Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato
1 aprile 2011
Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.
L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare i cambiamenti nella concentrazione di calcio mitocondriale nelle cellule vive. Ciò si ottiene sezionando prima le cellule con il rapporto proteico indicatore di calcio metrico peram, che è mirato alla matrice mitocondriale, uno o due giorni dopo la trasfezione. Il microscopio a fluorescenza e il software sono configurati per l'imaging di cellule vive.
Le immagini delle cellule che esprimono il peram vengono quindi acquisite con l'aggiunta di un agonista mobilizzante del calcio. La fase finale della procedura è l'analisi quantitativa delle immagini acquisite. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio mitocondriale attraverso la microscopia a fluorescenza di cellule vive che esprimono una proteina indicatore di calcio metrica.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione dei livelli di calcio utilizzando indicatori sintetici di calcio, è che il peram metrico è geneticamente codificato e quindi può essere mirato ai mitocondri o a qualsiasi altro organo di interesse. Ciao, sono il Dr.Ascar, un postdoc nel laboratorio del Dr.Benning, e oggi dimostrerò la procedura Per iniziare le cellule helo della piastra di protocollo la sera prima, trasfezione su vetrini di vetro sterili posizionati in una piastra di coltura standard a sei pozzetti a una densità che sarà di circa il 70% fluente per la trasfezione il giorno successivo. Il giorno successivo preparare i complessi DNA Lipectomy 2000 secondo le istruzioni del produttore con quattro microgrammi di vettore di espressione mitocondriale metrico peram e 10 microlitri di lipectomia 2000 diluiti in 0,5 millilitri di optimum per ogni pozzetto da trasfettare.
Quindi, sostituire il terreno di coltura D-M-E-M-F-B-S HELOC in ciascun pozzetto con 1,5 millilitri dello stesso terreno senza antibiotici. Aggiungere la soluzione di LIPECTOMIA alla soluzione di DNA e mescolare delicatamente dopo che i complessi si sono formati. Aggiungere la soluzione di lipectomia del DNA goccia a goccia in ciascun pozzetto da trasfettare, mescolata facendo oscillare delicatamente la piastra e incubare per quattro ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica dopo l'incubazione.
Sostituire il terreno con D-M-E-M-F-B-S contenente antibiotici. Lasciare che le cellule esprimano il peram metrico per uno o due giorni prima di eseguire l'imaging con il forcipe. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto con cellule HELOC in una camera di imaging appropriata con soluzione di imaging.
Montare la camera di imaging in un tavolino per microscopio invertito. Quindi, utilizzare un obiettivo a immersione in olio 40x o superiore e una lunghezza d'onda di 380 nanometri. Per trovare un'area di interesse contenente una o più celle che esprimono un rapporto metrico, peram 380 nanometri viene utilizzato qui per identificare le celle come rapporto metrico.
Peram è meno resistente al fotosbiancamento a questa lunghezza d'onda. Una volta identificata un'area di interesse, impostare il software per la doppia eccitazione a 495 e 380 nanometri. Successivamente, acquisisci le immagini in sequenza eccitando alternativamente a 495 e 380 nanometri.
Acquisire immagini dei livelli basali di calcio per almeno 30 secondi prima dell'applicazione dell'agonista. Quindi applicare l'agonista mobilizzante del calcio tramite un apparato a profusione, notando che il tempo di aggiunta per ciascun agonista, i tempi di esposizione e gli intervalli di acquisizione devono essere ottimizzati per prevenire il fotosbiancamento pur consentendo una risoluzione temporale sufficiente. Una volta completato l'esperimento, le immagini possono essere analizzate offline.
Per iniziare l'analisi, selezionare una regione di interesse all'interno di un'area vuota del campo per sottrarre la fluorescenza di fondo, se necessario. Quindi, esporta le misurazioni del rapporto 4 95 3 80 dalla regione di interesse in Excel o in un software grafico simile. Questo pannello di immagini mostra la localizzazione subcellulare del rapporto metrico peram e mitocondri.
A sinistra c'è un'immagine di cellule vive di cellule helo che esprimono il rapporto metrico peram. Al centro c'è la colorazione fluorescente dei mitocondri e il colorante selettivo MIT tracker rosso CMX Ross. E infine a destra, l'immagine unita mostrata qui è una serie di immagini a pseudocolori 4 95, 3 80 nanometri di quattro cellule helo che esprimono il rapporto metrico peram nei mitocondri trattati con 10 micromolari A TP, e la quantificazione dei cambiamenti nei livelli di calcio mitocondriale di quelle quattro cellule precedenti è mostrata qui in questa immagine di una cellula hela che esprime il rapporto metrico peram nei mitocondri.
L'eterogeneità della risposta del calcio nei singoli mitocondri e la significativa frammentazione dei mitocondri sono evidenti dopo 60 minuti di trattamento con sporina di stor 0,5 micromolari. Alcuni mitocondri hanno aumenti oscillatori del calcio mostrati con la freccia bianca, mentre altri non mostrano cambiamenti significativi nel livello di calcio mostrati con una freccia gialla. Questo grafico rivela la variazione dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula dell'elicottero dopo l'induzione dell'apoptosi per 120 minuti con 0,5 sporina micromolare.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i cambiamenti dinamici nei livelli di calcio mitocondriale in risposta a vari tli utilizzando la proteina R geometrica medicata con calcio peram, che è selettivamente mirata alla matrice mitocondriale.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriali mediante un indicatore genetamente codificato per il calcio, il pericam-razionale-mt. Questa tecnica consente il monitoraggio dinamico dei livelli di calcio in cellule vive, fornendo informazioni sul funzionamento mitocondriale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immagini a fluorescenza
Sfondo
- I livelli di calcio mitocondriali sono cruciali per il metabolismo cellulare e la trasduzione del segnale.
