Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di assemblare e utilizzare una piattaforma semi-automatizzata basata su microfluidica per coltivare e stimolare piccole popolazioni di cellule e recuperare lisati cellulari per analisi molecolari. Ciò si ottiene stabilendo prima colture cellulari su microscala in micro capillari rivestiti di fibronectina denominati camere di perfusione cellulare. Il secondo passo consiste nel collegare le camere di perfusione a un modulo digitale di microfluidica o DMF, che fornisce un mezzo flessibile attraverso il quale i reagenti vengono instradati da e verso le colture cellulari su microscala.

Successivamente, il modulo DMF eroga lo stimolo di interesse alle camere di perfusione e le cellule vengono incubate con lo stimolo per un tempo di esposizione predeterminato. Infine, le cellule vengono lisate con mezzi chimici e i lisati vengono recuperati sul modulo DMF per l'analisi molecolare. I lisati recuperati vengono quindi analizzati utilizzando la R-T-P-C-R quantitativa al fine di caratterizzare la risposta trascrizionale della popolazione cellulare allo stimolo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi convenzionali di coltura cellulare, è che con questa tecnica è possibile eseguire studi di stimolazione cellulare utilizzando piccole quantità di cellule e anche utilizzare piccole quantità di reagenti. La nostra ricerca ha dimostrato che la gestione precisa delle cellule e dei reagenti su microscala riduce al minimo la variabilità da esperimento a esperimento. Anche la piattaforma è molto versatile.

Il modulo digitale a microflusso è in grado di instradare cellule e reagenti da e verso le camere di perfusione con grande flessibilità, in modo che gli esperimenti possano essere personalizzati e riconfigurati in modo rapido e semplice. Per iniziare, preparare una soluzione sterile di 50 microgrammi per millilitro di fibronectina e utilizzare una pompa a siringa multiporta per aspirare 30 microlitri di soluzione in ciascun micro capillare per accelerare il rivestimento delle superfici interne del micro capillare. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore, quindi prelevare e scartare la soluzione di fibronectina e lasciare asciugare i micro capillari a temperatura ambiente per sei ore.

Quindi, collegare i micro capillari rivestiti in fibra di nin o le camere di perfusione al tubo in policarbonato e il tubo alla pompa a siringa utilizzando raccordi capite. La configurazione mostrata qui utilizza una pompa a siringa con porta di aiuto che supporta sei camere di perfusione. Usando del nastro adesivo, fissare il corpo di ciascuna camera di perfusione a un blocco termico e impostare la temperatura dei blocchi di calore a 37 gradi Celsius.

Quindi immergere le estremità aperte delle camere di perfusione in un serbatoio contenente cellule, sospese in crescita fresca, terreno uniformemente disperso a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Istruire la pompa-siringa a tirare 10 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna camera di perfusione. Quindi rimuovere le estremità aperte delle camere di perfusione dalla sospensione cellulare e istruire la pompa a siringa ad aspirare abbastanza aria per spostare i tappi di liquido nelle sezioni fissate al blocco termico.

Lasciare che le cellule aderiscano alle superfici interne rivestite di fibronectina delle camere di perfusione incubandole a 37 gradi Celsius per una o due ore. Nel frattempo, trasferire le estremità aperte delle camere di perfusione in un nuovo serbatoio contenente un terreno di coltura fresco. Trascorso il periodo di adesione, istruire la pompa a siringa a mandare i tappi di liquido allo spreco e quindi aspirare 10 microlitri di terreno fresco in ciascuna camera di profusione, seguiti da aria sufficiente per posizionare il terreno fresco sopra le celle aderenti.

Continuare a incubare le cellule a 37 gradi Celsius, sostituendo il terreno ogni due ore fino a quando le colture non saranno sufficientemente equilibrate ed espanse. Modello. La piastra inferiore del modulo DMF con 46 elettrodi di ossido di indio e stagno. Utilizzando tecniche fotolitografiche standard, rivestire la piastra inferiore del modulo DMF con cinque micron di Lene C tramite deposizione chimica da vapore, quindi rivestire con 50 nanometri di Teflon af.

Successivamente, spin coat e substrato di vetro all'ossido di indio-stagno non modellato con 50 nanometri di Teflon AF da utilizzare come piastra superiore. Utilizzare telai di compressione in metallo per fissare le piastre in una fusione di polimero con incavi che mantengono una distanza di 400 micron tra le piastre. Questa spaziatura, combinata con la dimensione dell'elettrodo di attuazione di 2,5 millimetri quadrati, definisce il volume delle gocce come 2,5 microlitri per elettrodo.

Quindi inserire i micro capillari di trasferimento rivestiti in teflon nello spazio tra le piastre DMF. Posizionando ciascuno in modo che si estenda fino al bordo del suo elettrodo di azionamento affine all'estremità opposta di ciascun trasferimento. Affisso micro capillare un raccordo capite.

Quindi, innestare i connettori elettrici per fornire tensione agli elettrodi di ossido di indio 10. Le sequenze di attivazione degli elettrodi sono automatizzate attraverso l'uso di un'interfaccia elettronica controllata da computer che esegue script predeterminati. Quindi riempire i serbatoi integrati dei moduli DMF con i reagenti appropriati per la stimolazione cellulare, il lavaggio e la lisi.

