preparazione e In Vitro Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre una tecnica che garantisca la modifica cellulare con microRNA e in parallelo magnetizzazione cellulare. Questo metodo può affrontare le sfide chiave nel campo della medicina rigenerativa. Come l'ingegneria genetica delle cellule prima del trapianto.

Oltre all'efficiente modifica cellulare con il microRNA, lo hanno permesso con l'ossido di ferro. Questo può essere utilizzato per migliorare la ritenzione cellulare nel lato di interesse mediante l'applicazione di campi magnetici. La terapia cellulare è molto promettente per il trattamento delle malattie cardiache, la ritenzione di ipocellule e la sopravvivenza cellulare devono essere urgentemente migliorate.

Iniziare questa procedura con la coltura di cellule endoteliali della vena ombelicale umana in preparazione dei complessi di trasfezione come descritto nel protocollo di testo. 48 ore prima della trasfezione, seminare gli HUVEC su piastre di plastica per colture cellulari di dimensioni adeguate. Con una densità cellulare iniziale di circa 13.000 cellule per centimetro quadrato di superficie di crescita.

Successivamente, preparare nanoparticelle fresche di miR/polietilimonimo/ossido di ferro super paramagnetico. Per prima cosa diluire 2,5 picomoli di microRNA per centimetro quadrato di superficie di crescita cellulare e una soluzione di glucosio al cinque percento per ottenere una concentrazione finale di 0,125 picomoli di microRNA per microlitro. Quindi, diluire il PEI in un volume uguale di soluzione di glucosio al cinque percento.

Aggiungere il PEI diluito alla soluzione di microRNA e agitare la miscela ottenuta per 30 secondi. Quindi incubare la miscela miR/PEI per 30 minuti a temperatura ambiente. Sonicare gli MNP per almeno 20 minuti nel bagno d'acqua sonicante a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere la quantità appropriata di soluzione di MNP alla miscela miR/PEI pronta. Dopo aver agitato per 30 secondi, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere la miscela miR/PEI/MNP preparata goccia a goccia direttamente nel terreno di coltura sulle cellule.

Sostituire questa miscela con un terreno di coltura fresco sei ore dopo la trasfezione. Dopo l'analisi della sicurezza del vettore come descritto nel protocollo di testo, confermare e caratterizzare la localizzazione intracellulare dei complessi di trasfezione mediante microscopia ad illuminazione strutturata confocale e super-risoluzione. Per fare ciò, seminare gli HUVEC su vetrini di vetro rivestiti di gelatina posti nei pozzetti delle piastre di coltura a 24 pozzetti come in precedenza.

Trasfettare le cellule con miR/PEI/MNP marcato a 3 colori e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il cinque percento di anidride carbonica. Lavare i vetrini coprioggetti prima con albumina sierica bovina al due percento e soluzione salina tamponata con fosfato, e poi con solo PBS. Fissare le cellule incubando in paraformaldeide al quattro percento o PFA a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Lavare con PBS e poi colorare i nuclei con DAPI seguendo i protocolli standard. Quindi lavare le cellule con PBS tre volte per 15 minuti sullo shaker per rimuovere il colorante in eccesso. Posizionare i vetrini coprioggetti preparati sui vetrini del microscopio utilizzando un mezzo di montaggio adatto e lasciare asciugare i vetrini per almeno un'ora prima di utilizzarli per la microscopia.

Acquisisci immagini utilizzando un obiettivo a immersione in olio 63 volte nelle impostazioni SIM che si trovano nel protocollo di testo. Per il targeting cellulare e le condizioni dinamiche simulate in vitro, trasfettare prima gli HUVEC in una piastra a 24 pozzetti come in precedenza. Dopo averli incubati per 24 ore, lavare le cellule.

Quindi aggiungere un x trip in EDTA diluito in PBS e incubare le cellule per quattro minuti a 37 gradi Celsius prima di raccogliere le cellule. Centrifugare le cellule raccolte a 300 volte G per 10 minuti. Mescolare il pellet cellulare ottenuto da un pozzetto con un millilitro di terreno di coltura fresco.

