Name: Un modello Xenotranest derivato dal paziente per la malformazione Venosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Scopri come creare un modello xenotrapianto murino derivato dal paziente per studiare le malformazioni venose. Questo metodo consente il monitoraggio quotidiano delle cellule endoteliali e il test terapeutico preclinico.

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Gli autori ringraziano Nora Lakes per la correzione delle bozze. La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Heart, Lung, and Blood Institute, sotto il premio numero R01 HL117952 (E.B.), parte del National Institutes of Health. Il contenuto è esclusivamente di competenza degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

<ol><li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+malformation%3A+update+on+aetiopathogenesis%2C+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Phlebology%3A+The+Journal+of+Venous+Disease%22%5BJournal%5D)">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li>
<li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li>
<li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).</li>
<li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li>
<li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+%28PDX%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889(2019).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen%2C+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).</li>
<li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen%2C+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).</li>
<li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li>
<li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li>
<li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xenograft+model+for+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li>
<li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li>
<li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interessi da divulgare.

Qui viene descritto un metodo per generare un modello xenotrapianto derivato dal paziente della macchina virtuale. Questo modello murino presenta un eccellente sistema che consente ai ricercatori di ottenere una comprensione più profonda dell'allargamento del lume patologico e sarà determinante nello sviluppo di terapie più efficaci e mirate per il trattamento della VM. Questo può essere facilmente adattato per studiare altri tipi di anomalie vascolari come la malformazione venosa linfatica capillare16<...

I difetti nello sviluppo della vascolatura sono la causa alla base di molte malattie, tra cui la malformazione venosa (VM). Vm è una malattia congenita caratterizzata da morfogenesi anormale ed espansione delle vene1. Importanti studi sul tessuto della macchina virtuale e sulle cellule endoteliali (EC) hanno identificato mutazioni di guadagno di funzione in due geni: TEK, che codifica il recettore della chinasi della tirosina TIE2, e PIK3CA, che codifica l'isoforma di p110 (sottounità catalitica) di PI3-chinasi (PI3K)2,3,4,5. Queste mutazioni somatiche si trasgrede in un'iperattivazione indipendente dal ligando delle vie di segnalazione chiave angiogenica/crescita, compreso il PI3K/AKT, con conseguente vene ectatiche dilatate3. Nonostante queste importanti scoperte genetiche, i successivi meccanismi cellulari e molecolari che innescano l'angiogenesi anormale e la formazione di canali vascolari allargati non sono ancora pienamente compresi.
Durante l'angiogenesi normale e patologica, i nuovi vasi provengono da una rete vascolare preesistente e la CE subisce una sequenza di importanti processi cellulari tra cui la proliferazione, la migrazione, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la formazione del lume6. Le colture in vitro bidimensionali (2D/3D) della CE sono strumenti importanti per studiare ciascuna di queste proprietà cellulari singolarmente. Tuttavia, vi è una chiara richiesta di un modello murino che ricapitoli l'allargamento patologico delle navi all'interno del microambiente dell'ospite, fornendo al contempo una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica di farmaci mirati per la ricerca traslazionale.
Fino ad oggi, non è stato segnalato un modello murino transgenico di VM associato a mutazioni di guadagno di funzione TIE2. Gli attuali modelli di topo VM transgenici si basano sull'espressione onnipresente o limitata ai tessuti della mutazione attiva PIK3CA p.H1047R3,5. Questi animali transgenici forniscono informazioni significative sugli effetti specifici di tutto il corpo o dei tessuti di questa mutazione hotspot PIK3CA. La limitazione di questi modelli è la formazione di una rete vascolare altamente patologica con conseguente precoce letalità. Pertanto, questi modelli murini non riflettono pienamente l'occorrenza sporadica di eventi mutazionali e la natura localizzata della patologia della macchina virtuale.
Al contrario, i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente si basano sul trapianto o sull'iniezione di tessuto patologico o cellule derivate dai pazienti in topi immunodeficienti7. I modelli Xenotrapianto sono un potente strumento per ampliare le conoscenze sullo sviluppo della malattia e la scoperta di nuovi agentiterapeutici 8. Inoltre, l'utilizzo di cellule derivate dal paziente consente agli scienziati di ricapitolare l'eterogeneità della mutazione per studiare lo spettro dei fenotipi dei pazienti.
Qui, descriviamo un protocollo in cui la VM EC derivata dal paziente che esprime una forma mutante costitutivamente attiva di TIE2 e/o PIK3CA viene iniettata sottocutaneamente nella parte posteriore di topi nudi atimici. Le cellule vascolari iniettate sono sospese in un quadro ECM al fine di promuovere l'angiogenesi come descritto nei precedenti modelli di xenotrapianto vascolare9,10,11. Queste VM EC sono sottoposte a una significativa morfogenesi e generano vasi patologici allargati e perfuso in assenza di cellule di supporto. Il modello di xenotrapianto descritto di VM fornisce una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica dei farmaci mirati per la loro capacità di inibire l'espansione incontrollato del lume.

