Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare direttamente l'attività delle proteine leganti il DNA nelle cellule batteriche vive. Ciò si ottiene visualizzando le cellule che esprimono una proteina fluorescente fotoattivata fusa con una proteina legante il DNA di interesse. Il secondo passo della procedura consiste nell'acquisire un filmato di singole proteine che vengono fotoattivate durante l'immagine.

Quindi i dati vengono analizzati per determinare le localizzazioni proteiche e tracciare le proteine all'interno delle singole cellule. Gli eventi di legame al DNA sono identificati dalla variazione del coefficiente di diffusione delle singole proteine quando entrano in contatto con i cromosomi. In definitiva, i risultati possono fornire una misura quantitativa delle interazioni proteina-DNA a livello di singola cellula contando il numero di proteine legate e diffuse per cellula.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione del DNA, come i tassi di riparazione in vivo e la distribuzione spaziale dei siti di riparazione. Ora dimostreremo il metodo misurando l'attività di riparazione della DNA polimerasi uno nella vita delle cellule di e coli. Per prima cosa facciamo dei vetrini coprioggetti senza particelle fluorescenti di fondo in una fornace a 500 gradi Celsius per un'ora. Bruciare una scorta di vetrini coprioggetto di spessore numero 1,5, conservarli a temperatura ambiente in un foglio di alluminio.

Sono buoni per le settimane a venire. Successivamente, concentrare un millilitro di E coli in fase esponenziale precoce in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri del ceppo. AB 1157 poly a PA m cherry centrifugare le celle a 2, 300 G per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 20 microlitri di terreno residuo e agitare le cellule in soluzione. Successivamente, preparare una soluzione aros a bassa fluorescenza all'1,5% in acqua distillata. Mescolare 500 microlitri di aeros fuso con 500 microlitri di terreno due x minimo pipettando delicatamente su e giù alcune volte per esperimenti di danno al DNA utilizzando metilmetano solfonato o MMS prendendo precauzioni.

Aggiungere 8,3 microlitri di MMS ai 500 microlitri di terreno minimo prima di mescolarlo con l'aros prima che la miscela si raffreddi. Stenderlo su un vetrino coprioggetti bruciato. Stenderlo uniformemente e centrato senza fare bolle.

Appiattire il tampone con un secondo vetrino coprioggetti bruciato. Una volta raffreddato, rimuovere il coperchio superiore dal tampone e aggiungere un microlitro di sospensione cellulare concentrata. Immobilizzare le celle coprendo il tampone con un nuovo vetrino coprioggetti bruciato e premendo molto delicatamente.

Le cellule devono essere sottoposte a imaging entro 45 minuti prima di essiccarsi. Per prolungare questo tempo, il tampone può essere sigillato all'interno di una guarnizione in silicone per esperimenti di danno al DNA. Prima di eseguire l'imaging delle cellule, incubarle sul tampone per 20 minuti.

In un contenitore umidificato a temperatura ambiente, il microscopio è dotato di un laser di fotoattivazione a 405 nanometri e di un laser di eccitazione a 561 nanometri. La sensibilità di una singola molecola viene raggiunta eccitando solo i quattro fluoro all'interno di una sezione sottile sopra la superficie del vetrino coprioggetto utilizzando un'illuminazione altamente inclinata, l'emissione di fluorescenza viene registrata su una telecamera CCD a moltiplicazione di elettroni. Posizionare il campione sul tavolino del microscopio e mettere a fuoco le cellule.

Con l'illuminazione a luce trasmessa, definire un campo visivo ritagliato per ridurre le dimensioni dei dati e aumentare la velocità di lettura della telecamera. Coprire il campione dalla luce ambientale e accendere il guadagno della telecamera CCD moltiplicatore di elettroni per il rilevamento di un singolo fluoro quattro. Impostate la frequenza fotogrammi su 15,26 millisecondi per fotogramma.

Ciò include la lettura della fotocamera di 0,26 millisecondi I tempi di esposizione devono essere sufficientemente brevi per osservare punti fluorescenti nitidi con poco movimento a tutto volume. D'altra parte, le tracce devono essere campionate a intervalli di tempo sufficientemente lunghi per distinguere chiaramente il legato dalle molecole diffusori. Ora visualizza i dati della fotocamera per controllare il segnale di sfondo scuro.

