Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

Le proteine operano in uno spazio di stati complesso e gran parte di esso è nascosta. Utilizziamo l'imaging a singola molecola per rivelare questi stati. Quando si tracciano proteine a membrana singola in uno strato lipidico, le principali sfide sono la preparazione del campione, lo sbiancamento fotoelettrico e la risoluzione temporale.

Per cominciare, rimuovi le soluzioni di stelo lipidico dal congelatore e lasciale raggiungere la temperatura ambiente. Estrai una fiaschetta pulita da 10 millilitri dal forno e lasciala raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere 900 microlitri di cloroformio di grado spettroscopico e 100 microlitri di metanolo di grado spettroscopico alla fiaschetta a fondo arrotondato raffreddata.

Poi aggiungi le quantità appropriate di ogni lipide alla fiaschetta e fai roteare per mescolare bene. Ora posiziona un connettore di distillazione a vuoto sopra la fiaschetta inferiore rotonda e collegalo alla linea di asciugatura dell'azoto. Poi accendi il gas azotato e regola la pressione finché il flusso non si sente appena sul dorso della mano.

Pipetta un millilitro di tampone ogni cinque micromoli di lipidi totali nella fiaschetta a fondo rotondo. Posiziona un tappo di vetro sulla fiaschetta e sigillala con pellicola di paraffina. Posiziona la fiaschetta e una pinza su un supporto ad anello e immergi il fondo in un bagno sonico a 60 gradi Celsius.

Confermare che la soluzione diventi opaca e che non rimangono lipidi attaccati alla parete interna della fiaschetta. Dopo l'incubazione di un'ora, accendi il sonicater e imposta l'ampiezza al livello più alto. Sposta la fiaschetta all'interno della vasca per individuare il punto con la maggiore agitazione dove la soluzione si scontra e spruzza visibilmente all'interno della fiaschetta.

Sonica la soluzione per 30 minuti. Osservando la transizione dall'opacità a quella trasparente e leggermente opalescente. Rimuovi la soluzione lipidica dalla fiaschetta e trasferiscila in un tubo microcentrifuga.

Centrifuga il tubo a 100.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere e trasferire il surnante in un nuovo tubo centrifuga. Inserire il rivestimento di quarzo da 25 millimetri in un becher e aggiungere volumi uguali di acqua nanopura, perossido di idrogeno al 30% e acido nitrico concentrato.

Riscalda il coperchio scivola nella soluzione preparata per 30 minuti fino a quando inizia la bollicina. Controlla la soluzione ogni 10 minuti e fai girare delicatamente per evitare che il coperchio si attacchi tra loro. Osserva come la copertura scivola e si apre durante il vortico.

Una volta separati, riduci gradualmente la velocità di rotazione per mantenere la separazione e permettere alla soluzione bollente di ricoprire il coperchio di scivolare uniformemente. Poi risciacqua accuratamente il coperchio con acqua purificata mentre si fa girare delicatamente per rimuovere tutti i residui chimici. In alternativa, pulire le spaspi di copertura in quarzo usando n-esano, seguito da metanolo, passando con tessuto per la lente per ogni solvente.

Inserire le scure di copertura all'interno di un detergente UV all'ozono con la superficie da trattare rivolta verso la lampada. Lascia che l'ossigeno fluisca nella camera a cinque libbre per pollice quadrato per cinque minuti. Poi spegni il flusso di ossigeno.

Ora accendi le luci ultraviolette per 15 minuti, poi lascia riposare le scivolate del coperchio per almeno 10 minuti per permettere all'ozono di dissiparsi. Metti un copricapo appena pulito in un portacampioni da 25 millimetri. Utilizzando un tubo SM di un quarto di pollice per un unico obiettivo, taglia una guarnizione a doppio strato di otto millimetri di diametro e posizionala al centro del portacampioni.

Applica una goccia da 50 microlitri delle piccole vescicole Unilamelari al centro della guarnizione da otto millimetri. Dopo aver sigillato la camera, incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, usa una pipetta per risciacquare la soluzione.

Aggiungi 50 microlitri di nuovo buffer al bistrato e ripeti questo processo un totale di 10 volte. Dopo il risciacquo finale, rimuovere il tampone dal portacampioni. Aggiungi un'aliquota di 50 microlitri della proteina desiderata nel detersivo, assicurandoti che la concentrazione sia pari o inferiore alla concentrazione critica di micella.

Incubare il campione a 37 gradi Celsius per almeno un'ora per permettere l'incorporazione delle proteine, risciacquare il campione con un tampone per rimuovere qualsiasi proteina e detersivo non incorporati. Imposta la velocità di spostamento verticale dei pixel a circa 600 nanosecondi e aumenta la tensione di clock verticale usando la modalità overclock. Poi configura la lettura orizzontale dei pixel alla sua velocità massima.

Regola il guadagno del preamplificatore a due. Imposta l'uscita dell'amplificatore per la moltiplicazione degli elettroni e imposta il guadagno del moltiplicatore elettronico al livello massimo. Poi imposta il tempo di esposizione a 25 milisecondi.

Conferma che il frame rate effettivo superi leggermente il tempo di esposizione. Ora regola la potenza del laser finché il segnale non si distingue chiaramente dal rumore di fondo. Raccogli abbastanza dati di imaging per ottenere almeno 1000 tracce per campione.

Per l'analisi di tracciamento, ritaglia tutti i set di dati a una dimensione costante ed esegui la correzione dello sfondo usando Image J.In Fiji, trascina e rilasci il file TIFF del film o impila nell'interfaccia. Per inserire i dettagli della calibrazione dei pixel, vai nella scheda analizza, seleziona imposta scala e applica la calibrazione pixel alla distanza specifica dello strumento. Poi salva una copia del dataset per preservare l'originale e tracciare eventuali modifiche apportate.

Sottrai lo sfondo da una regione selezionata di interesse e applicalo alla copia salvata dei dati originali. Vai nella scheda del processo e scegli sottrai sfondo. Nella scheda plugin, seleziona tracciamento, seguito da trackmate per aprire la finestra di dialogo trackmate per l'analisi del tracciamento.

Il grado di marcatura per quattro tetrameri AQP è stato calcolato a 4,12 utilizzando spettrometria UV visibile e l'analisi della distribuzione di Poisson ha indicato che il 98% dei tetrameri trasportava almeno una molecola di colorante fluorescente. L'istogramma mostra una distribuzione ampia delle dimensioni dei passi coerente con la diffusione di array ortogonali di particelle di dimensioni diverse, e il coefficiente medio di diffusione calcolato era di 0,0143 micrometri quadrati al secondo. In questo video, abbiamo identificato stati chiave importanti per la regolazione dell'acquaporina quattro e le relative forze termodinamiche.

Questo protocollo elimina le congetture nella creazione di membrane biomimetiche con proteine transmembrana purificate, adatte al tracciamento di singole molecole in time-lapse. Le macchine proteiche operano nei punti di flessione e il tracciamento di una singola proteina a time-lapse consente l'osservazione diretta di vie stocastiche, ramificazioni e vicoli ciechi.