Name: CAPRRESI: Assemblaggio chimico mediante inserimento del sito enzimatico di recupero e restrizione di plasmide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri il metodo CAPRRESI per l'assemblaggio di geni chimerici mediante inserimento di siti di restrizione in sequenze sinonime. Questa tecnica rapida ed economica facilita la fusione di geni codificanti proteine.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (numero di sovvenzione 154833) e Universidad Nacional Autónoma de México. Gli autori vogliono ringraziare Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos e Soledad Juárez per i loro consigli amministrativi e tecnici.

1. Protocollo CAPRRESI NOTA: la Figura 1 rappresenta il protocollo CAPRRESI complessivo. Questa tecnica è basata su un disegno in silico e la successiva costruzione delle chimere desiderate. <ol><li> Selezione del plasmide di clonazione, pUC18 o pUC19. <ol><li> Selezionare il vettore pUC che meglio si adatta alle esigenze tecniche. NOTA: entrambi i vettori hanno la stessa sequenza, ad eccezione dell&#39;orientamento del sito di clonazione multiplo. Questo è importante per la progettazione di oligonucleotidi e la rottura del plasmide PCR. </li></ol></li><li> In analisi silico dei geni selvatici e delle sequenze pUC18 / 19. <ol><li> Ottieni le sequenze di DNA dei geni di tipo selvatico e li salva in un file di formato FASTA ( ad esempio, genes.fas). NOTA: Le sequenze dei vettori pUC18 / 19 sono contenute nel file pUC.fas ( Figura 1 , passaggio 1). </li><li> Determinare quale enzima di restrizioneYmes non tagliano i geni wildtype e le sequenze pUC18 / 19 eseguendo lo script REsearch.pl. In alternativa, eseguire una ricerca di siti di restrizione degli enzimi con uno strumento online ( figura 1 , passaggio 2). <ol><li> Digitare quanto segue in un terminale: Perl REsearch.pl genes.fas Perl REsearch.pl pUC.fas NOTA: Questi comandi creeranno i seguenti file di output: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas e pUC_re.fas. </li><li> Selezionare gli appropriati enzimi di restrizione per la clonazione dei geni di tipo selvatico nel sito di clonazione multiplo del vettore pUC18 / 19 scelto confrontando i file genes_re.fas e pUC.fas. Scegli l&#39;orientamento dell&#39;inserto relativo al gene di resistenza dell&#39;ampicillina ( ampR ) del vettore pUC18 / 19. </li></ol></li><li> Progettare gli oligonucleotidi in avanti e invertire per amplificare la regione di codifica dei geni selvatici (oligonucleotidi esterni). Includere il proprio sito di restrizione enzimatica ad ogni 5 &#39;fineDegli oligonucleotidi; Questo definirà l&#39;orientamento dell&#39;inserto. <ol><li> Includere un sito funzionale di rilascio dei ribosomi negli oligonucleotidi in avanti. </li><li> Inserire entrambi i geni di tipo selvatico nello stesso orientamento all&#39;interno del vettore. </li></ol></li></ol></li><li> Selezione delle regioni di rottura per l&#39;assemblaggio di chimera e la rottura del plasmide. <ol><li> Ottieni la sequenza di aminoacidi del wildtype e dei geni ampR eseguendo lo script translate.pl ( Figura 1 , passaggio 3). <ol><li> Digitare quanto segue in un terminale: Perl translate.pl genes.fas Perl translate.pl ampR.fas NOTA: Questo script creerà i seguenti file di output: genes_aa.fas e ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> Allineare globalmente le due sequenze aminoacidiche di tipo selvatico con un software appropriato ( es., MUSCLE) 9 . </li><li> Selezionare le regioni di rottura desiderate (3-6 aminoacidi) per l&#39;asse chimeraMbly basata sull&#39;allineamento della sequenza. Salvare in un file in formato FASTA ( ad esempio , regions.fas). </li><li> Individuare le sequenze di DNA che codificano per l&#39;amminoacido selezionato si estende su entrambi i geni wildtype. </li></ol></li><li> In silico generazione di sequenze di DNA sinonimo contenenti siti di restrizione enzimatica. <ol><li> Ottenere tutte le sequenze sinonimo del DNA che codificano per ciascuna sequenza di sequenze di aminoacidi selezionate come aree di rottura ( figura 1 , passaggio 4); Queste sequenze sono state memorizzate nel file region.fas. <ol><li> Digitare quanto segue in un terminale: Perl synonym.pl regions.fas NOTA: Questo script creerà il file di output regions_syn.fas. </li></ol></li><li> Cercare siti di enzimi di restrizione trovati sulle sequenze di DNA sinonimo. <ol><li> Digitare