immagini RGB composito a 32 bit vengono prima cestinate e poi suddiviso in singoli canali a 8 bit. Utilizzando una combinazione di marcatori fluorescenti disposte e isole cellulari, sono identificati tre angoli della matrice per consentire l&#39;orientamento automatico e gridding degli array. (B) di dati Single-cellula è generato per ogni canale delle matrici di ingresso. Al fine di tenere conto di deriva sperimentale, la normalizzazione quantile viene applicata da replicare biologica, la produzione di un singolo di distribuzione condivisa in tutte le repliche. Quantile dati normalizzati viene successivamente tracciata ed interpretato tramite calcolo delle misure Ensemble (ad esempio, cellule / isola, intensità media, le cellule percentuale positiva per un etichetta) o di analisi diretta di distribuzioni unicellulari.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figura 3: Notch Ligand Presentazione Mediazione di fegato Progenitor differenziazione. (A) ligandi Notch Fc-ricombinante Jagged-1 (JAG1) e Delta-simile 1 (DLL1) espone una migliore ritenzione e il clustering, quando schierato con proteina A / G. barra della scala è di 50 micron. Progenitori (B) del fegato differenziate in cellule del dotto biliare al momento della presentazione con Notch ligando. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) è un marchio di nucleare, l&#39;albumina (ALB) è un marker delle cellule epatiche, e osteopontina (OPN) è un marker biliare cellule del condotto. barra della scala è di 150 micron. (C) Quantificazione della percentuale di cellule positive per OPN per i ligandi Notch JAG1, DLL1, e Delta-like 4 (Dll4) sulle proteine ECM collagene I, collagen III, IV collagene, fibronectina e laminina. T -test di Student sono state eseguite contro IgG di controllo per ogni ligando Notch disposte all&#39;interno di ogni proteina ECM con valori di p indicato per P &lt;0,05 (*). (D) Imaging citometria di ALB e OPN per le cellule su collagene III presentati con i ligandi Notch JAG1, DLL1, e Dll4. Progenitori fegato senza il Notch ligandi DLL1 e JAG1 (vale a dire, shDll1 e shJag1) sono stati generati utilizzando shRNA atterramento. Dati in (C) presentati come media ± sem Questa figura è stata modificata da Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figura 4: Matrice Composizione e substrato Rigidità Coordinate Fegato Progenitor differenziazione. (A) differenziazione fegato progenitrici biliari cellule del dotto dipende sia composizione ECM e substrato rigidità. DAPI è un&#39;etichetta nucleare, ALB è un marker delle cellule epatiche, e OPN è un marcatore biliare cellule del condotto. (B) Quantificazione della percentuale di cellule positive per OPN su substrati di modulo di Young 30 kPa, 13 kPa, e 4 kPa per il collagene I (C1), collagene IV (C4), fibronectina (FN), e tutti bidirezionali combinazioni di quelle proteine ​​ECM. (C) lo stress cellulare trazione dipende sia rigidità substrato e la composizione ECM. (D) Quantificazione dei valori root-mean-square di stress di trazione su substrati di modulo di Young 30 kPa e 4 kPa per il collagene I (C1), il collagene IV (C4), fibronectina (FN), e tutte le combinazioni a due vie di coloro proteine ​​ECM. In (B) e (D), i dati sono stati presentati come media ± SEM e allievo di t -testsono stati eseguiti contro 30 kPa per ogni combinazione ECM con valori di P indicato per P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**), e P &lt;0.001 (***). Barre di scala sono 50 micron. Questa cifra è stata modificata da Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sezione </td><td fo:width="1.5in"> Problema </td><td fo:width="1.5in"> possibili cause </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Realizzazione di Polyacrylamide substrato. </td><td> Coprioggetti non può essere rimosso da idrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Ridurre il tempo di polimerizzazione a &lt;10 minuti (4 W / m 2). Controllare che crossli UVuscita nker è nel raggio d&#39;azione previsto. </td></tr><tr><td> Povero polimerizzazione poliacrilammide idrogel. