Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire una tecnica sensibile per misurare l'attività della mitofagia cellulare utilizzando la citometria a flusso. Qui dimostriamo che questo metodo è stato utilizzato con successo per valutare il drammatico aumento della mitofagia a cellule HeLa, dopo il trattamento con CCCP, un disaccoppiatore mitocondriale. Questa tecnica consente di misurare l'attività del mitofago in modo molto rapido e semplice.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile misurare in modo sensibile l'attività del mitofago nelle cellule viventi senza alcuna colorazione aggiuntiva. Pertanto, questa tecnica sarà in definitiva in grado di aiutare a comprendere il meccanismo e il ruolo fisiologico del mitofago. A dimostrare la procedura saranno Jee-Hyun Um e Young Yeon Kim del mio laboratorio.

Inizia questa procedura preparando l'mt-Keima, un lentivirus Keima mirato ai mitocondri. Il primo seme HEK293T le cellule in un piatto di coltura rivestito di poli-L-lisina e le coltiva a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale per un giorno. Il giorno successivo, trasfettare le cellule HEK293T con DNA lentivirale mt-Keima e confezionare la DNasi utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore.

Dopo otto ore di trasfezione, rimuovere il terreno di trasfezione e aggiungere otto millilitri di terreno fresco. Raccogliere i terreni contenenti particelle virali 48 ore dopo e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione. Quindi filtrare il terreno contenente virus con un filtro per siringa da 0,45 micrometri.

Piastra le cellule HeLa-Parkin in una piastra di coltura da 60 millimetri un giorno prima di raccogliere il lentivirus mt-Keima e coltiva le cellule con quattro millilitri di terreno di crescita per un giorno a 37 gradi Celsius in un incubatore. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura, aggiungere un millimetro di terreno virale mt-Keima, aggiungere altri due millilitri di terreno di crescita contenente 3 microlitri di soluzione madre di polibrene e incubare le cellule per un giorno in un incubatore a CO2. A 24 ore dall'infezione, rimuovere il terreno virale, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere quattro millilitri di terreno di crescita.

Per rimuovere le cellule non infette, trattare le cellule per due giorni con due microgrammi per microlitro di puromicina. Preparare terreni freschi contenenti 10 CCCP micromolari. Rimuovere il terreno di coltura e aggiungere quattro millilitri di terreno di coltura fresco contenente CCCP.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 per sei ore. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con PBS. Staccare le cellule mediante trattamento con soluzione di tripsina EDTA.

Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospenderle in un millilitro di PBS. Trasferire le cellule in una provetta FACS e metterle sul ghiaccio. Per la citometria a flusso, accendere il citometro a flusso e avviare il software di analisi.

Genera un nuovo esperimento e seleziona BV605 per il laser viola e PE-CF594 per il laser giallo-verde nella finestra dei parametri. Per prima cosa eseguire un campione di controllo di cellule non infettate dal lentivirus mt-Keima. Nel grafico della dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale disegna un cancello, utilizzando l'icona del poligono, attorno alle celle vive ed elimina le cellule morte e i detriti cellulari.

Quindi eseguire le cellule HeLa-Parkin infettate con il lentivirus mt-Keima. Nel dot plot di BV605 rispetto alla dispersione laterale, regolare la tensione in modo che le celle HeLa-Parkin che esprimono mt-Keima siano chiaramente distinte dalle celle di controllo che non esprimono mt-Keima. Successivamente, nel grafico a punti di PE-CF594 rispetto alla dispersione laterale, regolare la tensione in modo che le celle HeLa-Parkin che esprimono mt-Keima siano chiaramente distinte dalle celle di controllo.

Quindi, nel dot plot di BV605 rispetto a PE-CF594, selezionare la popolazione cellulare mt-Keima-positiva disegnando un cancello utilizzando l'icona del poligono. Quindi, crea un altro grafico a punti di BV605 rispetto a PE-CF594 che mostra solo le celle gate mt-Keima. In questo dot plot, disegna un cancello attorno alle cellule mt-Keima-positive non trattate.

Questa porta è indicata come la porta bassa. Quindi disegna un'altra porta contenente la regione sopra la porta bassa. Questo cancello è indicato come cancello alto perché contiene cellule con un'elevata attività mitofagica.

Quindi selezionare il menu Mostra gerarchia popolazione. Il valore Percentuale del genitore rappresenta la percentuale di celle nel cancello alto tra la popolazione mt-Keima positiva. Ora esegui ogni campione e registra almeno 10.000 eventi nel cancello di arresto di mt-Keima.

L'analisi della citometria a flusso di cellule HeLa non trattate che esprimono mt-Keima ha mostrato un basso livello di mitofagia. Il trattamento con CCCP ha indotto un drammatico aumento delle cellule mitofagiche nell'high gate. La percentuale di cellule mitofagiche è aumentata di oltre 10 volte a sei ore dal trattamento con CCCP.

Questo aumento della mitofagia con il trattamento con CCCP è stato completamente abolito dal co-trattamento con bafilomicina A. Una volta che le cellule che esprimono mito-Keima sono pronte, la misurazione del mitofago mediante citometria a flusso può essere condotta entro un'ora se preparata correttamente. Per un'analisi accurata dei mitofagi mediante citometria a flusso, è importante impostare i cancelli alti e bassi corretti. Quando si analizzano nuovi tipi di cellule, è necessario utilizzare cellule ben note come le cellule HeLa come controllo.

Inoltre, è importante ricordare che il mitofago dovrebbe essere pienamente confermato da caratteristiche aggiuntive, come una diminuzione della proteina mitocondriale e una riduzione del DNA mitocondriale. Questa tecnica può essere applicata a un'ampia varietà di tipi di cellule. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come analizzare il mitofago mediante citometria a flusso.