Analisi trascrittomica di C. elegans RNA Sequencing dati attraverso la suite Tuxedo sul Progetto Galaxy

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di aiutare i ricercatori di C.elegans senza competenze bioinformatiche a condurre un esperimento di sequenziamento dell'RNA e analizzare i dati utilizzando la piattaforma ad accesso aperto Galaxy. Questo metodo può aiutare ad analizzare i dati complessi di sequenziamento high through put per fornire informazioni sulle firme trascrittomiche alla base dei fenotipi in C.elegans. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli scienziati senza una precedente formazione in bioinformatica di analizzare i dati grezzi di sequenziamento e produrre un elenco di geni espressi in modo differenziale, insieme ai termini di ontologia genica associati.

Sebbene questo metodo sia specificamente orientato alle sfumature dei dati di sequenziamento di C.elegans, può essere applicato anche ad altri organismi e contesti biologici in cui è necessario esaminare i cambiamenti chiave della trascrizione del genoma. Questo video tratta l'utilizzo basato sul web della pipeline Galaxy. Se possibile, eseguire il flusso di lavoro in locale.

Scarica e installa Galaxy seguendo le istruzioni sulla pagina wiki. Dopo aver utilizzato il tutorial inizia qui fornito sulla home page di Galaxy, segui questo video. È fondamentale che l'utente familiarizzi e si orienti con l'interfaccia utente Galaxy e gli strumenti utilizzati nel flusso di lavoro.

Per iniziare, fai clic su analizza dati nel pannello dell'intestazione per accedere alla vista principale dell'analisi. La barra di avanzamento in alto a destra monitora la quantità di spazio su disco utilizzata. Successivamente, accedi al menu degli strumenti nel pannello di sinistra e fai clic su Analisi dell'RNA NGS.

Ciò fornisce opzioni per utilizzare tutti gli strumenti necessari per l'analisi dei dati di sequenza dell'RNA. Ora, inizia una nuova cronologia delle analisi. Vai al pannello della cronologia a destra.

Fare clic sull'icona a forma di ingranaggio e scegliere l'opzione Crea nuovo dal menu a comparsa. Quindi, fornisci un nome nella cronologia per identificare l'analisi. Per procedere, vai al menu degli strumenti e, in Ottieni dati, fai clic sulla funzione di caricamento del file per caricare i file della coda veloce non elaborati.

Dopo l'apertura dell'attività nell'interfaccia di analisi, fare clic su scegli file locale o scegliere file FTP per navigare e selezionare i dati della sequenza appropriati. Per impostazione predefinita, Galaxy rileverà automaticamente il tipo di file. Quindi seleziona l'organismo dal menu a tendina che in questo caso è C.elegans.

Successivamente, fai clic su Avvia per avviare il caricamento dei dati. Dopo che il file è stato caricato, l'azione viene salvata nel pannello della cronologia da cui è possibile selezionare e accedere ai dati. Ora, converti i file dal formato coda veloce uno alla volta al formato sanger coda veloce accedendo al menu NGS QC e manipolazione, selezionando il toelettatore code veloce, scegliendo il file sotto il file da pulire.

Selezionare il tipo di punteggio di uguaglianza veloce di input appropriato ed eseguire lo strumento utilizzando i parametri predefiniti. Il file di dati può ora essere analizzato. Presta particolare attenzione ai formati di file e ai parametri di test utilizzati in tutto il protocollo.

Queste informazioni sono utili per la risoluzione dei problemi relativi ai test non riusciti e ad altri problemi. Prima di procedere, è possibile utilizzare test di controllo qualità. I dettagli su come eseguirli sono forniti nel protocollo di testo.

Una volta che un file è pronto per l'analisi, mappare i dati di sequenziamento aprendo prima la sezione di analisi dell'RNA NGS e quindi facendo clic sullo strumento top hat. Dal menu a discesa, inserisci la risposta alla domanda si tratta di dati finali singoli o accoppiati? Quindi, scegli il file di coda veloce appropriato.

Seleziona Usa un genoma integrato nel menu a discesa successivo e scegli i dati del genoma di C.elegans di riferimento. Selezionare default per tutte le altre opzioni dei parametri, quindi fare clic su Esegui. Per stimare l'abbondanza relativa di trascritti nel set di dati, selezionare lo strumento gemelli nella sezione di analisi dell'RNA NGS e dal primo menu a discesa scegliere il file in formato bam dei colpi accettati mappati ottenuti dall'analisi del cappello a cilindro.

Dal secondo menu a discesa, impostare l'annotazione di riferimento sul file GTF contenente i dati del genoma corrente. Quando viene visualizzata l'opzione Esegui correzione bias, selezionare Sì ed eseguire l'attività utilizzando le impostazioni predefinite. Successivamente, dal menu di analisi dell'RNA NGS, aprire lo strumento di unione del bracciale per unire i trascritti assemblati prodotti per tutti i campioni di sequenza di RNA.