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Aumentare il tempo di polimerizzazione a&gt; 10 minuti (4 W / m 2). Controllare che l&#39;uscita reticolante UV si trova nel raggio previsto. </td></tr><tr><td> idrogel poliacrilammide sono danneggiati dopo la rimozione del coprioggetti. </td><td> idrogel poliacrilammide morbide sono facili da danneggiare. </td><td> Osserviamo diminuendo la resa idrogel fabbricazione (~ 50%) per il più morbido (ad esempio, 4 kPa) idrogeli in particolare. Maneggiare idrogel delicatamente e aumentare il numero di partenza per raggiungere il rendimento desiderato. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Realizzazione di array. </td><td rowspan="2"> Scarsa o incoerenti morfologia posto. </td><td> funzione di umidificatore incoerente. </td><td> Controllare che umidificatore e reometro un funzionale nel corso di ogni tiratura e di mantenere il 65% di umidità relativa. </td></tr><tr><td> Pins bloccato in testina o intasareGED. </td><td> Pulire la testina di stampa per consentire il movimento del perno libero. perni Pulire accuratamente prima o dopo ogni tiratura per rimuovere aggregati dai canali pin. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. cellulare cultura e test di esecuzione. </td><td rowspan="2"> il distacco delle cellule morte o sugli array dopo il collegamento iniziale. </td><td> Semina e la proliferazione eccessiva. </td><td> Ridurre la densità di semina iniziale e il tempo. Utilizzare &quot;manutenzione&quot; o media &quot;differenziazione&quot; durante la cultura di matrice per ridurre la proliferazione cellulare. </td></tr><tr><td> Rilascio di monomero acrilammide tossici idrogel. </td><td> Immergere idrogel in dH 2 O per almeno 3 d per permettere la diffusione / rilascio di acrilammide monomero e ridurre la tossicità cellulare. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Le cellule non attribuiscono ad array. </td><td> Underseeding. </td><td> Aumentare la densità di semina iniziale e il tempo. Utilizzare un tipo di cellula più fortemente aderente. </td></tr><tr><td> Scarsa deposizione dimatrix o condizione biomolecole. </td><td> Pulire perni di particelle e aggregati, confermano i parametri di stampa, e valutare individuazione di marcatori fluorescenti, ad esempio, rodamina-destrano coniugato. </td></tr><tr><td> Specificità delle interazioni cellula-matrice. </td><td> Differenti tipi di cellule aderiscono specificamente per alcuni, ma non altre proteine ​​ECM. Prova più proteine ​​ECM differenti con le vostre cellule. </td></tr><tr><td> Storage Array non ottimale dopo la fabbricazione. </td><td> Si consiglia di conservare le matrici fabbricati durante la notte a 65% di umidità relativa e temperatura ambiente, in parte per evitare cambiamenti di fase durante il congelamento. L&#39;adesione cellulare è sensibile sia umidità, temperatura e tempo di conservazione; assicurarsi che questi parametri siano coerenti / ottimizzati per i vostri esperimenti. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Il distacco di idrogel dal substrato di vetro durante la coltura cellulare. </td><td> pulizia scivolo poveri e silanizzazione. </td><td> Sostituire le soluzioni di lavoro per la pulizia e la slittasilanizzazione. </td></tr><tr><td> idrogel Overdehydrated. </td><td> Non lasciare idrogel disidratanti su un piatto caldo per più di 15-30 minuti. </td></tr><tr><td> 4. Analisi dei dati. </td><td> Alta variabilità tra i punti replicare e diapositive. </td><td> La variabilità della matrice fabbricazione. </td><td> Controllare che i perni e le testine di stampa siano puliti. Confermare la funzione umidificatore. Visualizzare e quantificare posto e la matrice qualità utilizzando marcatori fluorescenti. array conservarlo come raccomandato sopra. </td></tr></tbody></table> Tabella 1: risoluzione dei problemi.

differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

L'obiettivo generale di questa piattaforma di microarray cellulare è quello di correlare le misurazioni della differenziazione cellulare e delle forze di trazione in funzione del contesto microambientale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale, consentendo sia indagini di base sulla biologia delle cellule staminali sia l'ottimizzazione di protocolli di differenziazione. I principali vantaggi di questa tecnica includono l'elevata produttività, la capacità di variare i segnali biochimici e biomeccanici e le letture finali mediante immunofluorescenza e microscopia delle forze di trazione, o TFM.Sebbene questi metodi siano stati utilizzati per lo studio della differenziazione dei progenitori epatici, possono essere facilmente applicati ad altri tipi cellulari arteriosi e contesti tissutali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il successo sperimentale dipende dall'integrazione del protocollo di allestimento con substrati di idrogel di alta qualità e con la microscopia delle forze di trazione. Per preparare idrogeli di poliacrilammide contenenti microsfere fluorescenti su una piastra di Petri da 35 mm con fondo in vetro silanizzato, al fine di valutare in tempo reale le interazioni cellula-substrato mediante microscopia delle forze di trazione, preparare innanzitutto i substrati di vetro in soluzioni come descritto nel protocollo testuale.Posizionare le capsule di Petri da 35 mm con fondo in vetro silanizzato in un vassoio di vetro per essiccazione e pipettare 20 microlitri di soluzione di iniziatore fotochimico con rapporto 9:1 tra prepolimero e perle al centro di ogni capsula. Coprire delicatamente ogni capsula con un coprioggetto circolare da 12 mm, evitando la formazione di bolle d'aria. Per distribuire le perle fluorescenti sulla superficie dell'idrogel, capovolgere le capsule e lasciarle a temperatura ambiente per 20 minuti.Con il piatto ancora capovolto, esporlo a UVA a 365 nanometri per 10 minuti. Ottimizzare il tempo di polimerizzazione secondo necessità. Successivamente, immergere gli idrogeli in tampone HEPES 1 M e lasciarli a temperatura ambiente al buio per tutta la notte.Rimuovere con attenzione le lamelle con un rasoio, avendo cura di non danneggiare gli idrogeli polimerizzati. Disidratare gli idrogeli a 50 gradi Celsius su una piastra riscaldante fino a completa essiccazione. Gli idrogeli possono essere conservati a temperatura ambiente al buio per tre mesi.Preparare i tamponi per stampare le biomolecole e per la piastra di origine come descritto nel protocollo testuale. Dopo aver caricato i pin puliti come descritto nel protocollo testuale, preparare il microarrayer e programmarlo utilizzando il software del produttore. Successivamente, accendere l'unità umidificatrice.Regolare il punto di settaggio al 65% di umidità relativa e attendere finché il reometro non raggiunge il valore impostato. Posizionare la piastra sorgente nell'adattatore appropriato. Quindi inserire i substrati di idrogel disidratati nell'adattatore corrispondente.Regolare i parametri del programma in modo da riflettere con precisione la disposizione della piastra di origine, il disegno dell'array e il formato desiderato. Avviare la fabbricazione dell'array. Verificare almeno una volta ogni ora che l'umidità non sia scesa al di sotto del 65% di umidità relativa e che i pin non siano ostruiti.Se l'umidità è scesa inaspettatamente, interrompere il processo di allestimento per riempire l'umidificatore e rimuovere la condensa dai tubi associati. Se i perni sono ostruiti, interrompere il processo di allestimento per pulire i perni oppure sostituirli con perni già puliti. Al termine del programma, posizionare le matrici realizzate in una scatola per vetrini o in una piastra micropozzetti coperta con carta d'alluminio.Lasciare gli array a temperatura ambiente al 65% di umidità relativa per tutta la notte. Per la nostra esperienza, le difficoltà più comuni sono legate alla fabbricazione degli array. Raccomandiamo di verificare la qualità tecnica e la robustezza degli array prodotti mediante l'uso di molecole marcate con fluorocromi, colorazioni generali per proteine e immunofluorescenze.Il giorno successivo alla fabbricazione, immergere le matrici in piastre di Petri da 35 mm in 3 mL di penicillina-streptomicina al 1% in volume/volume in PVS. Esporre i substrati disposti in matrice a UVC per 30 minuti. Successivamente, sostituire la soluzione di penicillina-streptomicina con il mezzo di coltura cellulare.Dopo aver raccolto e contato le cellule, seminare le cellule su array utilizzando 3 mL per ogni piastra di Petri da 35 mm. Incubare le colture su array a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per un periodo compreso tra due e 24 ore, oppure fino alla formazione di isole cellulari ben popolate. La densità di semina e il tempo possono essere regolati in base al tipo di cellule e