<table><tbody><tr><td>Topi nudi atimici, (Foxn1-nu); 5-6 settimane, maschi</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>Iniezione sottocutanea</td></tr><tr><td>Biotinilato Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>Identificazione istologica</td></tr><tr><td>Filtro per flacone (500 ml; 0,2 &; M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>974106</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>Coltura cellulare; Analisi istologica</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Calibro</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>50996491</td><td>Misurazione del tappo della lesione</td></tr><tr><td>CD31-biglie magnetiche coniugate (Dynabeads)</td><td>Life Technologies</td><td>11155D</td><td>Separazione EC</td></tr><tr><td>Filtro cellulare (100 &mu; M)</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Provetta conica; polipropilene (15 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 241</td><td>Provetta conica per colture cellulari</td></tr><tr><td>; polipropilene (50 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 239</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo di colorazione Coplin</td> per colture cellulari <td>Ted Pella</td><td>21029</td><td>Annosi</td></tr> <tr>istologica<td>Coverglass (50 X 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>Identificazione istologica</td></tr><tr><td>DAB: 3,3'Diaminobenzidina Reagente (ImmPACT DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>Identificazione istologica</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Separazione EC</td></tr><tr><td>Punzone per orecchie</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>Iniezione sottocutanea</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>Anesi istologica</td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali-2 (EGM2) Bulletkit (terreno basale e integratori)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Eosina Y (a base di alcol)</td><td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>Annosie</td></tr> <tr>istologica<td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Anelaysi istologica</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30910.03</td><td>Campione per colture cellulari</td></tr><tr><td>1.250 &mu; L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td>Puntale filtro a più gradini</td></tr><tr><td>20 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td><td>Puntale filtro a più stadi</td></tr><tr><td>200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tamponata in formalina a più fasi (10%)</td><td>Sigma</td><td>F04586</td><td>Ematocitometro per dissezione del tappo della lesione</td></tr><tr><td>(INCYTO; Monouso)</td><td>SKC FILMS</td><td>DHCN015</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>vettoriale Ematossilina</td><td>H-3401</td><td>Anlayssi istologica</td></tr><tr><td>Fibronectina plasmatica umana proteina purificata (1mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno (30% p/p)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Anesi istologica</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td>Analisi</td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Akorn Salute animale</td><td>59399-106-01</td><td>Iniezione sottocutanea</td></tr><tr><td>solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale (senza rosso fenolo; Senza LDEV)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Iniezione sottocutanea</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga (1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Separazione EC</td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio Superfrost (75 mm X 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015-CS</td><td>Aghi per anestesi istologica</td></tr><tr><td>, 26G x 5/8 pollici Aghi sterili Sub-Q</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD305115</td><td>Iniezione sottocutanea</td></tr><tr><td>Normale siero di cavallo</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>Identificazione istologica</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-L-Glutammina (100X)</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Terreno di montaggio permanente (VectaMount)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>Anesi istologica</td></tr><tr><td>Pestello Taglia C, Plain</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431F55</td><td>Isolamento EC</td></tr><tr><td>Fosfato tamponato Soluzione salina (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Bilancia per colture cellulari</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Pipette</td></tr><tr><td>sierologiche per iniezione sottocutanea (10 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche per colture cellulari (5ml)</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Streptavidina, perossidasi di rafano, concentrato, per IHC</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td> Siringa <td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>(60ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>Cel per colture</td></tr><tr><td>FILTRO PER SIRINGA (0,2 &; M)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Siringhe per colture cellulari</td></tr><tr><td>(1 mL con Luer Lock)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD-309628</td><td>Iniezione sottocutanea</td></tr><tr><td>Piastra trattata per colture tissutali (100 X 20 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Piastra</td></tr><tr><td>per colture cellulari Piastra trattata per colture tissutali (145X20 mm)</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Piastre trattate per colture tissutali (60 X 15) mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Tris-base (Trizma base)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Anesi istologica</td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu (0,4 %)</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA, 1X (0,05% tripsina/0,53 mM EDTA)</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biorad</td><td>170-6531</td><td>Anesi istologica</td></tr><tr><td>Bottiglia di Wheaton</td><td>VWR</td><td>16159-798</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Xileni</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Anlaysi istologica</td></tr></tbody></table>

