Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l'analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

L'obiettivo generale di questa piattaforma di microarray cellulare è quello di correlare le misurazioni della differenziazione cellulare e delle forze di trazione in funzione del contesto microambientale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale, consentendo sia indagini di base sulla biologia delle cellule staminali sia l'ottimizzazione di protocolli di differenziazione. I principali vantaggi di questa tecnica includono l'elevata produttività, la capacità di variare i segnali biochimici e biomeccanici e le letture finali mediante immunofluorescenza e microscopia delle forze di trazione, o TFM.

Sebbene questi metodi siano stati utilizzati per lo studio della differenziazione dei progenitori epatici, possono essere facilmente applicati ad altri tipi cellulari arteriosi e contesti tissutali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il successo sperimentale dipende dall'integrazione del protocollo di allestimento con substrati di idrogel di alta qualità e con la microscopia delle forze di trazione. Per preparare idrogeli di poliacrilammide contenenti microsfere fluorescenti su una piastra di Petri da 35 mm con fondo in vetro silanizzato, al fine di valutare in tempo reale le interazioni cellula-substrato mediante microscopia delle forze di trazione, preparare innanzitutto i substrati di vetro in soluzioni come descritto nel protocollo testuale.

Posizionare le capsule di Petri da 35 mm con fondo in vetro silanizzato in un vassoio di vetro per essiccazione e pipettare 20 microlitri di soluzione di iniziatore fotochimico con rapporto 9:1 tra prepolimero e perle al centro di ogni capsula. Coprire delicatamente ogni capsula con un coprioggetto circolare da 12 mm, evitando la formazione di bolle d'aria. Per distribuire le perle fluorescenti sulla superficie dell'idrogel, capovolgere le capsule e lasciarle a temperatura ambiente per 20 minuti.

Con il piatto ancora capovolto, esporlo a UVA a 365 nanometri per 10 minuti. Ottimizzare il tempo di polimerizzazione secondo necessità. Successivamente, immergere gli idrogeli in tampone HEPES 1 M e lasciarli a temperatura ambiente al buio per tutta la notte.

Rimuovere con attenzione le lamelle con un rasoio, avendo cura di non danneggiare gli idrogeli polimerizzati. Disidratare gli idrogeli a 50 gradi Celsius su una piastra riscaldante fino a completa essiccazione. Gli idrogeli possono essere conservati a temperatura ambiente al buio per tre mesi.

Preparare i tamponi per stampare le biomolecole e per la piastra di origine come descritto nel protocollo testuale. Dopo aver caricato i pin puliti come descritto nel protocollo testuale, preparare il microarrayer e programmarlo utilizzando il software del produttore. Successivamente, accendere l'unità umidificatrice.

Regolare il punto di settaggio al 65% di umidità relativa e attendere finché il reometro non raggiunge il valore impostato. Posizionare la piastra sorgente nell'adattatore appropriato. Quindi inserire i substrati di idrogel disidratati nell'adattatore corrispondente.

Regolare i parametri del programma in modo da riflettere con precisione la disposizione della piastra di origine, il disegno dell'array e il formato desiderato. Avviare la fabbricazione dell'array. Verificare almeno una volta ogni ora che l'umidità non sia scesa al di sotto del 65% di umidità relativa e che i pin non siano ostruiti.

Se l'umidità è scesa inaspettatamente, interrompere il processo di allestimento per riempire l'umidificatore e rimuovere la condensa dai tubi associati. Se i perni sono ostruiti, interrompere il processo di allestimento per pulire i perni oppure sostituirli con perni già puliti. Al termine del programma, posizionare le matrici realizzate in una scatola per vetrini o in una piastra micropozzetti coperta con carta d'alluminio.

Lasciare gli array a temperatura ambiente al 65% di umidità relativa per tutta la notte. Per la nostra esperienza, le difficoltà più comuni sono legate alla fabbricazione degli array. Raccomandiamo di verificare la qualità tecnica e la robustezza degli array prodotti mediante l'uso di molecole marcate con fluorocromi, colorazioni generali per proteine e immunofluorescenze.

Il giorno successivo alla fabbricazione, immergere le matrici in piastre di Petri da 35 mm in 3 mL di penicillina-streptomicina al 1% in volume/volume in PVS. Esporre i substrati disposti in matrice a UVC per 30 minuti. Successivamente, sostituire la soluzione di penicillina-streptomicina con il mezzo di coltura cellulare.

Dopo aver raccolto e contato le cellule, seminare le cellule su array utilizzando 3 mL per ogni piastra di Petri da 35 mm. Incubare le colture su array a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per un periodo compreso tra due e 24 ore, oppure fino alla formazione di isole cellulari ben popolate. La densità di semina e il tempo possono essere regolati in base al tipo di cellule e all'applicazione specifica.

