Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l'analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

L'obiettivo generale di questa piattaforma di microarray cellulari è quello di correlare le misurazioni della differenziazione cellulare e delle forze di trazione in funzione del contesto microambientale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale, consentendo sia indagini fondamentali sulla biologia delle cellule staminali che l'ottimizzazione dei protocolli di differenziazione. I principali vantaggi di questa tecnica includono la sua produttività, la capacità di variare i segnali biochimici e biofisici e le letture dei punti finali sia mediante immunofluorescenze che mediante microscopia a forza di trazione, o TFM.

Sebbene abbiano utilizzato questi metodi, coloro che comprendono la differenziazione dei progenitori del fegato possono essere facilmente applicati ad altri tipi di cellule arteriose e contesti tissutali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il successo dell'esperimento dipende dall'integrazione del protocollo di arraying sia con substrati di idrogel di alta qualità che con la microscopia della forza di trazione. Per fabbricare perle fluorescenti contenenti idrogel di poliacrilammide su una piastra di Petri silanizzata da 35 mm con fondo di vetro per la valutazione in tempo reale delle interazioni con il substrato cellulare utilizzando TFM, preparare innanzitutto i substrati di vetro in soluzioni come descritto nel protocollo di testo.

Posizionare le piastre di Petri con fondo in vetro silanizzato da 35 mm in un vassoio di essiccazione in vetro e pipettare 20 microlitri di perlina pre-polimero 9 a 1 in soluzione fotoiniziatrice al centro di ciascuna capsula. Coprire delicatamente ogni piatto con un vetrino coprioggetti circolare da 12 mm evitando la creazione di bolle. Per distribuire le perle fluorescenti sulla superficie dell'idrogel, capovolgere le piastre e lasciarle a temperatura ambiente per 20 minuti.

Mentre è ancora capovolto, esporre la parabola ai raggi UVA a 365 nanometri per 10 minuti. Ottimizza il tempo di polimerizzazione secondo necessità. Quindi, immergere gli idrogel in un tampone HEPES da 1 molare e lasciarli a temperatura ambiente al buio per una notte.

Rimuovere accuratamente i vetrini coprioggetto con un rasoio, facendo attenzione a non danneggiare gli idrogel polimerizzati. Disidratare gli idrogel a 50 gradi Celsius su una piastra calda fino a quando non si asciugano. Gli idrogel possono essere conservati a temperatura ambiente al buio per tre mesi.

Preparare i tamponi per stampare le biomolecole e per la piastra di origine come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver caricato i pin puliti come descritto nel protocollo di testo, preparare il microarrayer e programmarlo utilizzando il software del produttore. Quindi, accendere l'unità umidificatore.

Regolare il set point al 65% di umidità relativa e attendere che il reometro corrisponda al set point. Posizionare la piastra di origine nell'adattatore appropriato. Quindi posizionare i substrati di idrogel disidratati nell'adattatore appropriato.

Regola i parametri del programma per riflettere accuratamente il layout della piastra sorgente, il design dell'array e il formato desiderato. Avviare la fabbricazione dell'array. Controllare almeno una volta all'ora che l'umidità non sia scesa al di sotto del 65% di umidità relativa e che i perni non siano ostruiti.

Se l'umidità è diminuita inaspettatamente, mettere in pausa l'array per riempire l'umidificatore e liberare i tubi associati dalla condensa. Se i pin sono ostruiti, mettere in pausa l'array per pulire i pin o sostituirli in altro modo con pin pre-puliti. Una volta completato il programma, posizionare gli array fabbricati in una scatola di diapositive o in una micropiastra ricoperta con un foglio di alluminio.

Lasciare gli array a temperatura ambiente al 65% di umidità relativa per una notte. Nella nostra esperienza, le difficoltà più comuni sono legate alla fabbricazione di array. Si consiglia di confermare la qualità tecnica e la robustezza degli array fabbricati utilizzando molecole marcate con fluoro, coloranti proteici generici e immunofluorescenze.

Il giorno dopo la fabbricazione, immergere le piastre di Petri array da 35 mm in 3 mL di penicillina-streptomicina all'1% in volume in PVS. Esporre i substrati disordinati in UVC per 30 minuti. Quindi sostituire la soluzione di penicillina-streptomicina con terreni di coltura cellulare.

Dopo aver raccolto e contato le cellule, seminare le cellule su array a 3 mL per piastra di Petri da 35 mm. Incubare le colture array a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 2-24 ore, o fino alla formazione di isole cellulari ben popolate. La densità e il tempo di semina possono essere regolati a seconda delle celle e dell'applicazione specifica.