quanto segue in un terminale: perl REsynonym.pl regions_syn.fas NOTA: Questo script creerà il file di output regions_syn-re.fas. </li></ol></li><li> Scegliere un enzima di restrizione che è condiviso tra sequenze sinonimi di entrambi i geni di tipo selvatico; Questo sito verrà utilizzato per assemblare chimere attraverso la digestione enzimatica di restrizione. Verificare che l&#39;enzima di restrizione scelto non tagliasse né i geni del wildtype né le sequenze vettoriali pUC18 / 19. <ol><li> Confronta gli enzimi di restrizione trovati nei file genes_re.fas, pUC_re.fas e regions_syn-re.fas. </li></ol></li><li> In silico sostituiscono gli originali per la loro sinonima sequenza di DNA nei corrispondenti loci su entrambi i geni selvatici. Aggiungi sequenze del DNA sinonimo nel file di sequenza di wildtype (genes.fas). </li><li> Ottieni la sequenza di aminoacidi dei geni contenuti nel file genes.fas ( perl translate.pl genes.fas ). </li><li> Allineare le sequenze di aminoacidi tradotte da sequenze di DNA selvatiche e sinonime. Verificare che entrambe le sequenze siano le stesse. </li><li> Ripetere tutte le fasi di questa sezione con il gene ampR presente sul pUC18 / 19 vettore. NOTA: L&#39;obiettivo è quello di interrompere il gene ampR (file ampR.fas) in due parti complementari. L&#39;enzima di restrizione selezionato per interrompere l&#39; ampR gene deve essere diverso da quello utilizzato per l&#39;assemblaggio di chimera. </li></ol></li><li> Clonazione indipendente dei due geni di tipo selvatico nel vettore pUC18 / 19 selezionato (figura 1, fase 3). <ol><li> Purificare il DNA plasmidico pUC18 / 19 scelto utilizzando un kit di purificazione del DNA plasmidico. <ol><li> Ad esempio, trasformare E. coli DH5α con il plasmid pUC18 e far crescere i trasformanti per una notte a 37 ° C su ampio ampicillina LB-0,3 mg / mL (Amp). Scegliere una colonia di trasformante, inoculare una nuova piastra di Amp di LB-0,3 mg / mL e farla ricrescere la notte a 37 ° C. </li><li> Parte della cultura precedente e farlo in liquido LB-0,3 mg / mL Amp per 6-8 ore a 37 ° C. Estraete il DNA del plasmide usando un kit. </li></ol></li><li> PCR amplificano i geni di tipo selvatico dal DNA genomico totale utilizzando l&#39;appropRiattivano gli oligonucleotidi esterni. Utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà se possibile. Selezionare la DNA polimerasi che massimizza il rendimento. Eseguire il PCR secondo le linee guida del produttore e la temperatura di fusione degli oligonucleotidi. <ol><li> Eseguire cicli PCR, a seconda della DNA polimerasi, delle dimensioni dell&#39;amplicone, del template e degli oligonucleotidi utilizzati. Ad esempio, per amplificare il rpoD DNA, preparare una reazione di 50 μL: 5 μl di tampone 10 volte, 2 μL di 50 mM MgSO4, 1 μl di 10 mM dNTP mix, 2 μL di ogni oligonucleotide da 10 μM (Tabella 2), 2 ΜL del template DNA ( E. coli DH5α totale DNA), 35,8 μL di acqua ultra-pura e 0,2 μL di DNA-polimerasi ad alta fedeltà. Eseguire i seguenti cicli di PCR: 1 min a 94 ° C per la denaturazione iniziale seguita da 30 cicli di amplificazione (30 s a 94 ° C per denaturare, 30 s a 60 ° C per anneare gli oligonucleotidi e 2 min a 68 ° C per estendere). </li><li> Sciogliere 1,2 g diAgarosio in 100 ml di acqua doppia-distillata riscaldandoli nel forno a microonde. Montare un vassoio e pettine in gel e metterli nel caster gelato orizzontale. Riempire il vassoio gel con la soluzione di agarosio fuso e lasciarlo solidificare. Rimuovere il pettine. </li><li> Posizionare il gel nella camera di elettroforesi. Riempire la camera con un tampone Tris-acetato-EDTA. Caricare 50 μL di prodotti PCR nei pozzetti del gel. Elettroforesi i campioni ( es ., A 110 V per 1 ora). </li><li> Dopo l&#39;elettroforesi, macchiare il gel in 100 ml di acqua a doppia distillazione contenente 100 μL di 1 mg / ml di soluzione di bromuro di etidio per 10 min con agitazione lenta. Lavare il gel in acqua doppia distillazione per altri 10 minuti in scuotimento lento; Utilizzare un agitatore orizzontale. Attenzione: il bromuro di etido è un composto tossico; Indossare guanti protettivi e un cappotto di laboratorio di cotone. </li><li> Purificare il gene DNA selvatico dalle bande corrispondenti del gel utilizzando un kit. Visualizzare le bande inserendo il gel macchiato in una camera UV (Lunghezza d&#39;onda raccomandata: 300 nm). Mantenere l&#39;esposizione del