In alcuni casi, è meglio caricare lo stimolo stesso in una fase successiva, appena prima del suo utilizzo, attingendo dai serbatoi di bordo caricati, erogare micro goccioline sul modulo DMF. Test, azionamento delle micro goccioline, compreso il loro trasporto tra il modulo DMF e i micro capillari di trasferimento. Blais. Per prima cosa, preparare lo stimolo in terreno fresco con 0,1% di onic F1 27 a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro.

Quindi caricare da 80 a 100 microlitri di stimolo nel serbatoio di bordo designato. Quindi, rimuovere le estremità aperte delle camere di perfusione dal serbatoio del mezzo e inserirle nei raccordi capite fissati alle estremità dei micro capillari di trasferimento, quindi istruire la pompa a siringa a inviare i tappi di liquido all'interno delle camere di perfusione al contenitore dei rifiuti. Successivamente, istruire il modulo DMF a generare 10 microlitri di goccioline di stimolo e a consegnarle alle camere di perfusione attraverso i microcapillari di trasferimento.

Incubare le cellule con lo stimolo a 37 gradi Celsius per una o quattro ore, se necessario. Scambia con un nuovo stimolo a intervalli regolari dopo il periodo di stimolazione. Istruire la pompa a siringa a inviare lo stimolo al contenitore dei rifiuti e istruire il modulo DMF a erogare una goccia da 10 microlitri di tampone di lavaggio a ciascuna camera di perfusione.

Incubare le cellule con il tampone di lavaggio per cinque minuti. Quindi sostituire il tampone di lavaggio con 10 microlitri di soluzione di lisi e incubare per altri cinque minuti. Quindi, istruire la pompa a siringa a inviare ciascun lisato cellulare al modulo DMF.

Rimuovere la piastra superiore del modulo DMF facendo attenzione a non inclinare la piastra lateralmente in quanto ciò può causare una contaminazione incrociata tra le goccioline. Infine, raccogliere i lisati dal modulo DMF aperto utilizzando un pipettatore per l'analisi fuori piattaforma, come l'espressione genica, la profilazione tramite R-T-P-C-R quantitativa per preparare la piattaforma per l'esperimento successivo. Innanzitutto, immergere i micro capillari di trasferimento, i raccordi CAPITE e le piastre del modulo DMF in candeggina al 10% per 10 minuti a temperatura ambiente, le piastre del modulo DMF vengono risciacquate con isopropanolo seguito da acqua deionizzata e asciugate con azoto gassoso, quindi cuocere a 160 gradi Celsius per 10 minuti.

I metodi di semina descritti in questo protocollo hanno portato all'adesione di circa 500 macrofagi miren per camera di perfusione. Dopo aver incubato le cellule con un terreno di crescita a 37 gradi Celsius per 16 ore, la dimensione della popolazione è raddoppiata a circa 1000 cellule per camera di perfusione. Qui sono mostrati i risultati dell'analisi quantitativa R-T-P-C-R di quattro geni noti per svolgere ruoli importanti nelle risposte immunitarie innate ai batteri.

I macrofagi sono stati coltivati in colture convenzionali o su microscala e stimolati con particelle bio di e coli per una o quattro ore. Le barre blu indicano l'aumento medio dell'espressione genica in seguito alla stimolazione di cellule coltivate in modo convenzionale, mentre le barre rosse indicano l'espressione indotta nelle cellule cresciute e stimolate. Nelle colture su microscala, le barre di errore indicano deviazioni standard tra le repliche biologiche di tre esperimenti indipendenti.

I risultati del profilo di espressione genica erano molto simili, anche se le colture convenzionali utilizzavano piastre da 96 pozzetti con circa 50.000 cellule per pozzetto, mentre le colture su microscala utilizzavano micro capillari con circa 1000 cellule per camera di perfusione. Riduzione del consumo di cellule di cinque volte e riduzione del consumo di reagenti da tre a 50 volte. Rispetto agli esperimenti convenzionali.

Il metodo potrebbe essere utilizzato per coltivare, praticamente qualsiasi tipo di cellula di aderenza, in alcuni casi utilizzando un diverso componente della matrice extracellulare o la crescita. I tipi di cellule con media non aderenza possono essere impegnativi, ma le strategie di legame cellulare hanno dimostrato di avere successo in contesti simili. L'approccio descritto qui supporta la coltura su microscala per un massimo di 24 ore.

La piattaforma include tutte le funzioni per eseguire anche una coltura a lungo termine, ma è necessario sviluppare un protocollo di passaggio cellulare. Moduli aggiuntivi possono essere integrati nel cubo microfluidico digitale attraverso le interconnessioni micro capillari. In questo modo, il DMF funge da hub centrale per il collegamento dei moduli periferici per l'esecuzione di flussi di lavoro complessi.

Ci siamo concentrati principalmente sulla caratterizzazione delle risposte trascrizionali dell'ospite agli agenti infettivi, ma la piattaforma è progettata per essere estremamente versatile e quindi dovrebbe supportare un'ampia varietà di applicazioni di ricerca.