Un'interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

L'obiettivo generale di questo software di analisi delle immagini è l'analisi parallela della dinamica della protrusione e della concentrazione relativa delle proteine lungo l'intera lunghezza filopodiale. Questo metodo può davvero aiutarci a comprendere le questioni chiave della biologia cellulare, in particolare le singole proteine coinvolte nell'estensione e nella retrazione dei filopodi. Il vantaggio principale della tecnica è che l'algoritmo adattivo di tracciamento della forma fornito consente la valutazione quantitativa della dinamica della protrusione e della localizzazione delle proteine risolta spazialmente.

Per iniziare, coltivare neuroni, cellule HeLa o COS, in terreno integrato come dettagliato nel protocollo di testo. Una volta raggiunta la confluenza del 40%, trasfettare le cellule con i costrutti di scelta, utilizzando un reagente di trasvezione secondo le istruzioni del produttore. Conservare le cellule trasvecate in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 15-18 ore.

Dopo l'incubazione, riempire le camere di coltura cellulare fino al 90% con un terreno preriscaldato a 37 gradi Celsius, contenente 20 millimolari HEPES, per ridurre le variazioni di pH e osmolarità dovute all'evaporazione durante l'acquisizione dell'immagine. Per sigillare il coperchio, applicare un sottile strato di grasso sottovuoto all'interno del coperchio e premerlo delicatamente sulla camera di coltura contenente le cellule trasvette. Forse la parte più importante per l'analisi delle immagini è la qualità dell'immagine.

Una cosa a cui dobbiamo prestare attenzione è il rapporto segnale/rumore, che deve essere superiore a quattro e possiamo garantire che, regolando il tempo di esposizione della fotocamera e l'intensità e la forza del laser che inseguiscono, il frame rate deve essere superiore a un hertz. Acquisisci le immagini utilizzando un microscopio con un obiettivo 60x o 100x e senza flessione dei pixel. Utilizzare velocità di acquisizione non inferiori a un hertz per tracciare la dinamica filopodiale.

Per ridurre al minimo gli artefatti sfocati, immagine filopodiale vicino alla membrana del basilico. Per garantire un tracciamento fluido, regolare il tempo di esposizione della fotocamera e l'intensità del laser in modo che il rapporto segnale/rumore sia maggiore di quattro. Una volta completato, avviare l'acquisizione dell'immagine.

Dopo la pre-elaborazione delle immagini, come descritto nel protocollo di testo, caricare le immagini scaricando la cartella zippata contenente tutti i file necessari per l'analisi delle immagini. Decomprimere e copiare i file nella cartella di lavoro. Una volta installato, avviare l'interfaccia utente grafica aprendo il file denominato filopodiaAnalysisM3.fig.

Caricare i file TIFF dello stack salvati per le singole proteine nell'interfaccia utente grafica o nella GUI. Utilizzando i pulsanti 1B per la proteina A, 1C per la proteina B e, facoltativamente, 1D per la proteina C.Creare un'immagine sovrapposta della cellula dai canali proteici facendo clic su 1A. Quindi, fare clic su 2A, per assegnare il primo fotogramma e fare clic su 2B, per assegnare l'ultimo fotogramma per l'analisi.

Facoltativamente, ritagliare l'area di interesse o il ROI, contenente il filopodio di interesse utilizzando il pulsante 2H. Ruota l'immagine utilizzando il pulsante 2I o elimina le regioni indesiderate utilizzando lo strumento di disegno a mano libera, 2J. Sposta il cursore, 2C per ogni fotogramma per il controllo di qualità e per verificare se il filopodium rimane chiaramente visibile per tutto il filmato.

Per generare la traccia, per prima cosa, fare clic sul pulsante 3A nella finestra GUI uno, per aprire la finestra GUI due. Fare clic sul pulsante quattro nella finestra GUI due, per generare la massa del corpo cellulare sovrapposto che è stato generato nella finestra GUI uno, dopo aver fatto clic su 1A. Si consiglia di dedicare un po' di tempo all'ottimizzazione di parametri quali il numero di segmenti, la larghezza di scansione e il raggio di scansione per il set di dati sperimentale.

Sposta il cursore nella finestra numero due, per verificare dove appare per la prima volta la punta filopodiale. Quindi, fai clic sul pulsante cinque e apparirà il cursore. Utilizzare il cursore per selezionare la base da cui viene misurata la distanza della punta filopodiale.

Segue la punta dei filopodi nella cornice dove appare per la prima volta. Successivamente, selezionare la lunghezza di soglia oltre la quale i filopodi si piegheranno, utilizzando 6C. Quindi, specificare il numero di segmenti utilizzati per approssimare la forma dei filopodi nella casella 6A.

Specificare la larghezza di scansione, che funge da scanner orizzontale, per posizionare i nodi in 6B. Specificare il raggio di scansione nella casella 6D, utilizzare un valore che sia circa il 50% più grande dello spostamento della punta tra fotogrammi osservato. Quindi, specificare l'angolo di piegatura nella casella 6E.

Selezionare la traccia della cronologia della casella nella seconda finestra della GUI per salvare l'intero protocollo di tracciamento per riferimento futuro, quindi fare clic sul pulsante Traccia e analizza per avviare il monitoraggio. Per l'analisi spazio-temporale, selezionare la casella rappresentata da 8B, seguita dal canale proteico di interesse. Cliccando su 8A, si avvia il tracciamento delle proteine lungo la lunghezza filopodiale, utilizzando la traccia precedentemente generata.

Per l'analisi raziometrica delle proteine, selezionare la casella 9B o 9C e fare clic sul pulsante 9A per ottenere il grafico raziometrico spazio-temporale. Per eseguire l'analisi della punta filopodiale, selezionare la casella 8F e specificare la lunghezza della punta e la lunghezza della soglia dalla base, utilizzando 8G e 8H. Fare clic sul pulsante per salvare i dati in un file excel denominato dynamics.xlsx.

Quindi, fare clic su analizza intensità proteiche per generare la traccia delle intensità proteiche della punta filopodiale e salvarla per l'analisi raziometrica. Fare clic sul rapporto desiderato da analizzare, utilizzando 9D o 9E. Infine, fare clic sul pulsante di confronto, 9A per generare i dati raziometrici.

L'analisi delle cellule COS trasvecate con un marcatore per l'actina filamentosa in rosso e un riferimento citosolico in verde rivelano sporgenze filopodiali ricche di actina. Una serie temporale mostra che le sporgenze filopodiali ricche di actina si estendono e si ritraggono rapidamente. Utilizzando il software di analisi delle immagini, sono stati tracciati i singoli filopodi.

Il software di analisi delle immagini traccia in modo affidabile l'estensione filopodiale, oltre ai tassi di crescita e retrazione di un singolo filopodio, i chemigrafi mostrano anche la concentrazione di actina normalizzata al riferimento citosolico. Se utilizzata correttamente, questa tecnica consente l'analisi quantitativa della dinamica della protrusione e della concentrazione proteica spazialmente risolta lungo i filopodi. Quando si tenta la procedura, è importante ricordare la velocità di acquisizione e mantenere il rapporto segnale/rumore maggiore di quattro, senza saturare le singole immagini.