gel al minimo. Utilizzare un kit di purificazione del DNA e seguire le istruzioni del produttore. Attenzione: la radiazione UV è pericolosa; Indossare uno scudo protettivo, occhiali e un cappotto di laboratorio di cotone. </li></ol></li><li> Il digest ha purificato i geni selvatici e il plasmid pUC18 / 19 con gli enzimi di restrizione secondo le istruzioni del produttore. Usare digestione veloce quando possibile. Ad esempio, digerire 6 μL di DNA pUC18 (300 ng / μL) in 10 μl di acqua ultrapure, 2 μl di tampone 10X, 1 μl di enzima di restrizione KpnI e 1 μl di enzima di restrizione XbaI . Lasciare la reazione a 37 ° C per 30 min. <ol><li> Inattivare gli enzimi di restrizione secondo le linee guida del produttore. Ad esempio, inattivare la reazione di digestione Kpn I- Xba I a 80 ° C per 5 min. </li></ol></li><li> Inserire la miscela: DNA vettoriale a una rati volumetricaO di 3: 1. Seguire le istruzioni del produttore per una reazione di ligation. Utilizzare gli enzimi veloci di legatura quando possibile (lasciare la reazione a 25 ° C per 10 minuti). NOTA: In genere, la concentrazione del DNA dopo la purificazione usando i kit è abbastanza buona per le reazioni di digestione e di legatura. Ad esempio, aggiungere 6 μl di DNA rpoD ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 3 μl di DNA pUC18 ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 10 μl di 2x tampone, 1 μL di ultrapure Acqua e 1 μl di ligasi del DNA di T4. Lasciare la reazione di legame a 25 ° C per 10 min. </li><li> Trasformare l&#39; E. coli DH5α con 2-4 μL della reazione di ligation, come descritto nei Materiali Supplementari. Piastra le cellule trasformate in lastre LB / Amp / X-gal / IPTG. Lasciare i piatti durante la notte a 37 ° C. </li><li> Selezionare colonie di E. coli trasformanti bianche e striarle su una nuova piastra LB / Amp. Lasciare i piatti durante la notte a 37 ° C/ Li&gt; <li> Eseguire una colonia PCR per scegliere i candidati per la sequenza della reazione, come descritto nei Materiali Supplementari. Estrarre il plasmide DNA dai candidati. In alternativa, digerire il DNA del plasmide candidato con gli stessi enzimi di restrizione utilizzati per la clonazione degli inserti. </li><li> Costruzioni di sequenza con un fornitore di servizi di sequenziamento 10 . Assemblare la sequenza in silico usando un assemblatore di DNA 11 ( figura 1 , fase 5). </li></ol></li><li> Interruzione del plasmide da PCR seguito da digestione enzimatica di restrizione. <ol><li> Progettazione in silico avanti e invertire gli oligonucleotidi in aree di rottura per wildtype e ampR geni, rispettivamente. Sostituire in silico il frammento di tipo selvatico per la sua corrispondente sequenza sinonimo del DNA (ottenuta nel passaggio 1.4). NOTA: Questa sequenza di DNA di sinonimo contiene un sito di restrizione enzimatica. Gli oligonucleotidi in avanti e invertire si sovrappongono a tLui sito di restrizione enzima. Gli oligonucleotidi devono variare da 21 a 27 nucleotidi, terminare con una citosina o guanina e contenere un sito di restrizione enzimatica. Un oligonucleotide in avanti ha la stessa sequenza della sua regione target sul DNA del template. Un oligonucleotide inverso è la sequenza complementare inversa della regione bersaglio sul DNA del templato. </li><li> Utilizzare le due costruzioni di gene wildtype come il template di DNA per le reazioni PCR ( es . PUC18 rpoD e pUC18 sigA ). Ottenere due parti complementari di ogni costruzione (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 e pUC18 sigA σ3-σ4) ( figura 1 , passaggio 6). </li><li> Caricare i campioni di DNA in un gel agarosico 1-1,2% [w / v]. Separare i prodotti PCR dal modello DNA mediante elettroforesi ( ad es. 110 V per 1 ora). In alternativa, digerire le reazioni PCR con Dpn I per rompere il template del DNA. NOTA: DpnI enzima riconosce solo sequenze di DNA metilate (5&#39;-GATC-3 &#39;). <ol><li> Purificare i campioni utilizzando un kit di purificazione del DNA. Seguire le linee guida del produttore. </li></ol></li><li> Doppio digerire tutti i frammenti DNA complementari con gli appropriati enzimi di restrizione secondo le indicazioni del produttore. Utilizzare gli enzimi di restrizione digestivo veloce quando possibile. Ad esempio, duplicare il frammento di DNA pUC18rpoDσ1-σ2 con Afl II e Spe I utilizzando il protocollo del produttore. Lasciare la reazione di digestione