Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare direttamente e quantificare l'attività delle proteine leganti il DNA in cellule batteriche vive. Questo viene ottenuto visualizzando cellule che esprimono una proteina fluorescente attivata da luce, fusa a una proteina legante il DNA di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'acquisire un filmato di singole proteine che vengono attivate dalla luce mentre vengono osservate.

Successivamente, i dati vengono analizzati per determinare la localizzazione delle proteine e tracciare il movimento delle proteine all'interno di singole cellule. Gli eventi di legame al DNA sono identificati attraverso il cambiamento del coefficiente di diffusione delle singole proteine al contatto con i cromosomi. In definitiva, i risultati possono fornire una misura quantitativa delle interazioni proteina-DNA a livello di singola cellula, contando il numero di proteine legate e in diffusione per ogni cellula.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione del DNA, come i tassi di riparazione in vivo e la distribuzione spaziale dei siti di riparazione. Ora dimostreremo il metodo misurando l'attività di riparazione della DNA polimerasi uno in cellule vive di e coli. Preparare prima dei coprioggetti privi di particelle fluorescenti di fondo riscaldandoli in un forno a 500 gradi Celsius per un'ora. Bruciare una scorta di coprioggetti di spessore numero 1,5 e conservarli a temperatura ambiente in fogli di alluminio.

Possono essere conservati per settimane. Successivamente, concentrare un millilitro di E. coli in fase esponenziale iniziale del ceppo AB 1157 poly a PA m cherry in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare le cellule a 2.300 ×g per cinque minuti.

Rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet cellulare in 20 microlitri di mezzo residuo, quindi vortexare le cellule fino a completa solubilizzazione. Successivamente, preparare una soluzione al 1,5% di agarosio a bassa fluorescenza in acqua distillata. Mescolare 500 microlitri di agarosio fuso con 500 microlitri di mezzo minimo 2x mediante pipettaggio delicato su e giù per alcune volte, per esperimenti di danno del DNA utilizzando metil metanosolfonato o MMS, prendendo le opportune precauzioni.

Aggiungere 8,3 microlitri di MMS ai 500 microlitri di mezzo minimo prima di mescolarlo con gli aros prima che la miscela si raffreddi. Distribuirlo su un vetrino bruciato. Stenderlo in modo uniforme e centrato, senza formare bolle.

Appiattire il cuscinetto con un secondo vetrino da copertura bruciato. Dopo il raffreddamento, rimuovere il vetrino superiore dal cuscinetto e aggiungere un microlitro di sospensione cellulare concentrata. Immobilizzare le cellule coprendo il cuscinetto con un nuovo vetrino da copertura bruciato e premendo delicatissimamente verso il basso.

Le cellule devono essere sottoposte a imaging entro 45 minuti prima che si disidratino. Per estendere questo intervallo di tempo, la piastra può essere sigillata all'interno di una guarnizione di silicone per esperimenti di danno del DNA. Prima di eseguire l'imaging, incubare le cellule sulla piastra per 20 minuti.

In un contenitore umidificato a temperatura ambiente, il microscopio è dotato di un laser di fotoattivazione a 405 nanometri e di un laser di eccitazione a 561 nanometri. La sensibilità a singola molecola si ottiene eccitando solo i fluorocromi all'interno di una sezione sottile al di sopra della superficie del coprioggetto, mediante un'illuminazione fortemente inclinata; l'emissione fluorescente viene registrata su una telecamera CCD a moltiplicazione elettronica. Posizionare il campione sul portacampioni del microscopio e mettere a fuoco le cellule.

Sotto illuminazione in luce trasmessa, definire un'area di campo ritagliata per ridurre le dimensioni dei dati e aumentare la velocità di lettura della fotocamera. Proteggere il campione dalla luce ambientale e attivare il guadagno della fotocamera CCD a moltiplicazione elettronica per la rilevazione singola di fluoro quattro. Impostare la frequenza dei fotogrammi a 15,26 millisecondi per fotogramma.

Questo include il tempo di lettura della fotocamera di 0,26 millisecondi. I tempi di esposizione devono essere sufficientemente brevi per osservare punti fluorescenti nitidi con scarsa sfocatura dovuta al movimento. D'altra parte, le tracce devono essere campionate a intervalli di tempo sufficientemente lunghi per distinguere chiaramente le molecole legate da quelle in diffusione. Visualizzare ora i dati della fotocamera per verificare il segnale di fondo scuro.