- I metodi tradizionali per la misurazione dei livelli di calcio si basano spesso su indicatori sintetici.
- Gli indicatori codificati geneticamente offrono vantaggi in termini di specificità e indirizzamento.
- Questo studio utilizza il pericam raziometrico-mt per un’imaging migliorata della dinamica del calcio mitocondriale.
Scopo dello studio
- Monitorare le variazioni della concentrazione di calcio mitocondriale in cellule vive.
- Dimostrare l'uso di un indicatore genetamente codificato per il calcio mirato ai mitocondri.
- Fornire un protocollo dettagliato per l'acquisizione e l'analisi dei flussi di calcio mitocondriali.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione delle cellule con pericam raziometrico-mt.
- Acquisizione di immagini in tempo reale mediante microscopia a fluorescenza.
- Eccitazione sequenziale a doppia lunghezza d'onda per la misurazione del calcio.
- Analisi quantitativa delle immagini di fluorescenza per valutare la dinamica del calcio.
Risultati principali
- Sono stati misurati con successo i cambiamenti dinamici nei livelli di calcio mitocondriali.
- È stata osservata un'eterogeneità nelle risposte al calcio tra singoli mitocondri.
- È stata rilevata una significativa frammentazione dei mitocondri in seguito a determinati trattamenti.
- I risultati hanno dimostrato l'efficacia del pericam-rtometrico-mt per l'immagine in tempo reale.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio della dinamica del calcio mitocondriale.
- Indicatori geneticamente codificati come il pericam-razionale mitocondriale migliorano le capacità di imaging.
- Questa tecnica può essere applicata a diverse condizioni sperimentali per indagare la funzione mitocondriale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il monitoraggio della dinamica del calcio mitocondriale fornisce informazioni meccanicistiche fondamentali sulle vie di apoptosi, consentendo la validazione di bersagli nei meccanismi di morte cellulare. Questo approccio basato su sensori codificati geneticamente supporta una maggiore affidabilità predittiva nei modelli preclinici quantificando i flussi di calcio specifici per organulo con risoluzione temporale. Il metodo facilita la riduzione precoce dei rischi associati a ipotesi terapeutiche che coinvolgono disfunzioni mitocondriali in modelli di malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi del calcio mitocondriale come regolatore delle vie apoptotiche per la verifica di ipotesi mirate.
- Valore operativo: Fornisce letture specifiche per organulo che riducono l'ambiguità negli studi meccanicistici della morte cellulare.
- Valore predittivo: Supporta la validazione funzionale di bersagli coinvolti nell'apoptosi mediata dal calcio attraverso misurazioni in tempo reale dei flussi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi raziometrici che consentono l'analisi dose-risposta di composti che influenzano il calcio mitocondriale.
- Valore operativo: Compatibile con la microscopia a campo largo standard, permettendo l'integrazione in piattaforme di imaging esistenti senza necessità di attrezzature specializzate.
- Valore di scalabilità: Consente il monitoraggio longitudinale della dinamica del calcio e della morfologia mitocondriale in cellule vive per ore.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le variazioni del calcio mitocondriale agli esiti apoptotici, sostenendo la rilevanza come biomarcatore nei modelli di malattia.
- Valore operativo: Dimostra l'utilità sia con ATP (agonista fisiologico) che con staurosporina (induttore di apoptosi), ampliando l'applicabilità in diverse condizioni sperimentali.
- Continuità traslazionale: Favorisce il passaggio dalla scoperta del meccanismo alla validazione preclinica fornendo letture dinamiche e fisiologicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla riduzione del rischio meccanicistico fino alla valutazione preclinica, fornendo dati dinamici e quantificabili sulla funzione mitocondriale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su vie apoptotiche dipendenti dal calcio mediante misurazioni in tempo reale del flusso mitocondriale.
- Screening: Permette sistemi pronti per saggi con letture standardizzate e riproducibili del calcio per campagne di screening di composti.
- Analisi: Fornisce output quantitativi di tipo raziometrico (rapporto di eccitazione 495nm/380nm) che consentono il confronto statistico della dinamica del calcio tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le variazioni del calcio mitocondriale a fenotipi apoptotici, sostenendo la continuità dal meccanismo all'esito fenotipico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile per lo studio della disfunzione mitocondriale in diverse aree di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di apoptosi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a indicatori codificati geneticamente e indirizzati a organelli, che evitano la fuoriuscita di coloranti e gli artefatti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo informazioni quantitative precoci sui meccanismi mitocondriali d'azione dei composti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base ai profili di modulazione del calcio mitocondriale, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare per la trasfezione e l'analisi di cellule vive.
- Richiede un microscopio a fluorescenza con capacità di doppia eccitazione (380 nm e 495 nm) e filtri standard.
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di acquisizione delle immagini e dell'analisi delle regioni di interesse tra diversi gruppi di lavoro.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono l'efficienza di indirizzamento mitocondriale e i possibili artefatti dovuti a sovraespressione in diversi modelli cellulari.
- Limitazioni pratiche includono il rischio di fotodegradazione durante l'analisi a lungo termine e la necessità di ottimizzare gli intervalli di esposizione all'agonista.