a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Inattivare gli enzimi di restrizione secondo le linee guida del produttore. Ad esempio, inattiva Afl II- Spe I a 80 ° C per 20 min. </li></ol></li><li> Recupero del plasmide utilizzando la legatura del DNA e la trasformazione batterica. <ol><li> Mescolare i frammenti corretti del DNA in un rapporto volumetrico 1: 1 per assemblare il gene chimerico desiderato ( Fig1, passo 7). NOTA: In questo modo, l&#39;integrità del gene ampR viene ripristinato, producendo una proteina funzionale. <ol><li> Ad esempio, mescolare 4 μL di DNA pUC18 rpoD σ1-σ2 (digerito con Afl II- Spe I, 150 ng / μL), 4 μL di pUC18 sigA σ3-σ4 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / 10 μl di 2x tampone, 2 μL di acqua ultrapure e 1 μl di T4 DNA ligasi; La concentrazione del DNA dopo la purificazione del kit è abbastanza buona per la digestione e la successiva legatura. Lasciare la reazione di legatura a 25 ° C per 10 min. </li></ol></li><li> Trasformare E. coli DH5α con 3-5 μL della reazione di ligazione dell&#39;assemblea chimica (Materiali Supplementari). Crescere le cellule trasformanti in piastre LB / Amp / X-gal / IPTG durante la notte a 37 ° C per una notte. </li><li> Selezionare colonie di E. coli trasformanti bianche e striarle su una nuova piastra LB / Amp. Lasciare i piatti durante la notte a 37° C. </li><li> Eseguire una colonia PCR per scegliere i candidati per una reazione di sequenza, come descritto nei Materiali Supplementari. Visualizzare le fasce in un agarosio 1-1,2% (w / v) eseguendo elettroforesi (descritto nel punto 2.3.2.1). </li><li> Crescere le culture dai candidati positivi. Estrarre il DNA del plasmide da loro usando un kit di purificazione del DNA plasmidico. </li></ol></li></ol> 2. Sequenza Candidate Costruzioni Chimeriche <ol><li> Assicurarsi che la qualità del DNA del plasmide sia abbastanza buona per la reazione di sequenziamento seguendo le linee guida del fornitore di servizi di sequenza. Estrarre il DNA utilizzando i kit di purificazione. Ad esempio, sulla pagina Internet del fornitore di servizi di sequenza, prestare particolare attenzione alla concentrazione raccomandata del DNA per i campioni. Ottieni la concentrazione di campioni utilizzando uno strumento di quantificazione del DNA. </li><li> Costruzioni chimiche candidate sequenza con un fornitore di servizi di sequenziamento 10 . </li><li> Assemblare<html> La quencing legge con un assembler di DNA in silico 11 . </li><li> Allineare le sequenze chimeriche assemblate rispetto a silico , utilizzando gli strumenti di allineamento delle sequenze 9 , 12 . Verificare che il gene chimerico sia stato fuso con successo. </li></ol> 3. Preparazione NOTA: tutti i passaggi che coinvolgono cellule viventi devono essere eseguite in un cappuccio flusso laminare pulito con il bruciatore di Bunsen acceso. <ol><li> Produzione di cellule E. coli DH5α-competenti. <ol><li> Per produrre cellule E. coli -competenti, seguire i protocolli pubblicati 13 o vedere i Materiali Supplementari . In alternativa, utilizzare celle competenti commercialmente disponibili. </li></ol></li><li> Trasformazione di cellule competenti di E. coli DH5α. <ol><li> Per la trasformazione chimica delle colture E. coli , seguire i protocolli pubblicatiClass = &quot;xref&quot;&gt; 13 o vedere i Materiali Supplementari . In alternativa, utilizzare l&#39;elettroporazione per la trasformazione batterica. Se vengono utilizzate celle competenti commercialmente disponibili, seguire le linee guida del produttore. </li></ol></li><li> Purificando il DNA genomico e plasmidico da E. coli DH5α. <ol><li> Eseguire l&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico, come indicato nei Materiali Supplementari , utilizzando kit disponibili in commercio o seguendo protocolli pubblicati 13 . </li></ol></li><li> Eseguire PCR colonia. <ol><li> Utilizzare questa tecnica per identificare le colonie del trasformante candidato per la successiva reazione di sequenza. NOTA: Questo metodo non rappresenta una verifica finale dell&#39;integrità delle sequenze. Una descrizione dettagliata di questa tecnica è disponibile nei Materiali Supplementari . </li></ol></li><li> Preparazione delle soluzioni. <ol><li> Vedere <sTrong&gt; Tabella 1 per ulteriori informazioni sulla preparazione della soluzione. </li></ol></li><li> Scaricare gli script e i file di sequenza necessari per il protocollo CAPRRESI. <ol><li> Scaricare i file gene bancari che contengono la sequenza completa del genoma della specie desiderata, estrarre la sequenza del DNA del gene scelto utilizzando un browser genomico e salvarlo in formato fasta. Scaricare gli script Perl necessari per il protocollo CAPRRESI. Conservare gli script e i file di sequenza nella stessa directory. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

