Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la partizione dei genomi virali nelle cellule in divisione. Ciò si ottiene creando prima un plasmide che può essere visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Qui un plasmide è ingegnerizzato per includere ripetizioni tandem della sequenza dell'operatore del lattosio o LAC O.Il secondo passo consiste nell'introdurre il plasmide nelle cellule in divisione, seguito dall'infezione delle cellule con un retrovirus che codifica per il repressore del lattosio o lac eye fuso a una proteina fluorescente.

Le proteine di fusione del repressore del lattosio legheranno specificamente le sequenze dell'operatore del lattosio nel sub plasmidico. Le cellule sono monitorate mediante microscopia a fluorescenza per tracciare i singoli plasmidi attraverso più cicli cellulari. Infine, le immagini acquisite vengono elaborate per determinare come i genomi virali vengono mantenuti nelle cellule in divisione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la PCR quantitativa, il Southern blotting o l'ibridazione in situ a fluorescenza, è che questa tecnica consente di osservare i singoli plasmidi in più punti nel tempo. Per consentire la visualizzazione del plasmide mediante microscopia a fluorescenza, vengono utilizzate tecniche di clonaggio molecolare standard per introdurre nel plasmide un frammento di DNA contenente circa 250 copie della sequenza dell'operatore del lattosio o LAC O. In questo esempio, il plasmide è un mid posteriore di circa 170 coppie di kilobasi che contiene l'intero genoma del virus dell'herpes associato al sarcoma di cap o KSHV e codifica la resistenza all'igromicina.

Introdurre il LAC O contenente DNA plasmidico in cellule di mammifero hela e SLK mediante trasfezione In piastre da 60 millimetri, incubare le cellule con 10 microgrammi di plasmide purificato, DNA 25 microlitri, lipectomia, 2000 0,5 millilitri, Optum e 3,5 millilitri. DMEM per quattro ore. Cambiare il terreno in DMEM con il 10% di siero fetale bovino e lasciare che le cellule si riprendano per 48 ore.

Successivamente piastrano le cellule trasfettate a bassa densità in grandi piatti e colture per tre settimane in DMEM con il 10% di siero fetale bovino e 300 microgrammi per millilitro di igromicina per selezionare il plasmide introdotto, utilizzare pezzi di trip sterili e carta da filtro imbevuta per trasferire le colonie resistenti all'igromicina in nuovi piatti di coltura. Posizionare le piastre nell'incubatore dopo una o due settimane, quando i cloni trasfettati sono cresciuti fino a riempire la capsula, isolare il DNA per la digestione di restrizione e il southern blotting per garantire che il polimero del plasmide LAC O sia omogeneo e delle dimensioni previste. Questo esempio di blot mostra che il polimero LAC O nel clone uno è omogeneo e identico a quello del controllo positivo.

Nella corsia sette, se il plasmide non è stato ingegnerizzato per esprimere una fusione del repressore del lattosio lac eye infettare cloni adatti con un retrovirus che codifica lac eye fuso a una proteina fluorescente rossa come lac eye, TD pomodoro, TD pomodoro viene scelto invece di proteine che emettono fluorescenza più vicina al verde per ridurre al minimo la fototossicità che si verificherebbe da esposizioni multiple per lunghi periodi. Una volta introdotta la proteina di fusione dell'occhio LAC, la coltura, le cellule in presenza di 200 microgrammi per millilitro di IPTG per bloccare le proteine di fusione dal legare il DNA. Uno degli aspetti più critici di questa procedura è l'ottenimento di cloni con l'intensità di fluorescenza appropriata.

Un gran numero di cloni dovrebbe essere sottoposto a screening per identificare quelli con una coltura a fluorescenza ottimale. Le cellule per almeno tre giorni per consentire l'espressione dei cloni di screening della proteina di pomodoro TD dell'occhio LAC per quelli con livelli ottimali di lac occhio, pomodoro TD che rivelano segnali distinti con livelli minimi di fondo di proteina di fusione non legata, da 24 a 48 ore prima dell'imaging delle cellule che esprimono il pomodoro LAC I TD le piacciono in un piatto con fondo di vetro da 35 millimetri a una densità inferiore al 10% di confluenza. Ciò consentirà alle coppie di cellule di dividersi in colonie da 8 a 16 cellule senza sovrapporsi da una a tre ore prima dell'inizio dell'imaging.

Sciacquare la piastra tre volte con un terreno di coltura privo sia di farmaci selettivi che di IPTG. Questo lava via le cellule non vitali e consente alle proteine di fusione lac eye di legare i citi LAC nei plasmidi. Sostituire il terreno di coltura con due millilitri, DMEM con il 10% di siero fetale bovino e 25 millimolari di Hippie incubare per una o tre ore appena prima dell'imaging, sostituire la parte superiore del piatto di coltura con un foglio di culto allungato in un anello di montaggio per un piatto da 35 millimetri.