Accendere il laser a 561 nanometri e controllare il segnale di fondo di eccitazione. Accendere il laser a 405 nanometri per la fotoattivazione delle proteine di fusione della ciliegia PA M di Paul one e aumentare l'intensità fino a quando non compaiono macchie fluorescenti di singole molecole. Ora regola l'angolo del fascio di eccitazione per illuminare solo una sezione sottile del campione.

Chiudere la superficie del vetrino coprioggetto. Questo metodo si basa sul rilevamento e sulla localizzazione precisa di singole proteine fluorescenti, quindi l'allineamento e la sensibilità ottimali del microscopio saranno cruciali per la qualità dei dati. A tal fine, focalizzare il raggio laser sul piano focale posteriore di un obiettivo con apertura numerica 1,4 100x.

Traslando la lente di messa a fuoco perpendicolarmente al raggio, la messa a fuoco si allontana dal centro dell'obiettivo, provocando l'uscita del raggio dall'obiettivo sotto un angolo. Punta al raggio per massimizzare l'intensità della fluorescenza e ridurre al minimo lo sfondo. Trova un nuovo campo visivo delle cellule in modalità microscopia a luce trasmessa e metti a fuoco l'immagine.

Scatta un'istantanea della fotocamera per registrare i contorni delle celle. Accendi il laser a 561 nanometri e sbianca l'autofluorescenza cellulare e le macchie di sfondo sul coperchio. Scivolare per qualche secondo.

Prima di iniziare l'acquisizione dei dati, iniziare l'acquisizione di un film palmare sotto eccitazione continua a 561 nanometri. Accendi il laser a 405 nanometri e aumenta gradualmente l'intensità nel corso del filmato, raggiungendo fino a un watt per centimetro quadrato. Evitare intensità più elevate di 405 nanometri che causano l'autofluorescenza cellulare.

Prestare attenzione alla densità delle molecole fluorescenti. È importante mantenere bassi i tassi di attivazione in modo che le macchie fluorescenti siano chiaramente isolate in ogni fotogramma. Registra circa 10.000 fotogrammi per filmato, che con un campo visivo ritagliato richiede in genere fino a tre minuti e fino a un gigabyte di spazio su disco rigido.

Si noti che una volta che un campo visivo è stato ripreso, i fluorofori della ciliegia pa m sono sbiancati in modo irreversibile e non possono essere osservati. Anche in questo caso, la procedura seguente utilizza un software personalizzato in matlab. I singoli fluorofori appaiono come funzioni di diffusione puntuale o psfs.

Nel filmato, le psf vengono identificate per la prima volta in un'immagine filtrata passa-banda utilizzando un kernel gaussiano con sette pixel di diametro: le posizioni candidate corrispondono a P SFS con intensità di pixel di picco 4,5 volte superiori alla deviazione standard dello sfondo. Il pixel localmente più luminoso per PSF candidato serve come ipotesi iniziale per l'adattamento di una funzione gaussiana ellittica. I parametri di adattamento libero sono la posizione X, la posizione X, la larghezza, la rotazione della larghezza Y, l'angolo, l'ampiezza e l'offset dello sfondo.

La maschera gaussiana ellittica tiene conto del movimento della molecola durante il tempo di esposizione, che sfoca e deforma il grafico PSF. Le localizzazioni XY risultanti da tutti i fotogrammi del film palmare sull'immagine di microscopia a luce trasmessa delle stesse localizzazioni del campo visivo di Paul one PAM Cherry dovrebbero apparire all'interno dell'area centrale delle cellule di e coli. Il tracciamento automatizzato misura il movimento delle proteine, ma la scelta corretta di una finestra di tracciamento è fondamentale.

Innanzitutto, eseguire l'algoritmo di rilevamento per un intervallo di parametri della finestra di rilevamento. Tracciare il numero di tracce misurate per cella rispetto alla finestra di tracciamento per identificare la finestra di tracciamento più piccola possibile che non divide le tracce, visualizzare le tracce risultanti sull'immagine di microscopia a luce trasmessa dello stesso campo visivo. Per visualizzare la distribuzione spaziale del movimento delle molecole all'interno delle cellule, le tracce P one dovrebbero mostrare la diffusione confinata all'interno di singole cellule se una frazione di tracce sembra attraversare tra le cellule, questo suggerisce che molecole separate sono state erroneamente collegate perché la finestra di tracciamento è stata scelta troppo grande e/o il tasso di attivazione fotografica era troppo alto.

