Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

L'obiettivo generale di questa procedura è assemblare e utilizzare una piattaforma basata su microfluidica semi-automatica per coltivare e stimolare piccole popolazioni cellulari e recuperare lisati cellulari per analisi molecolari. Questo viene realizzato innanzitutto stabilendo colture cellulari su scala microscopica all'interno di microcapillari rivestiti con fibronectina, denominati camere di perfusione cellulare. Il secondo passaggio consiste nel collegare le camere di perfusione a un modulo di microfluidica digitale o DMF, che fornisce un mezzo flessibile per indirizzare reagenti verso e provenienti dalle colture cellulari su scala microscopica.

Successivamente, il modulo DMF eroga lo stimolo di interesse alle camere di perfusione e le cellule vengono incubate con lo stimolo per un tempo predeterminato di esposizione. Infine, le cellule vengono lisate per via chimica e i lisati vengono recuperati sul modulo DMF per l'analisi molecolare. I lisati recuperati vengono quindi analizzati mediante R-T-P-C-R quantitativa per caratterizzare la risposta trascrizionale della popolazione cellulare allo stimolo.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi convenzionali di coltura cellulare consiste nella possibilità di effettuare studi di stimolazione cellulare utilizzando piccole quantità di cellule e di reagenti. La nostra ricerca ha dimostrato che la gestione precisa di cellule e reagenti su scala microscopica da parte della piattaforma riduce al minimo la variabilità tra un esperimento e l'altro. La piattaforma è inoltre molto versatile.

Il modulo microfluido digitale può indirizzare cellule e reagenti verso e dalle camere di perfusione con grande flessibilità, consentendo di personalizzare e riconfigurare rapidamente ed facilmente gli esperimenti. Per iniziare, preparare una soluzione sterile di 50 microgrammi per millilitro di fibronectina ed utilizzare una pompa per siringhe a più vie per aspirare 30 microlitri della soluzione in ciascun microcapillare, accelerando così il rivestimento delle superfici interne del microcapillare. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore, quindi aspirare e scartare la soluzione di fibronectina e lasciare asciugare i microcapillari a temperatura ambiente per sei ore.

Successivamente, collegare la fibra nin microcapillari rivestiti o camere di perfusione a un tubo in policarbonato e il tubo alla pompa per siringhe utilizzando raccordi capite. L'allestimento qui mostrato utilizza una pompa per siringhe con porta ausiliaria che supporta sei camere di perfusione. Utilizzando del nastro adesivo, fissare il corpo di ciascuna camera di perfusione a un blocco riscaldante e impostare la temperatura del blocco a 37 gradi Celsius.

Quindi immergere le estremità aperte delle camere di perfusione in un serbatoio contenente cellule, sospese in un mezzo di crescita fresco, distribuite uniformemente a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Impostare la pompa per siringa in modo da aspirare 10 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna camera di perfusione. Successivamente, rimuovere le estremità aperte delle camere di perfusione dalla sospensione cellulare e impostare la pompa per siringa in modo da aspirare una quantità sufficiente di aria per spostare i tappi di liquido nelle sezioni fissate al blocco riscaldante.

Lasciare che le cellule aderiscano alle superfici interne rivestite con fibronectina delle camere di perfusione, incubandole a 37 gradi Celsius per uno o due ore. Nel frattempo, trasferire le estremità aperte delle camere di perfusione in un nuovo serbatoio contenente mezzo di crescita fresco. Al termine del periodo di adesione, impostare la pompa a siringa affinché invii i tappi liquidi allo scarto, quindi aspiri 10 microlitri di mezzo fresco in ciascuna camera di perfusione, seguiti da una quantità sufficiente di aria per posizionare il mezzo fresco sopra le cellule aderenti.

Continuare a incubare le cellule a 37 gradi Celsius, sostituendo il mezzo ogni due ore fino a quando le colture sono sufficientemente equilibrate ed espanse.Modello. La piastra inferiore del modulo DMF con 46 elettrodi in ossido di indio e stagno. Utilizzando tecniche fotolitografiche standard, rivestire la piastra inferiore del modulo DMF con cinque micron di Lene C mediante deposizione chimica da vapore, quindi applicare un rivestimento mediante centrifugazione con 50 nanometri di Teflon af.

Successivamente, eseguire un rivestimento a centrifuga con uno strato non strutturato di ossido di indio e stagno su vetro, depositando 50 nanometri di Teflon AF da utilizzare come piastra superiore. Utilizzare telai metallici di compressione per fissare le piastre in un supporto polimerico con cavità che mantengono una distanza di 400 micron tra le piastre. Questa distanza, combinata con la dimensione dell'elettrodo di attuazione di 2,5 millimetri quadrati, definisce il volume della goccia come 2,5 microlitri per elettrodo.

Inserire quindi microcapillari di trasferimento rivestiti in teflon nello spazio tra le piastre DMF. Posizionare ciascuno in modo che si estenda fino al bordo del relativo elettrodo di attuazione, fino all'estremità opposta di ciascun trasferimento. Fissare un raccordo sul microcapillare.

Successivamente, collegare i connettori elettrici per fornire tensione agli elettrodi di ossido di indio 10. Le sequenze di attivazione degli elettrodi sono automatizzate mediante un'interfaccia elettronica controllata da computer che esegue script predeterminati. Poi, riempire le riserve a bordo dei moduli DMF con i reagenti appropriati per la stimolazione cellulare, il lavaggio e la lisi.