La prima casella dello strumento carica tutti i file GTF prodotti utilizzando i gemelli nel passaggio precedente. Ora, seleziona il file delle trascrizioni assemblato per ciascuno dei ceppi o delle condizioni testate, comprese le repliche biologiche della stessa condizione di ceppo. Selezionare Sì per l'annotazione di riferimento utente e scegliere il file di dati del genoma di riferimento.

Quindi, selezionare sì per l'opzione di utilizzo dei dati della sequenza. Questo rileverà e sceglierà automaticamente il genoma di riferimento appropriato. Lasciare tutti gli altri parametri nell'impostazione predefinita e fare clic su Esegui.

Verrà prodotto un singolo file GTF. Per confrontare più ceppi o condizioni, torna alla sezione di analisi dell'RNA NGS e seleziona lo strumento cuff div. Quindi, dal menu delle trascrizioni nello strumento div del cuff, selezionare il file di output unito dall'unione dei bracciali.

Immettere quindi le etichette per le due condizioni. Per ogni condizione vai su repliche e seleziona i singoli hit accettati file di output da top hat che corrispondono alle diverse repliche biologiche di quella condizione. Per selezionare più file contemporaneamente, tenere premuto il tasto Comando o Ctrl.

Dopo aver selezionato i file, utilizzare le impostazioni predefinite dei parametri e fare clic su Esegui per eseguire l'attività. Scarica i dati differenzialmente espressi facendo clic sull'icona di salvataggio nella casella del test differenziale genico generata nel pannello della cronologia. Per iniziare, accedi a David dal sito web.

Dall'intestazione della pagina web scegli Avvia analisi. Copia l'elenco dei geni ottenuti da Galaxy nella casella A e in questo esempio seleziona l'identificatore del gene come ID del gene di base del verme. Quindi sotto il tipo di elenco in domanda tre scegli l'elenco dei geni e fai clic sull'icona di invio dell'elenco. Ora si aprirà la homepage della procedura guidata di analisi da cui è possibile selezionare le attività di David.

Questo segmento video descrive alcune di queste opzioni. Innanzitutto, scegli il clustering delle annotazioni funzionali per accedere alla pagina di riepilogo. Lasciare le categorie di annotazione sulle impostazioni predefinite e fare clic su Clustering delle annotazioni funzionali.

Questa opzione genera cluster di termini di annotazione simili classificati in base al punteggio di arricchimento. A questo punto, tornare alla procedura guidata di analisi e selezionare l'opzione del grafico di annotazione funzionale per identificare i termini biologici significativamente sovrarappresentati associati all'elenco dei geni. Una preziosa caratteristica di David è la possibilità di creare una tabella di annotazione funzionale.

Questo elenca tutte le annotazioni associate ai geni senza mostrare alcun calcolo statistico. Questo può essere utile per l'analisi gene per gene e per trovare geni specifici di interesse. Un altro utile strumento di David da rivedere è la classificazione funzionale dei geni.

Questa opzione separa i geni in un elenco di gruppi funzionalmente correlati classificati in base al loro punteggio di arricchimento. Il protocollo descritto è stato utilizzato per identificare geni la cui espressione è modulata da tcer-1 in seguito alla perdita della linea germinale. Il trascrittoma dei mutanti glp-1 della lista della linea germinale di lunga durata è stato confrontato con i doppi mutanti tcer-1 glp-1 che la nostra linea germinale elenca ma non mostrano un'estensione della durata della vita.

Un controllo di qualità delle sequenze non ha rilevato letture di scarsa qualità, un contenuto GC compreso tra il 48 e il 49% e una lunghezza di lettura costante della sequenza di 51 coppie di basi. La copertura del genoma dei campioni è stata stimata tra sette volte e 11 volte. Galaxy ha permesso di combinare i dati NGS delle due repliche di ciascun ceppo ed eseguire analisi differenziali per generare elenchi di geni che evidenziano il profilo di espressione dell'intero genoma.

Complessivamente, 835 geni sono stati espressi in modo differenziale tra i due ceppi utilizzando un valore P di 0,05. L'analisi delle annotazioni funzionali dei geni sovraregolati ha rivelato quattro cluster di annotazione con alti punteggi di arricchimento. Il più alto include il citocromo P450 e i geni di risposta xenobiotica, seguiti dai geni implicati nelle modificazioni lipidiche.

Il clustering delle annotazioni funzionali dei target sottoregolati ha anche identificato una varietà di cluster di annotazione. Questi includevano cluster arricchiti per la funzione citoscheletrica, la regolazione positiva della crescita, la riproduzione e l'invecchiamento. La pipeline Galaxy ha aperto la strada ai ricercatori in un'ampia gamma di discipline biologiche, per analizzare i cambiamenti dell'espressione genica su larga scala in modo rapido ed efficiente.

Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di condurre un esperimento di ricerca dell'RNA e analizzare lo sballo grezzo attraverso i dati di sequenziamento put utilizzando la pipeline Galaxy. Dovresti anche essere in grado di estrarre informazioni biologicamente rilevanti dai dati Galaxy utilizzando la piattaforma David.