all'applicazione specifica.Dopo aver consentito la formazione di isole cellulari, lavare le colture dell'array due volte con 3 mL di mezzo di coltura cellulare preriscaldato. A questo punto, è possibile aggiungere i controlli appropriati e i trattamenti di interesse al sistema biologico. Cambiare il mezzo degli array ogni uno o due giorni per mantenere costante la concentrazione dei trattamenti.Entro uno a cinque giorni dall'avvio delle colture su matrice, eseguire la valutazione in tempo reale delle interazioni tra cellule e substrato utilizzando la TFM. Spostare le piastre di Petri da 35 mm contenenti le colture su matrice su un microscopio fluorescente invertito con camera climatizzata e piattaforma robotizzata per le misurazioni TFM. In una piastra, segnare le posizioni e i piani di fuoco delle singole isole cellulari utilizzando la microscopia a contrasto di fase.Passare alla microscopia fluorescente a luce rossa per visualizzare le perle. Quindi tornare a ciascuna delle posizioni salvate nel passaggio precedente e correggere la coordinata z del piano di messa a fuoco, in modo che risulti a fuoco solo il primo strato di perle al di sotto dell'isola cellulare. Salvare le nuove coordinate e procedere all'acquisizione automatica delle immagini di tutte le isole cellulari per registrare le immagini in contrasto di fase e quelle fluorescenti a luce rossa prima della dissociazione.Successivamente, aggiungere con attenzione 150 microlitri di soluzione BSA/SDS alla piastra e attendere cinque minuti per consentire la completa dissociazione delle cellule dal substrato. Monitorare la dissociazione cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase. Dopo che le isole cellulari si sono dissociate dal substrato, tornare alle posizioni marcate e verificare che il primo strato di microsfere sia ancora a fuoco.Se questi microsfera sono fuori dal piano a causa di una deformazione indotta dalla trazione generata dalle cellule, correggere la coordinata z del piano messo a fuoco in modo che siano nuovamente a fuoco. Salvare le coordinate z corrette e ripetere l'acquisizione automatica delle immagini di tutte le isole per ottenere le immagini fluorescenti nel vicino infrarosso dopo la dissociazione. Ripetere questi passaggi per le restanti piastre.I ligandi della nottolina coniugati con proteina A/G, jagged uno e delta come uno, hanno mostrato un migliorato trattenimento negli idrogeli. La presentazione del ligando della nottolina ha inoltre indotto la differenziazione dei progenitori epatici verso un destino di cellula del dotto biliare, come indicato dalla presenza del marcatore verde per le cellule del dotto biliare. La risposta ai ligandi della nottolina è stata quantificata per cinque proteine della matrice extracellulare, o ECM, e ha mostrato che la risposta dei progenitori epatici ai ligandi dipende dal contesto della matrice extracellulare.L'abbattimento mediato da RNA a forcina corta è stato utilizzato per generare progenitori privi dei ligandi delta like one e jagged one. Le cellule sono state quindi esposte ai ligandi notch jagged one, delta like one e delta like four. La risposta al ligando notch disposto in array ha mostrato variazioni in base all'espressione intrinseca della cellula per ciascun ligando.Queste immagini mostrano la differenziazione dei progenitori epatici in funzione sia della rigidità del substrato che della composizione della matrice extracellulare (ECM). Un'analisi quantitativa ha rivelato che il collagene IV favorisce la differenziazione sia su substrati morbidi che rigidi, mentre la fibronectina supporta la differenziazione soltanto su substrati rigidi. Le mappe termiche rappresentative suggeriscono che lo stress meccanico prolungato a bassa rigidità del substrato, in presenza di collagene IV, promuove la differenziazione in cellule del dotto biliare.Questo risultato è stato confermato dalla quantificazione dei valori medi quadratici medi delle tensioni di trazione. Questo video e il protocollo associato hanno illustrato i passaggi principali per la fabbricazione di idrogeli e matrici per coltivare cellule su substrati in array e per misurare le interazioni tra cellule e substrato mediante microscopia della forza di trazione. Dopo aver acquisito familiarità con le tecniche, ogni esperimento può essere completato in appena una o due settimane se eseguito correttamente.A differenza di questo metodo, le colture cellulari dovrebbero essere utilizzate per convalidare le condizioni dell'array con punteggio elevato mediante PCR qualitativa, immunoblotting, assi meccanobiologici su scala standard o altre tecniche molecolari complementari. Questa piattaforma versatile può essere applicata allo studio ad alto rendimento delle funzioni cellulari in un'ampia varietà di contesti cellulari e tissutali, inclusa la differenziazione delle cellule staminali e la biologia delle cellule tumorali.

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