Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

L'obiettivo generale di questo protocollo di imaging è quello di descrivere la quantificazione del pH intracellulare, utilizzando un indicatore di pH geneticamente codificato e dimostrare come questo metodo possa essere utilizzato per valutare il trasporto basolaterale di protoni in un modello di struttura renale di insetto, il tubulo malpighiano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del trasporto cellulare, come ad esempio il modo in cui specifiche proteine trasportatrici contribuiscono al movimento epiteliale del protone nella regolazione intracellulare del pH. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il trasporto cellulare può essere valutato rapidamente e facilmente attraverso più zone funzionalmente distinte di epitelico intatto.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione del pH e sull'epitelio degli insetti, può essere applicato anche ad altri sistemi come il nefrone dei mammiferi e le cellule epiteliali in coltura. Per iniziare questa procedura, posizionare due serie di morsetti per le mani di aiuto per saldatura sul tavolino del microscopio di imaging, con un morsetto su ciascun lato. Successivamente, inserire i rispettivi capillari in vetro curvato e la linea di afflusso e la linea di deflusso collegata al vuoto.

Quindi, montarli nelle mani che aiutano e allinearli con il tavolino di imaging del microscopio. Stendere il grasso sottovuoto sul nastro del soffitto e premere il divisore adesivo sul nastro per ricoprire il fondo di grasso. Staccare il divisore del pozzetto di perfusione adesiva e posizionarlo con il grasso rivolto verso il basso, sopra un vetrino rivestito di poli-lisina.

Successivamente, rimuovere il divisore del pozzetto di perfusione per lasciare i singoli pozzetti specifici tracciati nel grasso idrofobo. Successivamente, posizionare 200 microlitri di soluzione salina tampone IPBS o fosfato di insetto a temperatura ambiente nell'unto e circondare bene sul vetrino rivestito di poli-l-lisina. Quindi, posizionare il vetrino sotto lo steroscopio, versare il terreno di Schneider ghiacciato nel piatto di dissezione e trasferirvi una singola mosca femmina anestetizzata.

Tieni la mosca per il torace con una serie di pinze e usa l'altra per afferrare delicatamente l'addome posteriore. Aprire l'estremità posteriore della mosca con movimenti brevi e deliberati. Una volta che la protezione posteriore è visibile, afferrare l'estremità distale e liberare l'intestino e le ante dalle tracheali sottostanti, allontanando la protezione posteriore dal corpo attraverso brevi strattoni ripetitivi.

Quindi, pizzicare gli anteri anteriori dell'uretere con una pinza fine, una volta che la seconda serie di ante è libera dall'addome. Raccogliere gli anteri anteriori liberi con l'asta di vetro del palo, facendo scorrere l'asta sotto l'uretere, in modo che i tubuli cadano su entrambi i lati. Successivamente, solleva gli ante verso l'alto, fuori dalla soluzione, dopodiché, gira l'asta di vetro in modo che gli ante e l'uretere aderiscano alla parte inferiore dell'asta.

Abbassare l'uretere verso il basso sul vetrino, quindi fissare l'uretere e sigillare le estremità distali degli ante premendo ulteriormente l'uretere sul vetrino. Usa l'estremità sottile dell'asta di vetro per spazzare delicatamente ogni tubulo sulla superficie del vetrino. Sfiorare l'asta contro il vetrino per evitare di schiacciare il tubulo e far scorrere l'asta sopra la parte superiore del tubulo, spostandosi da distale a prossimale, per attaccare l'intera lunghezza di ciascun tubulo alla superficie del vetrino rivestito di polil-lisina.

Il successo di questa tecnica dipende interamente dall'accurata identificazione e dall'attenta gestione dei tubuli malpighiani anteriori. I tubuli danneggiati produrranno risultati incoerenti. Quindi, riposizionare il divisore adesivo del pozzetto di profusione sul vetrino per formare un piccolo liquido riempito bene sopra il tubulo montato.

Successivamente, posizionare il campione sul tavolino del microscopio. Posizionare i capillari di afflusso e di deflusso rispettivamente sull'apertura di ingresso e di uscita del pozzetto di profusione. In questa procedura, accendere il microscopio, la sorgente luminosa e il sistema di imaging, quindi aprire il software di imaging.

Guardare attraverso gli oculari e regolare manualmente la messa a fuoco fino a quando il lume degli ante è chiaramente visibile sotto la luce trasmessa. Quindi, fare clic sulla scheda di acquisizione e selezionare, 2x2 nel menu a discesa di dimmerazione, nella sezione del carico di acquisizione. Inserire un filtro a densità neutra al 5% nel percorso della luce, per ridurre la luce dell'illuminazione e minimizzare il fotosbiancamento.

Fare clic sul canale GFP nel menu dei canali, quindi fare clic in diretta per osservare il segnale fluorescente tramite la telecamera. Successivamente, regola il cursore del tempo per impostare il tempo di esposizione, in modo tale che i valori dei pixel più luminosi nell'istogramma dell'intensità siano circa il 40% del valore massimo. Quindi fare clic su stop per interrompere l'illuminazione.