CAPRRESI è stato progettato come alternativa al PRM 2 . Il PRM originale è una tecnica potente; Consente la fusione di sequenze di DNA su qualsiasi parte dei geni selezionati. Per PRM, i geni di tipo selvatico devono essere clonati nello stesso plasmide. Dopo di che, gli oligonucleotidi sono progettati all&#39;interno di geni selvatici e resistenti agli antibiotici trovati sul plasmide. La disfunzione del plasmide è ottenuta mediante PCR mediante DNA-polimerasi estremamente nitide e ad alta fedel...

Il complesso gene chimerico è stato ampiamente utilizzato nella biologia molecolare per chiarire la funzione proteica e / o per scopi biotecnologici. Esistono diversi metodi per la fusione di geni, come la sovrapposizione del prodotto PCR 1 , il recupero del plasmide 2 , la ricombinazione omologa 3 , i sistemi CRISPR-Cas9 4 , la ricombinazione localizzata 5 e l&#39;assemblaggio Gibson 6 . Ognuna di esse offre diversi vantaggi tecnici; Per esempio la flessibilità del disegno PCR sovrapposto, la selezione in vivo di costruzioni durante il recupero del plasmide o l&#39;alta efficienza dei sistemi CRISPR-Cas9 e Gibson. D&#39;altra parte, alcune difficoltà possono sorgere durante l&#39;esecuzione di alcuni di questi metodi; Per esempio, i primi due approcci si basano su frammenti di DNA a sbavature e la legatura di questi tipi di prodotti potrebbe essere tecnicamente impegnativa rispetto a quella di sticLa legatura a chiave. La ricombinazione del sito può lasciare tracce di sequenze di DNA extra (cicatrici) sull&#39;originale, come nel sistema CreoxP 5 . CRISPR-Cas9 può talvolta modificare altre regioni del genoma oltre al sito di destinazione 4 . Qui introduciamo l&#39;assemblaggio di chimera mediante il recupero del plasmide e l&#39;inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI), un protocollo per fusione di geni di codifica proteica che combina il metodo di recupero del plasmide (PRM) con l&#39;inserimento di siti di enzimi di restrizione sulle sequenze di DNA sinonimo, migliorando l&#39;efficienza di legame . Per garantire l&#39;integrità della sequenza di aminoacidi, i siti di restrizione enzimatica vengono inseriti in sequenze di DNA sinonimo. Tra i vantaggi di CAPPRESI è che può essere eseguito utilizzando reattivi / strumenti di laboratorio ( es . Enzimi, cellule competenti, soluzioni e termociclatori) e che può dare risultati rapidi (quando vengono utilizzati gli enzimi appropriati). Basandosi sulla restrizioneI siti enzimatici che emergono dalle sequenze di DNA sinonimo possono limitare la selezione dei punti di fusione esatti all&#39;interno delle proteine ​​di interesse. In questi casi i geni bersaglio dovrebbero essere fusi utilizzando oligonucleotidi sovrapposti e siti di enzimi di restrizione dovrebbero essere inseriti sul gene di resistenza del vettore. CAPRRESI è costituito da sette semplici passaggi ( Figura 1 ): 1) selezione del vettore di clonazione, pUC18 o pUC196; 2) nell&#39;analisi siliconica delle sequenze di wildtype da fusione; 3) selezione di regioni di rottura per l&#39;assemblaggio di chimera e la rottura del plasmide; 4) nella generazione siliconica di sequenze di DNA sinonime contenenti siti di restrizione enzimatica; 5) clonazione indipendente dei geni selvatici nel plasmide selezionato; 6) la rottura del plasmide mediante PCR, seguito da una digestione di enzimi di restrizione; E 7) recupero del plasmide utilizzando la legatura del DNA e la trasformazione batterica. I geni chimici prodotti da questa tecnica dovrebbero essere verificati wIth sequenziamento. I vettori pUC18 / 19 offrono vantaggi tecnici per la clonazione e l&#39;assemblaggio di chimere, quali piccole dimensioni ( cioè 2686 paia di base), numero di copie elevate, caratteristiche di reazione vantaggiosa di sequenziamento e disponibilità commerciale 7 . Qui un host di coli di Escherichia è stato usato per assemblare e gestire le chimere perché le colture batteriche sono economiche e crescono velocemente. Dato questo, sarà