Accendere il laser a 561 nanometri e verificare il segnale di fondo dell'eccitazione. Accendere il laser a 405 nanometri per l'attivazione fotoindotta delle proteine fuse Paul one PA mCherry e aumentare l'intensità finché non compaiono punti fluorescenti di singole molecole. Regolare ora l'angolo del fascio di eccitazione in modo da illuminare solo una sezione sottile del campione.

Chiudere la superficie del coprioggetto. Questo metodo si basa sul rilevamento e sulla localizzazione precisa di singole proteine fluorescenti, quindi un allineamento ottimale e una sensibilità elevata del microscopio saranno fondamentali per la qualità dei dati. A tal fine, focalizzare il fascio laser nel piano focale posteriore di un obiettivo 100x con apertura numerica 1,4.

Lo spostamento della lente di focalizzazione perpendicolarmente al fascio sposta il fuoco dal centro dell'obiettivo, facendo uscire il fascio dall'obiettivo con un angolo. Regolare il fascio in modo da massimizzare l'intensità della fluorescenza e minimizzare il fondo. Individuare un nuovo campo visivo di cellule in modalità microscopia a luce trasmessa e mettere a fuoco l'immagine.

Scattare una foto con la fotocamera per registrare i contorni delle cellule. Accendere il laser a 561 nanometri e bleacciare l'autofluorescenza cellulare e i punti di fondo sul coprivetrino. Attendere alcuni secondi.

Prima di iniziare l'acquisizione dei dati, avviare l'acquisizione di un filmato palm sotto eccitazione continua a 561 nanometri. Accendere il laser a 405 nanometri e aumentare gradualmente l'intensità nel corso del filmato fino a raggiungere un watt per centimetro quadrato. Evitare intensità superiori a 405 nanometri che causano autofluorescenza cellulare.

Prestare attenzione alla densità delle molecole fluorescenti. È importante mantenere bassi i tassi di attivazione in modo che le macchie fluorescenti siano chiaramente isolate in ogni fotogramma. Registrare circa 10.000 fotogrammi per filmato, il che, con un campo visivo ritagliato, richiede tipicamente fino a tre minuti e fino a un gigabyte di spazio su disco rigido.

Si noti che, una volta acquisito un campo visivo, i fluorofori pa m cherry vengono irreversibilmente sbiancati e non possono più essere osservati. Ancora una volta, la procedura seguente utilizza un software personalizzato in matlab. I singoli fluorofori appaiono come funzioni di diffusione del punto o psfs.

Nel filmato, i PSF vengono inizialmente identificati in un'immagine filtrata con filtro passa-banda mediante un kernel gaussiano con diametro di sette pixel; le posizioni candidate corrispondono ai PSF con intensità del pixel di picco pari a 4,5 volte la deviazione standard del fondo. Il pixel localmente più luminoso per ciascun PSF candidato funge da stima iniziale per l'adattamento di una funzione gaussiana ellittica. I parametri liberi del fit sono: posizione X, posizione Y, larghezza X, larghezza Y, angolo di rotazione, ampiezza e offset del fondo.

La maschera gaussiana ellittica tiene conto del movimento delle molecole durante il tempo di esposizione, che sfoca e deforma il grafico della PSF. Le localizzazioni XY risultanti da tutti i fotogrammi del filmato palm vengono sovrapposte all'immagine di microscopia a luce trasmessa dello stesso campo visivo; le localizzazioni di Paul one PAM Cherry dovrebbero apparire all'interno dell'area centrale delle cellule di e coli. Il tracciamento automatizzato misura il movimento delle proteine, ma la scelta corretta della finestra di tracciamento è fondamentale.

Per prima cosa, eseguire l'algoritmo di tracciamento per un intervallo di parametri della finestra di tracciamento. Riportare in un grafico il numero di tracce misurate per cellula in funzione della finestra di tracciamento, al fine di identificare la finestra di tracciamento più piccola possibile che non suddivida le tracce; visualizzare le tracce risultanti sull'immagine di microscopia in luce trasmessa dello stesso campo di osservazione. Per visualizzare la distribuzione spaziale del movimento delle molecole all'interno delle cellule, le tracce devono mostrare una diffusione confinata all'interno di singole cellule; se una frazione di tracce sembra attraversare da una cellula all'altra, ciò suggerisce che molecole distinte sono state erroneamente collegate perché la finestra di tracciamento è stata scelta troppo ampia e/o il tasso di fotoattivazione era troppo elevato.

