Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il partizionamento dei genomi virali in cellule in divisione. Questo risultato si ottiene innanzitutto creando un plasmide che possa essere visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. In questo caso, un plasmide viene modificato per includere ripetizioni in tandem della sequenza operatore della lacitosa o LAC O. Il secondo passaggio consiste nell'introdurre il plasmide in cellule in divisione, seguito dall'infezione delle cellule con un retrovirus che codifica per il repressore della lacitosa o lac eye fusionato a una proteina fluorescente.

Le proteine di fusione del represse del lattosio si legano specificamente alle sequenze operatrici del lattosio nel plasmide sub. Le cellule vengono monitorate mediante microscopia a fluorescenza per seguire singoli plasmidi attraverso diversi cicli cellulari. Infine, le immagini acquisite vengono elaborate per determinare come i genomi virali vengano mantenuti nelle cellule in divisione.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la PCR quantitativa, il Southern blotting o l'ibridazione fluorescente in situ, è che questa tecnica permette di osservare singoli plasmidi in diversi punti nel tempo. Per consentire la visualizzazione del plasmide mediante microscopia a fluorescenza, si utilizzano tecniche standard di clonaggio molecolare per inserire nel plasmide un frammento di DNA contenente circa 250 copie della sequenza operatore della lac (lacO). In questo esempio, il plasmide è un cosmide di circa 170 paia di chilobasi che contiene l'intero genoma del virus dell'herpes associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) e codifica per la resistenza all'igromicina.

Introdurre il DNA plasmidico contenente LAC O in cellule mammifere HeLa e SLK mediante trasfezione in piatti da 60 millimetri, incubando le cellule con 10 microgrammi di plasmide purificato, 25 microlitri di lipefetto, 2000 0,5 millilitri di OptiMEM e 3,5 millilitri di DMEM per quattro ore. Cambiare il mezzo con DMEM contenente 10% di siero fetale bovino e lasciare riposare le cellule per 48 ore.

Successivamente, piastrare le cellule trasfettate a bassa densità in piatti grandi e coltivarle per tre settimane in DMEM contenente 10% di siero fetale bovino e 300 microgrammi per millilitro di igromicina per selezionare il plasmide introdotto; utilizzare pezzi sterili di bastoncini e carta da filtro imbevuta per trasferire le colonie resistenti all'igromicina in nuovi piatti di coltura. Collocare i piatti nell'incubatrice dopo una o due settimane, quando i cloni trasfettati sono cresciuti fino a riempire il piatto, isolare il DNA ed eseguire una digestione con enzimi di restrizione e un southern blot per verificare che il polimero del plasmide LAC O sia omogeneo e della dimensione prevista. Questo esempio di blot mostra che il polimero LAC O nel clone uno è omogeneo e identico a quello del controllo positivo.

Nella corsia sette, se il plasmide non è stato modificato per esprimere una fusione del repressore del lattosio lac eye, infettare le colonie adatte con un retrovirus che codifica lac eye fuso a una proteina fluorescente rossa come lac eye, TD tomato; si sceglie TD tomato invece di proteine che fluorescono in tonalità più vicine al verde per minimizzare la fototossicità che si verificherebbe a causa di ripetute esposizioni prolungate. Una volta introdotta la proteina di fusione LAC eye, coltivare le cellule in presenza di 200 microgrammi per millilitro di IPTG per impedire al complesso proteico di legarsi al DNA. Uno degli aspetti più critici di questa procedura è ottenere colonie con l'intensità di fluorescenza appropriata.

Un gran numero di cloni deve essere analizzato per identificare quelli con un'ottimale fluorescenza della coltura. Coltivare le cellule per almeno tre giorni per consentire l'espressione della proteina LAC eye TD tomato; selezionare i cloni che mostrano livelli ottimali di LAC eye TD tomato, rivelando segnali distinti con livelli di fondo minimi di proteina fusa non legata. Da 24 a 48 ore prima dell'acquisizione delle immagini, seminare le cellule esprimenti LAC I TD tomato in una piastra da 35 millimetri con fondo in vetro a una densità inferiore al 10% di confluenza. Questo permetterà alle coppie di cellule di dividersi formando colonie di otto-sedici cellule senza sovrapposizioni, da uno a tre ore prima dell'inizio dell'acquisizione.

Lavare la piastra tre volte con mezzo di coltura privo sia di farmaci selettivi che di IPTG. Questo passaggio rimuove le cellule non vitali e permette alle proteine di fusione lac eye di legarsi alle cellule LAC nei plasmidi. Sostituire il mezzo di coltura con due millilitri di DMEM contenente 10% di siero fetale bovino e 25 millimolare di Hippies, incubare per uno a tre ore appena prima dell'acquisizione delle immagini, quindi sostituire il coperchio della piastra di coltura con una pellicola per colture tesa in un anello di montaggio per una piastra da 35 millimetri.

Questa copertura inibirà l'evaporazione del mezzo di coltura, che altrimenti aumenterebbe la concentrazione di sali nel tempo e causerebbe la morte delle cellule. Il sistema di imaging utilizzato in questo esperimento è costituito da un microscopio invertito Zeiss Axio 200 M, dotato di un palchetto motorizzato e di una camera CCD a moltiplicazione elettronica per una rilevazione sensibile dei segnali. La luce di eccitazione fluorescente è fornita dal LED bianco neutro di un sistema Collibra.