necessaria una successiva clonazione dei frammenti di fusione nei plasmidi target definiti ( ad esempio, vettori di espressione come pRK415 nei batteri o pCMV nelle cellule dei mammiferi). CAPRRESI è stato testato per fusione di due geni del fattore di sigma primario: E. coliPro e Rhizobium etlisigA . I fattori sigma primari sono le subunità di polimerasi RNA responsabili dell&#39;iniziazione della trascrizione e sono costituiti da quattro domini (σ1, σ2, σ3 e σ4) 8 . La sequenza di aminoacidi si lengtH di proteine ​​codificate da rpoD e sigA sono rispettivamente 613 e 685. RpoD e SigA condividono l&#39;identità del 48% (copertura del 98%). Questi fattori di sigma primario sono stati suddivisi in due frammenti complementari tra regioni σ2 e σ3. Due geni chimerici sono stati assemblati secondo questo disegno: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) e chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). I prodotti di fusione del DNA sono stati verificati mediante sequenziamento.

<table><tbody><tr><td>Platinum Taq DNA polimerasi High Fidelity</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>Produce una miscela di prodotti PCR con estremità a sporgenza smussata/3'-A</td></tr><tr><td>Kit di isolamento plasmidico ad alta purezza</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Utilizzato per tutte le reazioni di purificazione dei plasmidi</td></tr><tr><td>Kit di purificazione dei prodotti PCR ad alta purezza</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Utilizzato per tutte le reazioni di purificazione PCR da gel di agarosio</td></tr><tr><td>Enzima di restrizione AflII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>Riconosce la sequenza 5'-CTTAAG-3' e taglia a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Enzima di restrizione KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>Riconosce la sequenza 5'-GGTACC-3' e taglia a 37 &deg; Enzima</td></tr><tr><td>di restrizione C SpeI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>Riconosce la sequenza 5'-ACTAGT-3' e taglia a 37 &deg; Enzima</td></tr><tr><td>di restrizione C XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>Riconosce la sequenza 5'-TCTAGA-3' e taglia a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Acido nalidixico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici Estratto di lievito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>batterica Peptone di caseina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Coltura cellulare batterica</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>cloruro di sodio</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td> Enzima di restrizione della <td>coltura cellulare</td></tr> <tr><td>battericaXbaI</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Enzima di restrizione XbaI enzima</td></tr><tr><td>KpnI Thermo</td><td>Fisher</td><td>FD0524</td> Kit di legatura rapida <td>KpnI enzima</td></tr> New <tr><td></td><td>England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Kit di legatura rapida</td></tr> del <tr><td>DNAAflII enzima di restrizione</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>Enzima di restrizione AflII enzima</td></tr><tr><td>SpeI</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>Enzima di restrizione SpeI enzima</td></tr></tbody></table>

caprresi: assemblaggio chimico mediante inserimento del sito enzimatico di recupero e restrizione di plasmide

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Qui presentiamo l&#39;assemblaggio di chimera mediante recupero del plasmide e inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI). CAPRRESI beneficia di molti punti di forza del metodo originale di recupero del plasmide e introduce la digestione dell&#39;enzima di restrizione per facilitare le reazioni di legatura del DNA (richieste per l&#39;assemblaggio di chimera). Per questo protocollo, gli utenti clonano i geni del wildtype nello stesso plasmide (pUC18 o pUC19). Dopo la selezione in silico di regioni di sequenze di aminoacidi in cui devono essere assemblate le chimere, gli utenti ottengono tutte le sequenze sinonime di DNA che li codificano. Gli script di Perl ad hoc consentono agli utenti di determinare tutte le sequenze di sinonimi del DNA. Dopo questo passaggio, un altro script Perl cerca siti di restrizione enzimatica su tutte le sequenze di DNA sinonimo. Questa analisi in silico viene