Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare i cambiamenti nella concentrazione di calcio mitocondriale nelle cellule vive. Ciò si ottiene sezionando prima le cellule con il rapporto proteico indicatore di calcio metrico peram, che è mirato alla matrice mitocondriale, uno o due giorni dopo la trasfezione. Il microscopio a fluorescenza e il software sono configurati per l'imaging di cellule vive.

Le immagini delle cellule che esprimono il peram vengono quindi acquisite con l'aggiunta di un agonista mobilizzante del calcio. La fase finale della procedura è l'analisi quantitativa delle immagini acquisite. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio mitocondriale attraverso la microscopia a fluorescenza di cellule vive che esprimono una proteina indicatore di calcio metrica.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione dei livelli di calcio utilizzando indicatori sintetici di calcio, è che il peram metrico è geneticamente codificato e quindi può essere mirato ai mitocondri o a qualsiasi altro organo di interesse. Ciao, sono il Dr.Ascar, un postdoc nel laboratorio del Dr.Benning, e oggi dimostrerò la procedura Per iniziare le cellule helo della piastra di protocollo la sera prima, trasfezione su vetrini di vetro sterili posizionati in una piastra di coltura standard a sei pozzetti a una densità che sarà di circa il 70% fluente per la trasfezione il giorno successivo. Il giorno successivo preparare i complessi DNA Lipectomy 2000 secondo le istruzioni del produttore con quattro microgrammi di vettore di espressione mitocondriale metrico peram e 10 microlitri di lipectomia 2000 diluiti in 0,5 millilitri di optimum per ogni pozzetto da trasfettare.

Quindi, sostituire il terreno di coltura D-M-E-M-F-B-S HELOC in ciascun pozzetto con 1,5 millilitri dello stesso terreno senza antibiotici. Aggiungere la soluzione di LIPECTOMIA alla soluzione di DNA e mescolare delicatamente dopo che i complessi si sono formati. Aggiungere la soluzione di lipectomia del DNA goccia a goccia in ciascun pozzetto da trasfettare, mescolata facendo oscillare delicatamente la piastra e incubare per quattro ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica dopo l'incubazione.

Sostituire il terreno con D-M-E-M-F-B-S contenente antibiotici. Lasciare che le cellule esprimano il peram metrico per uno o due giorni prima di eseguire l'imaging con il forcipe. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto con cellule HELOC in una camera di imaging appropriata con soluzione di imaging.

Montare la camera di imaging in un tavolino per microscopio invertito. Quindi, utilizzare un obiettivo a immersione in olio 40x o superiore e una lunghezza d'onda di 380 nanometri. Per trovare un'area di interesse contenente una o più celle che esprimono un rapporto metrico, peram 380 nanometri viene utilizzato qui per identificare le celle come rapporto metrico.

Peram è meno resistente al fotosbiancamento a questa lunghezza d'onda. Una volta identificata un'area di interesse, impostare il software per la doppia eccitazione a 495 e 380 nanometri. Successivamente, acquisisci le immagini in sequenza eccitando alternativamente a 495 e 380 nanometri.

Acquisire immagini dei livelli basali di calcio per almeno 30 secondi prima dell'applicazione dell'agonista. Quindi applicare l'agonista mobilizzante del calcio tramite un apparato a profusione, notando che il tempo di aggiunta per ciascun agonista, i tempi di esposizione e gli intervalli di acquisizione devono essere ottimizzati per prevenire il fotosbiancamento pur consentendo una risoluzione temporale sufficiente. Una volta completato l'esperimento, le immagini possono essere analizzate offline.

Per iniziare l'analisi, selezionare una regione di interesse all'interno di un'area vuota del campo per sottrarre la fluorescenza di fondo, se necessario. Quindi, esporta le misurazioni del rapporto 4 95 3 80 dalla regione di interesse in Excel o in un software grafico simile. Questo pannello di immagini mostra la localizzazione subcellulare del rapporto metrico peram e mitocondri.

A sinistra c'è un'immagine di cellule vive di cellule helo che esprimono il rapporto metrico peram. Al centro c'è la colorazione fluorescente dei mitocondri e il colorante selettivo MIT tracker rosso CMX Ross. E infine a destra, l'immagine unita mostrata qui è una serie di immagini a pseudocolori 4 95, 3 80 nanometri di quattro cellule helo che esprimono il rapporto metrico peram nei mitocondri trattati con 10 micromolari A TP, e la quantificazione dei cambiamenti nei livelli di calcio mitocondriale di quelle quattro cellule precedenti è mostrata qui in questa immagine di una cellula hela che esprime il rapporto metrico peram nei mitocondri.

L'eterogeneità della risposta del calcio nei singoli mitocondri e la significativa frammentazione dei mitocondri sono evidenti dopo 60 minuti di trattamento con sporina di stor 0,5 micromolari. Alcuni mitocondri hanno aumenti oscillatori del calcio mostrati con la freccia bianca, mentre altri non mostrano cambiamenti significativi nel livello di calcio mostrati con una freccia gialla. Questo grafico rivela la variazione dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula dell'elicottero dopo l'induzione dell'apoptosi per 120 minuti con 0,5 sporina micromolare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i cambiamenti dinamici nei livelli di calcio mitocondriale in risposta a vari tli utilizzando la proteina R geometrica medicata con calcio peram, che è selettivamente mirata alla matrice mitocondriale.