In alcuni casi, è preferibile caricare lo stimolo stesso in una fase successiva, immediatamente prima del suo utilizzo, prelevandolo dalle riserve a bordo caricate, ed erogare microgocce sul modulo DMF. Eseguire il test e l'azionamento delle microgocce, inclusi il trasporto tra il modulo DMF e le microcapillari di trasferimento. Blais. Preparare innanzitutto lo stimolo in mezzo fresco con F127 allo 0,1% a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro.

Quindi caricare da 80 a 100 microlitri dello stimolo nel relativo serbatoio a bordo designato. Successivamente, rimuovere le estremità aperte delle camere di perfusione dal serbatoio del mezzo e inserirle nei raccordi capite fissati alle estremità delle microcapillari di trasferimento; quindi impartire al pompa a siringa l'istruzione di inviare i tappi liquidi all'interno delle camere di perfusione nel contenitore dei rifiuti. Successivamente, istruire il modulo DMF a generare gocce da 10 microlitri di stimolo e a consegnarle alle camere di perfusione tramite le microcapillari di trasferimento.

Incubare le cellule con lo stimolo a 37 gradi Celsius per uno a quattro ore, se necessario. Sostituire con stimolo fresco a intervalli regolari al termine del periodo di stimolazione. Istruire la pompa a siringa a inviare lo stimolo nel contenitore dei rifiuti e istruire il modulo DMF a erogare una goccia di 10 microlitri di tampone di lavaggio in ciascuna camera di perfusione.

Incubare le cellule con il tampone di lavaggio per cinque minuti. Successivamente, sostituire il tampone di lavaggio con 10 microlitri di soluzione di lisi e incubare per altri cinque minuti. Quindi, impostare la pompa a siringa affinché invii ogni lisato cellulare al modulo DMF.

Rimuovere la piastra superiore del modulo DMF avendo cura di non inclinarla lateralmente, poiché ciò potrebbe causare contaminazione incrociata tra le gocce. Infine, raccogliere i lisati dal modulo DMF aperto utilizzando una pipetta manuale per analisi fuori piattaforma, come l'espressione genica, il profilo tramite R-T-P-C-R quantitativo per preparare la piattaforma per il prossimo esperimento. Immergere prima le microcapillari di trasferimento, i raccordi CAPITE e le piastre del modulo DMF in una soluzione di candeggina al 10% per 10 minuti a temperatura ambiente; successivamente, le piastre del modulo DMF vengono risciacquate con isopropanolo, seguito da acqua deionizzata, essiccate con gas azoto e quindi sottoposte a cottura a 160 gradi Celsius per 10 minuti.

I metodi di semina descritti in questo protocollo hanno portato all'adesione di circa 500 macrofagi miren per camera di perfusione. Dopo aver incubato le cellule con mezzo di crescita a 37 gradi Celsius per 16 ore, la dimensione della popolazione è raddoppiata fino a raggiungere circa 1000 cellule per camera di perfusione. Qui vengono mostrati i risultati dell'analisi quantitativa mediante R-T-P-C-R di quattro geni noti per svolgere ruoli importanti nelle risposte immunitarie innate ai batteri.

I macrofagi sono stati coltivati in colture convenzionali o su scala microscopica e stimolati con particelle bio di e coli per una o quattro ore. Le barre blu indicano l'aumento medio in termini di fold nell'espressione genica a seguito della stimolazione di cellule coltivate in modo convenzionale, mentre le barre rosse indicano l'espressione indotta in cellule coltivate e stimolate in colture su scala microscopica. Le barre di errore indicano le deviazioni standard tra replicati biologici di tre esperimenti indipendenti.

I risultati del profilo dell'espressione genica sono stati molto simili, anche se le colture convenzionali utilizzavano piastre a 96 pozzetti con circa 50.000 cellule per pozzetto, mentre le colture in microscala impiegavano microcapillari con circa 1.000 cellule per camera di perfusione. La variabilità da esperimento a esperimento è risultata almeno paragonabile e spesso ridotta nelle colture in microscala, come indicato dalle barre di errore più corte. Riduzione del consumo di cellule di cinque volte e del consumo di reagenti da tre a cinquanta volte rispetto agli esperimenti convenzionali.

Il metodo potrebbe essere utilizzato per coltivare virtualmente qualsiasi tipo di cellula aderente, in alcuni casi utilizzando un diverso componente della matrice extracellulare o un diverso mezzo di crescita. I tipi di cellule non aderenti possono risultare difficili da coltivare, ma strategie di ancoraggio cellulare si sono dimostrate efficaci in contesti simili. L'approccio qui descritto supporta la coltura su scala microscopica per un periodo fino a 24 ore.

La piattaforma include tutte le funzioni necessarie anche per una coltura a lungo termine, ma è necessario sviluppare un protocollo di passaggio cellulare. Moduli aggiuntivi possono essere integrati nel cubo microfluidico digitale attraverso interconnessioni a microcapillare. In questo modo, il DMF funge da centro centrale per collegare i moduli periferici ed eseguire flussi di lavoro complessi.

Abbiamo concentrato principalmente la nostra attenzione sulla caratterizzazione delle risposte trascrizionali dell'ospite agli agenti infettivi, ma la piattaforma è stata progettata per essere estremamente versatile e pertanto dovrebbe supportare una vasta gamma di applicazioni di ricerca.