eseguita anche utilizzando il gene di resistenza dell&#39;ampicillina ( ampR ) trovato sui plasmidi pUC18 / 19. Gli utenti progettano oligonucleotidi all&#39;interno delle regioni sinonime per interrompere i geni wildtype e ampR mediante PCR. Dopo obtL&#39;integrazione e la purificazione di frammenti di DNA complementari, la digestione dell&#39;enzima di restrizione viene completata. L&#39;assemblaggio della chimera è ottenuto legando appropriati frammenti di DNA complementari. I vettori pUC18 / 19 sono selezionati per CAPRRESI perché offrono vantaggi tecnici, come piccole dimensioni (2.686 paia di base), numero di copie elevate, caratteristiche di reazione vantaggiosa di sequenziamento e disponibilità commerciale. L&#39;impiego di enzimi di restrizione per l&#39;assemblaggio di chimere elimina la necessità di DNA polimerasi che producono prodotti blunt-ended. CAPRRESI è un metodo veloce e conveniente per la fusione di geni che codificano proteine.

La figura 1 descrive CAPRRESI. Utilizzando questo metodo, due geni chimerici sono stati assemblati scambiando i domini di due fattori di sigma primario batterico ( es. E. coli RpoD e R. etli SigA). Le sequenze di DNA dei geni rpoD e sigA sono state ottenute utilizzando il Artemis Genome Browser 14 da GenBank genome file NC_000913 e NC_007761, rispettivamente. La sequenza DNA del vettore pUC18 è stata ottenuta da...

Qui presentiamo l&#39;assemblaggio di chimera mediante il recupero del plasmide e l&#39;inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI), un protocollo basato sull&#39;inserimento di siti di enzimi di restrizione in sequenze di DNA sinonimo e recupero plasmide funzionale. Questo protocollo è un metodo veloce e conveniente per fusione di geni di codifica proteica.

CAPRRESI: Assemblaggio chimico mediante inserimento del sito enzimatico di recupero e restrizione di plasmide

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Questo video illustra una procedura chiamata Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion o CAPRRESI, in cui vengono generati due geni chimerici introducendo specifici siti di restrizione in sequenze DNA sinonime e successivamente tagliando e scambiando le sequenze di DNA. In CAPRRESI, i geni di interesse di tipo selvaggio vengono innanzitutto inseriti nei siti di clonaggio multipli dello stesso vettore. Successivamente, vengono selezionate le regioni di rottura per ciascun gene con la stessa sequenza amminoacidica e viene selezionata la regione di rottura per il gene di resistenza all'ampicillina.Vengono utilizzati script Perl per identificare le sequenze sinonime contenenti siti di restrizione per ciascuna regione di interruzione. Mediante oligonucleotidi appositamente progettati, viene eseguita una PCR per produrre quattro frammenti complementari che contengono DNA sinonimo con i siti dell'enzima di restrizione desiderati. I prodotti PCR risultanti vengono purificati, digeriti e quindi ligati per generare una sequenza chimera.Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita le fusioni geniche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia molecolare, come ad esempio: quali sono le funzioni della nostra proteinzima. Iniziare questa procedura con i geni di interesse già inseriti nei siti di clonaggio multipli dei vettori.Qui, i geni rpoD e sigA, che codificano fattori di segnale batterici necessari per avviare la sintesi dell'RNA, sono stati ciascuno clonati nel vettore pUC18, come specificato nel testo allegato. Per progettare l'oligonucleotide per la produzione della proteina chimerica, eseguire innanzitutto lo script Perl translate.pl per ottenere la sequenza amminoacidica dei geni rpoD, sigA e ampR.Quindi, utilizzando il server web Muscle, allineare le sequenze di aminoacidi di rpoD e sigA. Per ciascuna sequenza, selezionare una regione di interruzione con la stessa sequenza di tre a sei aminoacidi. Salvare le sequenze nel file regions.fas.Successivamente, selezionare una sequenza lunga da tre a sei aminoacidi all'interno del gene ampR e salvare questa sequenza nel file regions.fas. Per determinare tutte le sequenze di DNA sinonime, eseguire lo script perl synonym.pl. Quindi, per identificare quali enzimi di restrizione tagliano le sequenze sinonime, eseguire lo script resynonym.pl.Successivamente, utilizzare le sequenze di DNA sinonime per progettare oligonucleotidi che introducano lo stesso sito