Name: Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri il tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza. Questo metodo rivela stati nascosti delle proteine di membrana e fornisce informazioni sulla dinamica cellulare.

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<table><tbody><tr><td>Piastra d'onda 1/4</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>Assicurati di abbinare il laser</td></tr><tr><td>Obiettivo 100X Oil</td><td>Olympus</td><td>12-563-659</td><td>1.45 N/A apocromatico</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Lipidi polari Avanti</td><td>850457</td><td>POPC Fosfolipidi</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 PE</td><td>Lipidi polari Avanti</td><td>880210</td><td>Sale di ammonio</td></tr><tr><td>Obiettivo 300mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Laser He:Ne a 633 nm</td><td>Melles Griot</td><td>05-LHP-927</td><td>Può essere cambiato in altre fonti e in altre lunghezze d'onda</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda a 633nm</td><td>Chroma Tech</td><td>633/10X</td><td>Corrispondenza al laser utilizzato</td></tr><tr><td>Filtro passa-lungo da 655nm</td><td>Chroma Tech</td><td>ET655lp</td><td>Modifica per adattarsi alle lunghezze d'onda del colorante/laser</td></tr><tr><td>Andor Solis I</td><td>Andor&nbsp;</td><td>Andor Solis I</td><td>Software per la cattura delle immagini</td></tr><tr><td>ATTO 655&nbsp;</td><td>ATTO-TEC</td><td>655 d.C.</td><td>Modifica NHS-Ester, qualsiasi colorante con una modifica adatta al lavoro su singole molecole può essere utilizzato. ATTO è consigliato, ma si può usare Cy5/7</td></tr><tr><td>Bio-perle SM-2 Resina</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155-50MG</td><td>dal fegato bovino, soltion acquoso, &ge; 30000 unità/mg</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C547-1</td><td>HPLC o grado spettroscopico</td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Copertine</td><td>Ottica ESCO</td><td>R525000</td><td>Quarzo da 25mm</td></tr><tr><td>Divisore di fascio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>Modifica per adattarsi alle lunghezze d'onda del colorante/laser</td></tr><tr><td>Fotocamera EMCCD</td><td>Andor&nbsp;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes 15mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Tubi di coltura cellulare Cellestar</td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133-50KU</td><td>da Aspergillus niger, typer VII, &ge; 100000 unità/g solido (senza ossigeno aggiunto)</td></tr><tr><td>Pistola termica</td><td>Trasporto merci portuale</td><td>56434</td><td>Utilizzata per il riscaldamento del parafilm, generalmente si poteva usare qualsiasi pistola termica</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioreagenti Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Olio a immersione a bassa autofluorescenza</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>Methonal</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A452-1</td><td>HPLC o grado spettroscopico</td></tr><tr><td>Tubo microcentrifuga</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Pipetter</td><td>Ependorf</td><td></td><td>Varie; 1000 & micro; L, 100 & micro; L e 10 & micro; L sono suggeriti</td></tr><tr><td>& Oslash; Tubi per obiettivi da 1,5"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>La filettatura esterna viene ridotta per la preparazione del campione</td></tr><tr><td>Tabella ottica</td><td>Newport</td><td>Dipendenza RPR</td><td>La dimensione della tabula dipende dallo spazio disponibile</td></tr><tr><td>Tessuti ottici</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>Pulizia di vari componenti</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7669</td><td>Verifica che non sia nulla di fluorescente durante il processo</td></tr><tr><td>Attuatore piezoretico</td><td>Newport</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>Isolatori pneumatici di vibrazione</td><td>Newport</td><td>Serie I-2000</td><td>usata per stabilizzare la tabella ottica per eventuali irregolarità &nbsp;</td></tr><tr><td>Bagno refrigerato</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore dell'otturatore</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>Collegato al software di imaging</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Steritop</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Driver e Controller Switchbox&nbsp;</td><td>Newport</td><td>PZC200</td><td>Controller di stage</td></tr><tr><td>Filtro a siringa</td><td>J.T. Baker</td><td>SF01-98</td><td>PES 25mm 0.2 & micro; M</td></tr><tr><td>Elemento TEC</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>Usata per collegare la pompa di calore Peltirer al portacampioni e al collare obiettivo</td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Ingegneria Meerstetter</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>Rivelatore di temperatura</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>Termistore</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Dialitico a tubo</td><td>G Bioscienze</td><td>786-611</td><td>4K MWCO</td></tr><tr><td>Detergente UV per ozono</td><td>Novascan</td><td>PSDP_UV</td><td>Pro Series - Digitale & nbsp;</td></tr><tr><td>Zoom Optics&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

Direct observation is a fundamental method for scientific discovery and understanding. Time-lapse single-molecule fluorescence imaging allows the ...

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JoVE Journal

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Biochimica

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

La distribuzione spaziale e la dinamica temporale delle proteine e dei lipidi della membrana plasmatica è un argomento caldo in biologia. Qui questo problema è affrontato da un'analisi di fluttuazione dell'immagine spazio-temporale che fornisce concettualmente le stesse quantità fisiche di tracciamento di singole particelle, ma utilizza piccole etichette molecolari e configurazioni di microscopia standard.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

Vi presentiamo un metodo di preparazione mica supportato doppi strati lipidici per microscopia ad alta risoluzione. Mica è trasparente e piatto su scala atomica, ma raramente usata nell'imaging a causa della difficoltà di manipolazione; nostra preparazione comporta anche deposizione del foglio di mica, e riduce il materiale utilizzato nella preparazione bistrato.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Qui sono mostrati la preparazione di doppi strati lipidici planari supportati da vetro funzionalizzati con proteine, la determinazione della mobilità proteica all'interno e la misurazione delle densità proteiche. Viene delineata una tabella di marcia per la costruzione di un microscopio a riflessione interna totale a rumore ridotto, che consente di visualizzare fluorocromi residenti a doppio strato con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

La microscopia di localizzazione 3D a molecola singola viene utilizzata per sondare le posizioni spaziali e le traiettorie di movimento delle proteine fluorescenti etichettate nelle cellule batteriche viventi. Il protocollo sperimentale e di analisi dei dati descritto nel presente documento determina i comportamenti diffusivi prevalenti delle proteine citosoliche basate su traiettorie a singola molecola raggruppate.

Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

Questo protocollo descrive un approccio basato sull'elaborazione delle immagini e sul tracciamento di singole particelle basato su iSCAT che consente l'indagine simultanea della massa molecolare e del comportamento diffusivo delle macromolecole che interagiscono con le membrane lipidiche. Le istruzioni dettagliate per la preparazione del campione, la conversione da massa a contrasto, l'acquisizione di filmati e la post-elaborazione sono fornite insieme alle indicazioni per prevenire potenziali...

Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia TIRF per tracciare i singoli canali ionici e determinare la loro attività nelle membrane lipidiche supportate, definendo così l'interazione tra il movimento laterale della membrana e la funzione del canale. Descrive come preparare le membrane, registrare i dati e analizzare i risultati.

Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Scopri il tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza. Questo metodo rivela stati nascosti delle proteine di membrana e fornisce informazioni sulla dinamica cellulare.

Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

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