Dopo aver consentito la formazione di isole cellulari, lavare le colture dell'array due volte con 3 mL di mezzo di coltura cellulare preriscaldato. A questo punto, è possibile aggiungere i controlli appropriati e i trattamenti di interesse al sistema biologico. Cambiare il mezzo degli array ogni uno o due giorni per mantenere costante la concentrazione dei trattamenti.

Entro uno a cinque giorni dall'avvio delle colture su matrice, eseguire la valutazione in tempo reale delle interazioni tra cellule e substrato utilizzando la TFM. Spostare le piastre di Petri da 35 mm contenenti le colture su matrice su un microscopio fluorescente invertito con camera climatizzata e piattaforma robotizzata per le misurazioni TFM. In una piastra, segnare le posizioni e i piani di fuoco delle singole isole cellulari utilizzando la microscopia a contrasto di fase.

Passare alla microscopia fluorescente a luce rossa per visualizzare le perle. Quindi tornare a ciascuna delle posizioni salvate nel passaggio precedente e correggere la coordinata z del piano di messa a fuoco, in modo che risulti a fuoco solo il primo strato di perle al di sotto dell'isola cellulare. Salvare le nuove coordinate e procedere all'acquisizione automatica delle immagini di tutte le isole cellulari per registrare le immagini in contrasto di fase e quelle fluorescenti a luce rossa prima della dissociazione.

Successivamente, aggiungere con attenzione 150 microlitri di soluzione BSA/SDS alla piastra e attendere cinque minuti per consentire la completa dissociazione delle cellule dal substrato. Monitorare la dissociazione cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase. Dopo che le isole cellulari si sono dissociate dal substrato, tornare alle posizioni marcate e verificare che il primo strato di microsfere sia ancora a fuoco.

Se questi microsfera sono fuori dal piano a causa di una deformazione indotta dalla trazione generata dalle cellule, correggere la coordinata z del piano messo a fuoco in modo che siano nuovamente a fuoco. Salvare le coordinate z corrette e ripetere l'acquisizione automatica delle immagini di tutte le isole per ottenere le immagini fluorescenti nel vicino infrarosso dopo la dissociazione. Ripetere questi passaggi per le restanti piastre.

I ligandi della nottolina coniugati con proteina A/G, jagged uno e delta come uno, hanno mostrato un migliorato trattenimento negli idrogeli. La presentazione del ligando della nottolina ha inoltre indotto la differenziazione dei progenitori epatici verso un destino di cellula del dotto biliare, come indicato dalla presenza del marcatore verde per le cellule del dotto biliare. La risposta ai ligandi della nottolina è stata quantificata per cinque proteine della matrice extracellulare, o ECM, e ha mostrato che la risposta dei progenitori epatici ai ligandi dipende dal contesto della matrice extracellulare.

L'abbattimento mediato da RNA a forcina corta è stato utilizzato per generare progenitori privi dei ligandi delta like one e jagged one. Le cellule sono state quindi esposte ai ligandi notch jagged one, delta like one e delta like four. La risposta al ligando notch disposto in array ha mostrato variazioni in base all'espressione intrinseca della cellula per ciascun ligando.

Queste immagini mostrano la differenziazione dei progenitori epatici in funzione sia della rigidità del substrato che della composizione della matrice extracellulare (ECM). Un'analisi quantitativa ha rivelato che il collagene IV favorisce la differenziazione sia su substrati morbidi che rigidi, mentre la fibronectina supporta la differenziazione soltanto su substrati rigidi. Le mappe termiche rappresentative suggeriscono che lo stress meccanico prolungato a bassa rigidità del substrato, in presenza di collagene IV, promuove la differenziazione in cellule del dotto biliare.

Questo risultato è stato confermato dalla quantificazione dei valori medi quadratici medi delle tensioni di trazione. Questo video e il protocollo associato hanno illustrato i passaggi principali per la fabbricazione di idrogeli e matrici per coltivare cellule su substrati in array e per misurare le interazioni tra cellule e substrato mediante microscopia della forza di trazione. Dopo aver acquisito familiarità con le tecniche, ogni esperimento può essere completato in appena una o due settimane se eseguito correttamente.

A differenza di questo metodo, le colture cellulari dovrebbero essere utilizzate per convalidare le condizioni dell'array con punteggio elevato mediante PCR qualitativa, immunoblotting, assi meccanobiologici su scala standard o altre tecniche molecolari complementari. Questa piattaforma versatile può essere applicata allo studio ad alto rendimento delle funzioni cellulari in un'ampia varietà di contesti cellulari e tissutali, inclusa la differenziazione delle cellule staminali e la biologia delle cellule tumorali.