un modello xenotranest derivato dal paziente per la malformazione venosa

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

La malformazione venosa (VM) è un'anomalia vascolare che deriva dallo sviluppo alterato della rete venosa con conseguente venatura dilatata e spesso disfunzionale. Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere attentamente la creazione di un modello murine xenograft che imita vm umano ed è in grado di riflettere l'eterogeneità del paziente. Le mutazioni TEK (TIE2) e PIK3CA non ereditarie iper-attivanti nelle cellule endoteliali (EC) sono state identificate come i principali fattori di allargamento della nave patologica nella VM. Il seguente protocollo descrive l'isolamento, la purificazione e l'espansione della EC derivata dal paziente che esprime il TIE2 mutante e/o PIK3CA. Questi CE vengono iniettati sottocutaneamente nella parte posteriore dei topi atimici immunodeficienti per generare canali vascolari ectatici. Le lesioni generate con LA CE mutante TIE2 o PIK3CA sono visibilmente vascolarizzate entro 7-u20129 giorni dall'iniezione e ricapitolano le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente vm. Questo modello di xenotrapianto VM fornisce una piattaforma affidabile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che guidano la formazione e l'espansione delle macchine virtuali. Inoltre, questo modello sarà strumentale per gli studi traslazionali che testano l'efficacia dei nuovi candidati ai farmaci per prevenire l'allargamento anormale delle navi visto nella VM umana.

Questo protocollo descrive il processo di generazione di un modello murine xenotrapianto di VM basato sull'iniezione sottocutanea della EC derivata dal paziente nella parte posteriore di topi nudi immunodeficienti. Le colonie di cellule endoteliali possono essere raccolte entro 4 settimane dall'isolamento iniziale delle cellule dal tessuto VM o dal sangue lesionale(Figura 1A,B). Il giorno dopo l'iniezione, la spina di lesione xenotrapianto copre una superficie di circa 80 u2012100 mm2. Nelle n...

Presentiamo un protocollo dettagliato per generare un modello murine xenograft di malformazione venosa. Questo modello si basa sull'iniezione sottocutanea di cellule endoteliali derivate dal paziente contenenti mutazioni genetiche TIE2 e/o PIK3CA iper-attivanti. Le lesioni dello Xenotrapianto ricapitolano da vicino le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente VM.