Tracciare la distribuzione cumulativa delle lunghezze degli spostamenti tra localizzazioni consecutive. La curva aumenta e si satura in modo regolare per finestre di tracciamento sufficientemente ampie, ma mostra un bordo di cutoff se la finestra è stata scelta troppo piccola. Una volta selezionata una finestra di tracciamento adeguata, è possibile analizzare le caratteristiche di diffusione di Paul one.

Calcola lo spostamento quadratico medio o MSD tra localizzazioni consecutive per ogni traccia con un totale di n passaggi; utilizza solo tracce con almeno cinque localizzazioni per ridurre l'incertezza statistica dell'MSD. Successivamente, calcola il coefficiente di diffusione apparente per ogni traccia a partire dall'MSD. Il secondo termine corregge l'errore di localizzazione stimato.

Questi sono i valori per il secondo termine. In questo esempio, tracciare ora un istogramma dei valori del coefficiente di diffusione misurati per tutte le tracce nel campo visivo per la pol uno in cellule non danneggiate e per la pol uno in cellule sottoposte a trattamento con danno al DNA mediante MMS; le barre rosse identificano la popolazione di singole molecole di pol uno che risultano legate al cromosoma e si diffondono a meno di 0,15 micrometri quadrati al secondo. Al contrario, le molecole in libera diffusione si muovono intorno a 0,9 micrometri quadrati al secondo.

Dopo che sono state identificate le molecole di Paul one legate. Le posizioni dei siti di legame possono essere visualizzate in cellule non danneggiate e in cellule con danni da mm MS. La frazione di tracce legate rispetto al numero totale di tracce osservate fornisce una misura quantitativa diretta dell'attività di riparazione del DNA da parte della pol.

Un'attivazione fotoindotta in vivo della proteina di fusione Pol one PA m cherry è stata eseguita in cellule vive di E. coli. L'attivazione fotoindotta poteva essere limitata a un singolo fluoroforo PA m cherry in una cellula; tassi di attivazione fotoindotta più elevati hanno rivelato un numero maggiore di molecole fluorescenti. L'analisi della localizzazione è stata effettuata per ogni fotogramma di un filmato palm.

La precisione è stata misurata utilizzando molecole immobili in cellule fissate o molecole legate in cellule vive, risultando pari a 40 nanometri, in accordo con la previsione teorica. Successivamente, la soglia di localizzazione è stata impostata quando era troppo bassa: picchi casuali nel rumore di fondo venivano erroneamente selezionati come posizioni candidate, mentre se la soglia era troppo alta, alcune macchie venivano perse.

Le localizzazioni risultanti di Paul one occupavano l'area centrale della cellula, riproducendo in modo generale l'organizzazione spaziale del nucleoide di e coli. La maggior parte delle tracce di Paul one in cellule non danneggiate mostra diffusione. Una cellula tipica contiene alcune centinaia di tracce di Paul one, coerenti con un numero di copie di circa 400 molecole di Paul one per cellula di e coli.

È possibile identificare diversi tipi di moto molecolare calcolando i valori MSD su un intervallo di tempi di ritardo: il moto diretto produce una curva parabolica. Il moto browniano è caratterizzato da una linea retta. Una curva di diffusione confinata raggiunge un plateau e un offset della curva MSD per particelle immobili rappresenta l'incertezza di localizzazione.

La curva MSD risultante per Paul one è aumentata linearmente per brevi tempi di ritardo, indicativa di un moto browniano, e si è saturata per tempi di ritardo più lunghi a causa del confinamento cellulare. Utilizzando questi metodi, l'attività di riparazione del DNA di Paul one è stata misurata in risposta a danni da alchilazione esogena del DNA in cellule non danneggiate. L'istogramma del coefficiente di diffusione di Paul one mostra una popolazione dominante di molecole in diffusione.

I pochi molecole legate potrebbero essere coinvolti nella replicazione del DNA e nella riparazione dei danni endogeni al DNA sotto un danno continuo da MMS 100 millimolari. La frequenza di tracce con coefficienti di diffusione prossimi allo zero aumenta in modo significativo. Questo supporta il modello secondo cui un numero maggiore di molecole di Paul uno deve essere coinvolto nella riparazione del DNA in presenza del mutageno seguendo questa procedura.

Possono essere eseguiti altri metodi di analisi dei dati, come la localizzazione e il clustering, al fine di quantificare la distribuzione spaziale delle proteine nella cellula e di indagare la presenza di complessi proteici più grandi coinvolti nella riparazione del DNA.