Questa copertura inibirà l'evaporazione del terreno di coltura, che aumenterebbe la concentrazione di sale nel tempo e ucciderebbe le cellule. Il sistema di imaging utilizzato in questo esperimento è costituito da un microscopio invertito Zeiss Axio 200 M, dotato di un tavolino motorizzato e di una telecamera CCD EM per il rilevamento sensibile dei segnali. La luce di eccitazione fluorescente è fornita dal LED bianco neutro di un sistema Collibra.

Il sistema di imaging è controllato da un software per l'acquisizione automatizzata di immagini su intervalli di tempo lunghi con più stack Z. Un incubatore a tavolino viene utilizzato per mantenere le cellule a 37 gradi Celsius, dal 5 al 10% di anidride carbonica in una camera umidificata. Utilizzare un collare riscaldato per l'obiettivo dell'olio per evitare che l'obiettivo si sifoni.

Il calore del campione consente al sistema di raggiungere una temperatura stabile. Per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l'esperimento, il sistema di imaging dovrebbe essere posizionato su un tavolo d'aria per essere isolato dalle vibrazioni. Per iniziare la procedura di visualizzazione del DNA marcato, utilizzare l'imaging DIC per visualizzare le cellule e determinare il piano focale della parte superiore e inferiore delle cellule in più campi visivi in ciascun campo, spostarsi su un piano focale a circa un terzo della discesa dalla parte superiore della cellula, salvare la x, y, Z nell'elenco delle posizioni di tappa salvate.

Ognuna di queste posizioni salvate sarà il centro di uno Zack di immagini per catturare la cellula nel software di controllo del microscopio, definire uno Zack di immagini da eseguire in ogni posizione di fase salvata, definire un numero sufficiente di fette in modo che l'intera cellula venga catturata insieme a fette extra sopra e sotto i piani in cui si trovano le cellule. Scegliere una dimensione del passo Z compresa tra 0,35 e 0,50 micron per consentire il campionamento approssimativo di nyquist nella dimensione Z. Queste fette consentono il rilevamento in seguito ai movimenti delle cellule durante il ciclo cellulare e vengono utilizzate anche nell'elaborazione post-acquisizione delle pile di immagini.

Ciò si tradurrà in una pila di 40-60 immagini a seconda dello spessore delle celle. Definisci un esperimento di serie temporali per raccogliere un'immagine in campo chiaro degli Zack a intervalli di 30 minuti e immagini a fluorescenza a intervalli da 10 a 60 minuti. Non utilizzare l'imaging DIC durante l'esperimento in quanto richiede più luce rispetto all'imaging standard in campo chiaro, che può esporre inutilmente le cellule alla fototossicità nel corso di lunghi esperimenti.

Avviare l'esperimento controllato dal software. Assicurarsi che il sistema non venga disturbato durante l'esperimento. Dopo che tutte le immagini per l'esperimento sono state acquisite, rivedere le immagini per ogni Zack e ritagliare eventuali aree non necessarie delle immagini per ridurre il tempo di elaborazione del computer.

Nel passaggio successivo per riassegnare l'intensità del segnale al pixel di origine in ogni stack Z. Utilizza un algoritmo di deconvoluzione nel software di visione Axio basato sulla funzione di diffusione del punto misurato dal sistema di imaging. Il risultato della deconvoluzione è mostrato qui.

Esamina le immagini per tracciare i cambiamenti di intensità e i movimenti dei plasmidi durante il ciclo cellulare e la partizione dei plasmidi in cellule figlie. Queste immagini, che sono realizzate computazionalmente per includere più piani Z in cui risiedono i diversi segnali, mostrano che i nuclei delle cellule HELOC che esprimono LAC eye TD tomato sono fluorescenti a causa del segnale di localizzazione nucleare sulla proteina di fusione, localizzandola nel nucleo. In assenza di genomi I-P-T-G-K-S-H-V che codificano per LAC, le sequenze O reclutano molte copie della proteina fluorescente e si distinguono come segnali luminosi sull'intensità di fondo del nucleo.

Al contrario, in presenza di IPTG, le proteine fluorescenti dell'occhio LAC sono impedite di legarsi alla sua sequenza di riconoscimento mancante di O, proiezioni di massima intensità di Zack acquisite di un ciclo cellulare a cinque volte. I punti di un esperimento rappresentativo sono mostrati in questa figura. I genomi virali marcati in fluorescenza nella cellula visibile nel pannello A sono sintetizzati nel pannello B.I genomi virali vengono quindi suddivisi in cellule figlie durante la divisione cellulare, come osservato nei pannelli C, D ed E.Il ciclo cellulare per le cellule HELOC sane dura circa 24 ore e le cellule figlie in genere si attaccano l'una all'altra e continuano a dividersi contemporaneamente nel ciclo cellulare successivo.

Utilizzando questo protocollo, i genomi virali nella cellula possono essere seguiti per più generazioni durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di osservare la morfologia cellulare al momento della generazione per assicurarsi che le cellule siano sane durante l'esperimento.