Dopo aver consentito la formazione di isole cellulari, lavare due volte le colture array con 3 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato. A questo punto, si possono aggiungere al sistema biologico gli opportuni controlli e i trattamenti di interesse. Cambiare i media degli array ogni uno o due giorni per mantenere la concentrazione di qualsiasi trattamento.

Entro uno-cinque giorni dall'inizio delle colture array, eseguire la valutazione in tempo reale delle interazioni con il substrato cellulare utilizzando TFM. Spostare le piastre di Petri da 35 mm contenenti colture array in un microscopio a fluorescenza incubato incubato con un tavolino robotico per le misure TFM. In un piatto, segnare le posizioni e i piani di messa a fuoco delle singole isole cellulari utilizzando la microscopia a contrasto di fase.

Passa alla microscopia fluorescente a rosso lontano per visualizzare le perline. Quindi torna a ciascuna delle posizioni salvate nel passaggio precedente e correggi la coordinata z del piano di messa a fuoco, in modo che solo il primo strato di perline sotto l'isola di celle sia a fuoco. Salva le nuove coordinate e procedi all'imaging automatizzato di tutte le isole cellulari per acquisire il contrasto di fase pre-dissociazione e le immagini fluorescenti rosso lontano.

Successivamente, aggiungere con cautela 150 microlitri di soluzione BSA/SDS al piatto e attendere cinque minuti per consentire la completa dissociazione cellulare dal substrato. Monitorare la dissociazione cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase. Dopo che le isole cellulari sono state dissociate dal substrato, tornare alle posizioni contrassegnate e verificare che il primo strato di perle sia ancora a fuoco.

Se queste perle sono fuori piano a causa della deformazione indotta dalla trazione generata dalla cella, correggere la coordinata z del piano focalizzato in modo che siano di nuovo a fuoco. Salva le coordinate z corrette e ripeti l'imaging automatico di tutte le isole per acquisire le immagini fluorescenti rosse lontane post-dissociazione. Ripeti questi passaggi per i piatti rimanenti.

I ligandi di notch coniugati con proteina A/G hanno mostrato una migliore ritenzione negli idrogel. La presentazione del ligando notch ha anche guidato la differenziazione dei progenitori epatici verso un destino delle cellule del dotto biliare, come indicato dalla presenza del marcatore verde delle cellule del dotto biliare. La risposta ai ligandi notch è stata quantificata per cinque proteine della matrice extracellulare, o ECM, e ha dimostrato che la risposta dei progenitori epatici ai ligandi dipende dal contesto ECM.

Il knockdown dell'RNA a forcina è stato utilizzato per generare progenitori senza i ligandi delta e frastagliati. Le cellule sono state quindi presentate con i ligandi notch frastagliati uno e delta come uno e delta come quattro. La risposta al ligando notch variava a seconda dell'espressione intrinseca cellulare di entrambi i ligandi.

Queste immagini mostrano che la differenziazione dei progenitori epatici dipende sia dalla rigidità del substrato che dalla composizione della ECM. L'analisi quantitativa ha rivelato che il collagene quattro supporta la differenziazione sia su substrati morbidi che rigidi, mentre la fibronectina supporta solo la differenziazione su substrati rigidi. Le mappe di calore rappresentative suggeriscono che lo stress di trazione prolungato a bassa rigidità del substrato sul collagene quattro promuove la differenziazione in cellule del dotto biliare.

Questo risultato è stato confermato dalla quantificazione dei valori quadratici medi dello stress di trazione. Questo video e il protocollo di accompagnamento hanno fornito i passaggi principali per la fabbricazione di idrogel e array per l'esecuzione di colture cellulari sui substrati allineati e per la misurazione delle interazioni tra i substrati cellulari utilizzando la microscopia della forza di trazione. Dopo aver acquisito familiarità con le tecniche, ogni esperimento può essere completato in appena una o due settimane se eseguito correttamente.

In concomitanza con questo metodo, le colture cellulari dovrebbero essere utilizzate per convalidare le condizioni di array ad alto punteggio utilizzando la PCR qualitativa, l'immuno blotting, gli assi di meccanobiologia su scala standard o altre tecniche complementari di biologia molecolare. Questa versatile piattaforma può essere applicata per lo studio ad alto rendimento delle funzioni cellulari in un ampio numero di contesti cellulari e tissutali, tra cui la differenziazione delle cellule staminali e la biologia delle cellule tumorali.