Un modello Xenotranest derivato dal paziente per la malformazione Venosa

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Questo protocollo può essere utilizzato per creare xenoinnesti derivati dal paziente che ricapitolano l'istopatologia delle malformazioni venose. Questo è stato ulteriormente permesso di portare i nostri test terapeutici preclinici. Questa tecnica fornisce un sistema NVivo veloce e affidabile che consente il monitoraggio quotidiano della crescita delle cellule endoteliali dirette del paziente e la risposta alla terapia sperimentale.Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per indagare altri tipi di anomalie vascolari o linfatiche. Iniziare preparando la sospensione cellulare per l'iniezione. Tripsinare le cellule endoteliali con cinque millilitri di pre-riscaldato 0,05% tripsin-EDTA a 37 gradi Celsius per due minuti.Neutralizzare la tripsina e aggiungendo cinque millilitri di EGM e raccogliere le cellule in un tubo conico da 150 millilitri. Centrifugarlo a 400 volte G per cinque minuti, quindi aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in tre millilitri di EGM. Conta le cellule con un emocitometro.Avventurare il volume con il numero di cella desiderato in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e pelletare nuovamente le cellule mediante centrifugazione. Aspirare il supernatante lasciando un piccolo volume per allentare il pellet cellulare. Resuspend il pellet cellulare con 220 microlitri di BMEM per iniezione.Mescolare accuratamente la sospensione cellulare sul ghiaccio assicurandosi di evitare di creare bolle. Aspirare la coltura cellulare BMEM mescolare in un'apertura di siringa millilitro tirando lo stantuffo. Bloccherai un ago sterile calibro 26 alla siringa e manterrai le siringhe preparate piatte sul ghiaccio prima dell'iniezione.Dopo aver fatto in modo che il mouse lo abbia anestetizzato correttamente, posizionarlo sullo stomaco e disinfettare la regione di iniezione con il 70% di etanolo. Arrotolare delicatamente la siringa preparata per rimondere le cellule sistemate. Scaglie all'estremità della siringa ed espellere un piccolo volume della sospensione cellulare.Pizzicare la pelle nel sito di iniezione per creare una struttura simile a una tenda. Quindi inserire l'ago proprio sotto la pelle e assicurarsi che l'ago sia solo profondo della pelle rilasciando la pelle di pizzico per prevenire l'iniezione nel tessuto muscolare. Tenendo l'ago costantemente accuratamente iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare per creare una piccola massa sferica.Fare attenzione a evitare di iniettare la sospensione cellulare nel muscolo. Misurare la lunghezza e la larghezza di ogni spina con una pinza. Allineare le spine di xenoinnesto sezionate su un tagliere accanto a un righello e scattare un'immagine per registrare la vascolarizzazione lorda delle lesioni.Quindi fissare le spine immergendole in formalina al 10% durante la notte a temperatura ambiente. Dopo la dissezione, i tappi di lesione vengono elaborati per l'analisi istologica e macchiati per UEA-1 per rilevare le cellule endoteliali derivate dall'uomo all'interno della spina. Scatta cinque immagini HPF per sezione di lesione con un microscopio a campo luminoso a ingrandimento di 20 X in un modello di piano X all'interno della sezione della lesione per evitare sovrapposizioni.Assicurati di includere una barra di scala nelle immagini scattate. Aprire le immagini HPF nell'immagine J.To calibrare i pixel della barra di scala, usare lo strumento linea retta e passare sopra la barra di scala. Quindi convertire i pixel misurati in millimetri facendo clic su Analizza e imposta scala.Fare quindi clic su Analizza misure impostate e selezionare l'area e aggiungere alla sovrapposizione. Misurare l'area di campo totale dell'HPF utilizzando analizzare e misurare il risparmio di questa misurazione per la quantificazione. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera delineare manualmente il canale vascolare positivo UEA-1.Fate clic su Analizza (Analyze) e misura (Measure) per quantificare l'area delineata. Misurare tutti i canali vascolari all'interno dell'HPF. Ripetere il processo per i cinque HPF prelevati all'interno di ogni sezione e trasferire i valori in Excel per ulteriori analisi.Quindi calcolare la percentuale di area vascolare e densità vascolare in base alle direzioni del manoscritto. Utilizzando questo protocollo le spine di lesione con cellule endoteliali mutanti iperattive TIE2 o PIK3CA vengono visibilmente vascolarizzate e perfuse entro sette o nove giorni dall'iniezione. Le spine di lesione assomigliano molto alle caratteristiche istopatologiche del tessuto VM umano e sono visibili grandi canali vascolari allineati da un sottile strato di cellule endoteliali.Queste strutture vascolari contengono tipicamente eriociti che confermano l'anastomosi funzionale con la vascolarizzazione del topo ospite. La colorazione immunoistochimica utilizzando la lettatina specifica dell'uomo UEA-1 conferma che le cellule che rivestono regioni vascolari sono derivate da cellule impiantate dall'uomo piuttosto che dalla vascolarizzazione del topo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori macchie di sezioni di lesione per marcatori di proliferazione o apoptosi per analizzare effetti specifici dei trattamenti sperimentali.Questo modello scenografico è stato utilizzato per studi preclinici di nuove terapie per la malformazione venosa, come l'inibitore mTOR rapamicina, che ha dimostrato efficacia in diversi studi clinici per pazienti con VM.