per l'enzima di restrizione nelle regioni di interruzione di rpoD e sigA. Progettare un oligonucleotide per interrompere il gene ampR che includa un sito per un enzima di restrizione diverso. Gli oligonucleotidi forward e reverse si sovrapporranno nel sito per l'enzima di restrizione.Gli oligonucleotidi devono avere una lunghezza compresa tra 21 e 27 nucleotidi e contenere citosina o guanina, nonché un sito per enzimi di restrizione. Un oligonucleotide diretto presenta la stessa sequenza della regione bersaglio sul DNA stampo. Un oligonucleotide inverso è la sequenza complementare inversa della regione bersaglio sul DNA stampo.Ordinare gli oligonucleotidi da un fornitore di sintesi del DNA. Quando gli oligonucleotidi arrivano, utilizzarli per eseguire una PCR usando i costrutti rpoD e sigA su pUC18 come DNA stampo. Questo produrrà due parti complementari per ciascun costrutto.Dopo la PCR, eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio per separare i prodotti della PCR dallo stampo di DNA. La purificazione delle parti complementari del plasmide è fondamentale per evitare la contaminazione da plasmide parentale. I plasmidi parentali possono essere eliminati mediante purificazione su gel, come qui dimostrato, oppure attraverso la digestione con l'enzima di restrizione DpnI, che può essere utilizzato per degradare i plasmidi parentali.Dopo l'elettroforesi, colorare il gel con la soluzione di bromuro di etidio. Visualizzare le bande posizionando il gel colorato in una camera a UV a 300 nanometri. Mantenere al minimo il tempo di esposizione del gel.Quindi ritagliare le bande contenenti i prodotti PCR e posizionarle in provette per microcentrifuga. Utilizzare un kit per purificare i campioni di DNA, quindi eseguire una doppia digestione su tutti i frammenti di DNA complementari utilizzando gli enzimi di restrizione fast digest appropriati. AFL2 e SPE1 vengono utilizzati per fondere le parti complementari del plasmide.Incubare la reazione di digestione a 37 °C per 15 minuti. Successivamente, inattivare i reagenti di restrizione seguendo le indicazioni del produttore. Ad esempio, inattivare AFL2 e SPE1 a 80 °C per 20 minuti.Successivamente, combinare i frammenti di DNA appropriati con il buffer di ligazione, acqua e ligasi T4 del DNA. Lasciare la reazione di ligazione a 25 gradi celsius per 10 minuti. In questo modo, viene ripristinata l'integrità del gene ampR, producendo una proteina funzionale.Dopo la ligazione, trasformare E. coli DH5 alpha con tre a cinque microlitri della reazione di ligazione per l'assemblaggio della chimera. Piastrare le cellule trasformate su piastre di LB contenenti ampicillina, x-gal e IPTG e incubarle per tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, selezionare le colonie di E. coli trasformate di colore bianco e seminare per striscio su una nuova piastra di LB con ampicillina.Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Per selezionare i candidati da sottoporre a sequenziamento, eseguire una PCR su colonia. Visualizzare le bande su un gel di agarosio al 2% in rapporto 1:1 mediante elettroforesi, come in precedenza.Selezionare le colonie candidate che mostrano una curvatura del DNA della dimensione corretta per inoculare le colture. Il giorno successivo, estrarre il DNA plasmidico utilizzando un kit. Dopo la purificazione del plasmide, inviare i campioni per il sequenziamento.I costrutti chimera rpoD sigA sono stati generati come descritto in questo video. Dopo il sequenziamento, l'allineamento dei geni di tipo selvaggio e chimera è stato eseguito utilizzando il software MUSCLE. Le sequenze dei geni chimera sono state quindi assemblate con il software MURA, come mostrato qui.Le sequenze sinonime appaiono in nero e il sito AFL2 è sottolineato. Questi dati di sequenziamento dimostrano l'uso corretto del metodo CAPRRESI per generare costrutti chimera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona conoscenza su come fondere segmenti genici.

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Scopri il metodo CAPRRESI per l'assemblaggio di geni chimerici mediante inserimento di siti di restrizione in sequenze sinonime. Questa tecnica rapida ed economica facilita la fusione di geni codificanti proteine.

CAPRRESI: Assemblaggio chimico mediante inserimento del sito enzimatico di recupero e restrizione di plasmide

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