Traccia la distribuzione cumulativa delle lunghezze dei passi tra localizzazioni consecutive. La curva aumenta e si satura in modo uniforme per finestre di tracciamento sufficientemente grandi, ma mostra un bordo di taglio se la finestra è stata scelta troppo piccola. Una volta scelta una finestra di tracciamento adatta, è possibile analizzare le caratteristiche di diffusione di quella di Paul.

Calcola lo spostamento quadratico medio o MSD tra localizzazioni consecutive per ogni traccia con un totale di n passi Utilizzare solo tracce con almeno cinque localizzazioni per ridurre l'incertezza statistica della MSD. Quindi, calcola il coefficiente di diffusione apparente per traccia dalla MSD. Il secondo termine corregge l'errore di localizzazione stimato.

Questi sono i valori per il secondo mandato. In questo esempio, ora tracciando un istogramma dei valori del coefficiente di diffusione misurati da tutte le tracce nel campo visivo per pol uno in cellule non danneggiate e per pol uno in cellule sottoposte a trattamento per danni al DNA con MMS, le barre rosse identificano la popolazione di singole molecole pol uno che sembrano legate al cromosoma e diffondono a meno di 0,15 micron quadrati al secondo. Mentre le molecole che si diffondono liberamente si muovono di circa 0,9 micron quadrati al secondo.

Dopo il legame di Paolo sono state identificate le molecole. Le posizioni dei siti di legame possono essere visualizzate in cellule non danneggiate e in cellule con danno mm MS. La frazione di tracce legate rispetto al numero totale di tracce osservate fornisce una misura quantitativa diretta dell'attività di riparazione del DNA di pol.

Una fotoattivazione in vivo delle proteine di fusione della ciliegia pol one PA m è stata effettuata in cellule vive di e coli. La fotoattivazione potrebbe essere limitata a un singolo fluoroforo di ciliegia PA m in una cellula, tassi di fotoattivazione più elevati hanno rivelato più molecole fluorescenti. L'analisi della localizzazione è stata eseguita per ogni fotogramma di un filmato palmare.

La precisione è stata misurata utilizzando molecole immobili in cellule fisse o molecole legate in cellule vive, ed è risultata essere di 40 nanometri in accordo con la previsione teorica. Successivamente, la soglia di localizzazione è stata impostata quando era troppo bassa. I picchi casuali nel rumore di fondo sono stati erroneamente selezionati come posizioni candidate, mentre se la soglia era troppo alta, alcuni punti sono stati persi.

Le localizzazioni risultanti di Paul One hanno occupato l'area centrale della cellula, ricapitolando ampiamente l'organizzazione spaziale del nucleoide di e coli. La maggior parte delle tracce di Paolo uno nelle cellule non danneggiate mostrano diffusione. Una cellula tipica contiene diverse centinaia di tracce di Paul one coerenti con il numero di copie di circa 400 molecole di Paul one per cellula di e coli.

Diversi tipi di movimento molecolare possono essere identificati calcolando i valori di MSD su un intervallo di tempi di ritardo: il movimento diretto fornisce una curva parabolica. Il moto browniano è caratterizzato da una linea retta. Una curva di diffusione confinata raggiunge un plateau e un offset della curva MSD per le particelle immobili rappresenta l'incertezza di localizzazione.

La curva MSD risultante per Paul 1 è aumentata linearmente per brevi tempi di ritardo indicativi del moto browniano e si è saturata a tempi di ritardo più lunghi a causa del confinamento cellulare. Utilizzando questi metodi, l'attività di riparazione del DNA di Paul, è stata misurata in risposta al danno esogeno da alchilazione del DNA in cellule non danneggiate. L'istogramma del coefficiente di diffusione di Paul 1 mostra una popolazione dominante di molecole diffuse.

Le poche molecole legate potrebbero essere coinvolte nella replicazione del DNA e nella riparazione del danno endogeno al DNA in presenza di un danno continuo di MMS di 100 millimolari. La frequenza delle tracce con coefficienti di diffusione prossimi allo zero aumenta in modo significativo. Ciò supporta il modello secondo cui più molecole di Paul One devono essere coinvolte nella riparazione del DNA con mutageno presente Seguendo questa procedura.

Altri metodi di analisi dei dati come la localizzazione e il clustering possono essere eseguiti per quantificare la distribuzione spaziale delle proteine nella cellula e per studiare la presenza di complessi proteici più grandi coinvolti nella riparazione del DNA.