E trasferire le cellule in un singolo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Fissa un piccolo magnete localmente usando del nastro adesivo. Posizionare la piastra di coltura sull'agitatore e incubare la sospensione cellulare per 12 ore a 150 giri/min per simulare le condizioni dinamiche.

Quindi lavare le celle e fissarle utilizzando il quattro percento di PFA. Colorare i nuclei con DAPI. Registra l'attacco cellulare utilizzando la microscopia confocale a scansione laser con laser di eccitazione a 405 e 504 nanometri adolescenti in modalità z-stack per ottenere i dati grezzi.

Utilizzare l'elaborazione delle immagini di proiezione alla massima intensità per creare immagini per l'analisi. Per l'analisi quantitativa di cellule magneticamente reponsive e non responsive, trasfettare prima gli HUVEC in una piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule per 24 ore prima di lavare e raccogliere le cellule come descritto in precedenza.

Risospendere il pellet cellulare ottenuto da ciascun pozzetto con 500 microlitri di tampone di selezione cellulare sterile riscaldato. Applicare la sospensione cellulare a una colonna di smistamento magnetica fissata dal magnete in dotazione. Quindi lavare tre volte le colonne sul magnete con un tampone di selezione cellulare fresco.

Raccogli il flusso attraverso come frazione magneticamente non reattiva. Rimuovete le colonne dal magnete e raccogliete immediatamente la frazione cellulare magneticamente reattiva spingendo un nuovo tampone di smistamento delle cellule attraverso la colonna utilizzando uno stantuffo. Centrifugare entrambe le frazioni Mag- e Mag+ a 300 volte G per 10 minuti.

Dopo aver risospeso il pellet cellulare in PBS, contare le cellule e valutare la vitalità cellulare con un saggio di esclusione del blu di tripano. Isolate dal cordone ombelicale, le HUVEC sono caratterizzate dall'espressione del marcatore endoteliale CD31 e dalla formazione di tubi su una matrice di membrana basale. Gli HUVEC trasfettati con miR/PEI/MNP assorbono tutti miR etichettati.

E la loro sopravvivenza rimane inalterata 24 ore dopo la trasfezione. Inoltre, la microscopia a super-risoluzione mostra la localizzazione paranucleare di complessi di trasfezione marcati a 3 colori. La tossicità del PEI è confermata dalla ridotta funzionalità delle cellule trasfettate con miR/PEI.

È importante sottolineare che l'MNP ripristina le proprietà cellulari. Le cellule modificate con miR/PEI/MNP non differiscono dalle cellule non trattate in termini di formazione di provette. Inoltre, queste cellule mantengono la comunicazione giunzionale intercellulare come rivelato attraverso il recupero della fluorescenza dopo il foto-sbiancamento.

Una volta che una sospensione di cellule modificate con miR/PEI/MNP viene seminata nei pozzetti di una piastra di coltura posta sull'agitatore rotante, le cellule tendono a migrare e ad attaccarsi nell'area di applicazione del magnete locale. Immagini rappresentative raffigurano la crescita cellulare nell'area con l'applicazione del magnete. Senza applicazione di magnete.

E al centro del pozzetto di coltura dove il flusso di liquido concentrava le cellule. Una volta padroneggiata, la trasfezione cellulare può essere eseguita in due ore. Dopo aver visto questo video dovresti avere un'ottima impressione su come modificare transitoriamente ma in modo altamente efficiente le cellule endoteliali, compresa la magnetizzazione.

E anche come caratterizzare terminalmente il prodotto cellulare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire i numeri forniti per la semina cellulare, le quantità di componenti per la preparazione dei complessi di trasfezione, il tempo di incubazione e la fase di lavaggio dopo la trasfezione. Siamo molto ottimisti sul fatto che questo approccio sarà ben trasferibile ad altri tipi di cellule per il trattamento di altri organi colpiti.

Seguendo questa procedura possono essere eseguiti studi in vivo con celle magnetizzate modificate. Potrebbero rispondere a ulteriori domande se il carico di ferro delle cellule è efficiente per garantire la loro ritenzione nel lato di interesse. E anche per definire i limiti di rilevabilità con la risonanza magnetica in vivo.