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Noi descriviamo un metodo per creare un modello affidabile di ipertensione venosa cerebrale nel topo adulto. Questo modello è stato ampiamente descritto ed testati nel ratto. Questo nuovo omologo nei topi apre la possibilità di utilizzare animali geneticamente modificate e amplia così le applicazioni del modello.

Topo adulto venosa Ipertensione Modello: carotide comune di External Vena giugulare anastomosi.

Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Per migliorare la nostra conoscenza della formazione neotissue cellulare e molecolare, un modello murino della TEVG è stata sviluppata di recente. Gli innesti sono stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Questo modello raggiunge risultati simili a quelli ottenuti nella nostra ricerca clinica, ma nel corso di un time-course di gran lunga ridotto.

L&#39;impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l'indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l'ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

Questo video mostra un modello per studiare lo sviluppo dell'iperplasia miointimale dopo un intervento chirurgico di interposizione venosa nei ratti.

Vena interposizione Modello: un modello adatto per studiare Bypass Graft pervietà

I modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente riassumono in modo più robusto le caratteristiche molecolari e biologiche del melanoma e sono più predittivi della risposta terapeutica rispetto ai tradizionali saggi basati sulla coltura dei tessuti plastici. Qui descriviamo il nostro protocollo operativo standard per la creazione di nuovi modelli PDX e la caratterizzazione/sperimentazione di modelli PDX esistenti.

Un modello di Xenotrapianto a parte del paziente di melanoma

Una fistola aortocaval è stata creata perforando l'aorta infra-renale murina attraverso entrambe le pareti nella vena cava inferiore ed è stata seguita dalla creazione di una stenosi nel suo deflusso attraverso la legatura parziale della vena cava inferiore. Questo modello riproducibile può essere utilizzato per studiare la stenosi venosa centrale.

Modello Murine della Stenosi Venoso Centrale utilizzando Aortocaval Fistula con una stenosi di flusso

Il presente protocollo mira a creare sperimentalmente iperplasia intima venosa sottoponendo le vene alla pressione arteriosa per lo sviluppo di strategie per attenuare l'iperplasia intimave venosa a seguito di chirurgia di rivascolazione utilizzando innesti vena.

Un modello di interposizione venosa di coniglio che imita la chirurgia di rivascolarizzazione usando grafts di venina per valutare l'iperplasia intima sotto la pressione sanguigna arteriosa

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

In questo protocollo, il nuovo innesto di bypass venoso del maiale è stato eseguito attraverso una piccola incisione nella parete toracica sinistra senza bypass cardiopolmonare. È stato condotto uno studio di patologia postoperatoria, che ha mostrato ispessimento intimale.

Istituzione e valutazione di un modello di malattia da trapianto di vena suina

Scopri come creare un modello xenotrapianto murino derivato dal paziente per studiare le malformazioni venose. Questo metodo consente il monitoraggio quotidiano delle cellule endoteliali e il test terapeutico preclinico.

Un modello Xenotranest derivato dal paziente per la malformazione Venosa

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