Ripetere le procedure nel canale RFP e confermare la presenza del segmento iniziale dilatato dell'ante anteriore e l'assenza di aggregati di ciliegia m citosolido, che indica danno tissutale o sovraespressione. Successivamente, abilitare un protocollo di imaging timelapse facendo clic sulla casella di controllo delle serie temporali. Regolare la durata nel menu a discesa, nella sezione delle serie temporali su 10 minuti e il cursore dell'intervallo su zero, per impostare il tempo di acquisizione totale con la massima acquisizione dell'immagine.

Quindi, seleziona entrambe le caselle GFP e RFP nella sezione del canale. Aprire la linea IPBS del sistema a profusione attivando l'apposito controller della valvola e avviare il protocollo di imaging facendo clic, avviare l'esperimento. Dopo un minuto, passare alla soluzione di cloruro di ammonio per 20 secondi, aprendo l'apposita valvola e chiudendo la linea IPBS.

Quindi, tornare all'IPBS chiudendo la linea del cloruro di ammonio e riaprendo la valvola IPBS. Per eseguire una calibrazione a due punti, rimuovere il divisore del pozzetto staccandolo dal vetrino sottostante e rimuovere i capillari di profusione in pinze dal pozzetto di imaging. Successivamente, applicare 200 microlitri di tampone IPBS di calibrazione a pH 7,4.

Quindi, rimuovere la soluzione dal pozzetto di imaging e sostituirla con altri 200 microlitri di soluzione di calibrazione. Ripetere questo processo quattro volte per garantire la sostituzione completa della soluzione. Quindi, incubare la soluzione di preparazione e calibrazione per 30 minuti prima dell'imaging.

Ripetere il protocollo di imaging utilizzando gli stessi parametri determinati in precedenza, con la modifica di un solo minuto di acquisizione dell'immagine. Quindi aggiungere 200 microlitri di tampone IPBS di calibrazione a pH nove. Rimuovere la soluzione dal pozzetto di imaging e sostituirla con altri 200 microlitri di soluzione di calibrazione.

Successivamente, incubare il preparato nella seconda soluzione di calibrazione per 10 minuti prima dell'imaging e ripetere il protocollo di imaging. Successivamente, esamina l'immagine acquisita impilata nel software di analisi delle immagini per confermare che nessun pixel in entrambi i canali sia saturo, facendo clic su MeanROI e che nessun valore riportato nell'istogramma di intensità abbia raggiunto il valore massimo rilevabile, mentre scorri la pila di immagini con il cursore del fotogramma. Successivamente, analizzare la pila di immagini tracciando l'intensità della fluorescenza e il rapporto di fluorescenza in funzione del tempo, qui vediamo la risposta fluorescente prevista all'impulso di cloruro di ammonio nei canali sensibili al pH e insensibili al pH dell'indicatore.

Il rapporto di questi segnali rivela la transitorietà del pH intracellulare. Per eseguire questa analisi, fare clic su meanROI e selezionare lo strumento in formato libero. Tenere premuto il tasto sinistro del mouse per tracciare una MT di 50 micrometri e fare clic con il tasto destro del mouse per terminare il disegno del ROI.

Quindi, ripeti l'operazione in un'area adiacente alla MT, per definire il ROI dello sfondo. Quindi, fai clic su intensità media in Misurazioni, crea una tabella di valori di intensità facendo clic su esporta, tabella dati, crea. Fare clic sull'icona della rotellina dell'orologio di configurazione e deselezionare tutti i parametri, ad eccezione del tempo e dell'intensità media.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda per la tabella dati appena creata, selezionare Salva con nome ed esportare i dati come file csv. Qui è mostrata un'immagine ad ampio campo, una fluorescenza super-ellittica al fluoro nelle cellule principali dell'ante anteriore e nelle cellule stellate dell'ante anteriore. Si noti che le cellule stellate sono a forma di barra nel segmento iniziale, variabili nel segmento di transizione e mostrano proiezioni cellulari distinte nel segmento principale.

Questo grafico mostra le variazioni di pH intercellulare calibrate in risposta a un impulso di 20 secondi, 40 millimolari di cloruro di ammonio nelle regioni di interesse. Le curve tratteggiate denotano singoli adattamenti esponenziali applicati alla fase di recupero dell'acido, dopo il ritiro del cloruro di ammonio. Da cui derivano i valori delle costanti decaduti.

Questo grafico mostra il tasso di estrusione dell'acido tracciato in funzione del pH intracellulare e questo grafico mostra il flusso acido tracciato in funzione del pH intracellulare, derivato dagli adattamenti esponenziali della figura precedente. Una volta padroneggiata, l'estrazione del tubulo malpighiano può essere eseguita entro 10 minuti, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il successo dipende interamente dalla qualità della dissezione e dalla calibrazione accurata dell'indicatore di pH.

Questa preparazione può essere combinata con altri biosensori geneticamente codificati, come gli indicatori fluorescenti di calcio e alogenuri, per studiare il movimento dei soluti e la segnalazione intracellulare nelle cellule epiteliali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare tubuli sani di drosophila malpighian, visualizzare un indicatore di pH geneticamente codificato e quantificare il movimento del protone nelle cellule epiteliali. Non dimenticare che lavorare con il nitroizene può essere pericoloso e danneggiare i preparati e, pertanto, è necessario prendere precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura, per garantire che non contamini le apparecchiature che devono essere riutilizzate.