Il sistema di imaging è controllato da un software per acquisizioni automatizzate di immagini a intervalli di tempo prolungati con più stack Z. Si utilizza un incubatore da tavolo per mantenere le cellule a 37 gradi Celsius, con una concentrazione di anidride carbonica dal 5 al 10% in una camera umidificata. Utilizzare un collare riscaldato per l'obiettivo ad olio per evitare che l'obiettivo aspiri il liquido.

Il calore proveniente dal campione permette al sistema un tempo sufficiente per raggiungere una temperatura stabile. Per ridurre al minimo gli artefatti dovuti al movimento durante l'esperimento, il sistema di imaging dovrebbe essere posizionato su un tavolo antivibrante, in modo da essere isolato dalle vibrazioni. Per iniziare la procedura di visualizzazione del DNA marcato, utilizzare l'immagine in contrasto di interferenza differenziale (DIC) per osservare le cellule e determinare il piano focale superiore e inferiore delle cellule in più campi visivi; in ciascun campo, spostarsi su un piano focale situato approssimativamente a un terzo della profondità rispetto alla sommità della cellula e salvare le coordinate x, y, Z nell'elenco delle posizioni del palchetto memorizzate.

Ognuna di queste posizioni salvate sarà il centro di uno stack di immagini per acquisire la cellula nel software di controllo del microscopio; definire uno stack di immagini da eseguire in corrispondenza di ciascuna posizione del palchetto salvata, definendo un numero sufficiente di sezioni in modo da coprire interamente la cellula, con sezioni aggiuntive al di sopra e al di sotto dei piani in cui si trovano le cellule. Scegliere un passo Z compreso tra 0,35 e 0,50 micron per consentire un campionamento approssimativamente di tipo Nyquist nella dimensione Z. Queste sezioni permettono di rilevare i movimenti cellulari durante il ciclo cellulare e vengono inoltre utilizzate nel processamento successivo all'acquisizione degli stack di immagini.

Questo produrrà una serie di 40-60 immagini a seconda dello spessore delle cellule. Definire un esperimento in serie temporale per acquisire un'immagine in campo chiaro dei Zacks a intervalli di 30 minuti e immagini in fluorescenza a intervalli di 10-60 minuti. Non utilizzare l'immagine DIC durante l'esperimento poiché richiede più luce rispetto all'immagine standard in campo chiaro, il che potrebbe esporre inutilmente le cellule a fototossicità nel corso di esperimenti prolungati.

Avviare l'esperimento controllato tramite software. Assicurarsi che il sistema non venga disturbato durante l'esperimento. Dopo aver acquisito tutte le immagini per l'esperimento, esaminare le immagini per ogni coltura di Zack e punto temporale, ritagliando le aree non necessarie delle immagini per ridurre il tempo di elaborazione del computer.

Nel passaggio successivo, riassegnare l'intensità del segnale al pixel di origine in ciascuno stack Z. Utilizzare un algoritmo di deconvoluzione nel software Axio Vision basato sulla funzione di dispersione puntuale misurata del sistema di imaging. Il risultato della deconvoluzione è mostrato qui.

Esaminare le immagini per seguire le variazioni di intensità e i movimenti dei plasmidi durante il ciclo cellulare e la distribuzione dei plasmidi alle cellule figlie. Queste immagini, generate computazionalmente includendo diversi piani Z in cui risiedono i diversi segnali, mostrano che i nuclei delle cellule HELOC che esprimono LAC eye TD tomato sono fluorescenti a causa del segnale di localizzazione nucleare presente sulla proteina di fusione, che la localizza nel nucleo. In assenza di I-P-T-G-K-S-H-V, i genomi che codificano per le sequenze LAC O reclutano numerose copie della proteina fluorescente e si evidenziano come segnali intensi rispetto all'intensità di fondo del nucleo.

Al contrario, in presenza di IPTG, le proteine fluorescenti LAC impedicono al fattore di trascrizione di legarsi alla sua sequenza di riconoscimento lacO; le proiezioni di intensità massima di Zack acquisite durante un ciclo cellulare in cinque punti temporali in un esperimento rappresentativo sono mostrate in questa figura. I genomi virali marcati in modo fluorescente nelle cellule visibili nel pannello A vengono sintetizzati come mostrato nel pannello B. I genomi virali vengono quindi ripartiti nelle cellule figlie durante la divisione cellulare, come osservato nei pannelli C, D ed E. Il ciclo cellulare di cellule sane HELOC dura approssimativamente 24 ore e le cellule figlie si attaccano tipicamente vicine tra loro e procedono a dividersi contemporaneamente nel successivo ciclo cellulare.

Utilizzando questo protocollo, i genomi virali all'interno della cellula possono essere seguiti per diverse generazioni durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di monitorare la morfologia cellulare nel tempo di generazione per garantire che le cellule rimangano sane per tutta la durata dell'esperimento.