Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima
12 agosto 2018
Mitophagy, la degradazione selettiva dei mitocondri, è stato implicato nell'omeostasi mitocondriale ed è liberalizzato in varie malattie umane. Tuttavia, convenienti metodi sperimentali per misurare l'attività di mitophagy sono molto limitati. Qui, forniamo un test sensibile per misurare l'attività di mitophagy mediante citometria a flusso.
L'obiettivo generale di questa procedura è fornire una tecnica sensibile per misurare l'attività della mitofagia cellulare utilizzando la citometria a flusso. Qui dimostriamo che questo metodo è stato utilizzato con successo per valutare il drammatico aumento della mitofagia a cellule HeLa, dopo il trattamento con CCCP, un disaccoppiatore mitocondriale. Questa tecnica consente di misurare l'attività del mitofago in modo molto rapido e semplice.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile misurare in modo sensibile l'attività del mitofago nelle cellule viventi senza alcuna colorazione aggiuntiva. Pertanto, questa tecnica sarà in definitiva in grado di aiutare a comprendere il meccanismo e il ruolo fisiologico del mitofago. A dimostrare la procedura saranno Jee-Hyun Um e Young Yeon Kim del mio laboratorio.
Inizia questa procedura preparando l'mt-Keima, un lentivirus Keima mirato ai mitocondri. Il primo seme HEK293T le cellule in un piatto di coltura rivestito di poli-L-lisina e le coltiva a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale per un giorno. Il giorno successivo, trasfettare le cellule HEK293T con DNA lentivirale mt-Keima e confezionare la DNasi utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore.
Dopo otto ore di trasfezione, rimuovere il terreno di trasfezione e aggiungere otto millilitri di terreno fresco. Raccogliere i terreni contenenti particelle virali 48 ore dopo e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione. Quindi filtrare il terreno contenente virus con un filtro per siringa da 0,45 micrometri.
Piastra le cellule HeLa-Parkin in una piastra di coltura da 60 millimetri un giorno prima di raccogliere il lentivirus mt-Keima e coltiva le cellule con quattro millilitri di terreno di crescita per un giorno a 37 gradi Celsius in un incubatore. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura, aggiungere un millimetro di terreno virale mt-Keima, aggiungere altri due millilitri di terreno di crescita contenente 3 microlitri di soluzione madre di polibrene e incubare le cellule per un giorno in un incubatore a CO2. A 24 ore dall'infezione, rimuovere il terreno virale, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere quattro millilitri di terreno di crescita.
Per rimuovere le cellule non infette, trattare le cellule per due giorni con due microgrammi per microlitro di puromicina. Preparare terreni freschi contenenti 10 CCCP micromolari. Rimuovere il terreno di coltura e aggiungere quattro millilitri di terreno di coltura fresco contenente CCCP.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 per sei ore. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con PBS. Staccare le cellule mediante trattamento con soluzione di tripsina EDTA.
Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospenderle in un millilitro di PBS. Trasferire le cellule in una provetta FACS e metterle sul ghiaccio. Per la citometria a flusso, accendere il citometro a flusso e avviare il software di analisi.
Genera un nuovo esperimento e seleziona BV605 per il laser viola e PE-CF594 per il laser giallo-verde nella finestra dei parametri. Per prima cosa eseguire un campione di controllo di cellule non infettate dal lentivirus mt-Keima. Nel grafico della dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale disegna un cancello, utilizzando l'icona del poligono, attorno alle celle vive ed elimina le cellule morte e i detriti cellulari.
Quindi eseguire le cellule HeLa-Parkin infettate con il lentivirus mt-Keima. Nel dot plot di BV605 rispetto alla dispersione laterale, regolare la tensione in modo che le celle HeLa-Parkin che esprimono mt-Keima siano chiaramente distinte dalle celle di controllo che non esprimono mt-Keima. Successivamente, nel grafico a punti di PE-CF594 rispetto alla dispersione laterale, regolare la tensione in modo che le celle HeLa-Parkin che esprimono mt-Keima siano chiaramente distinte dalle celle di controllo.
Quindi, nel dot plot di BV605 rispetto a PE-CF594, selezionare la popolazione cellulare mt-Keima-positiva disegnando un cancello utilizzando l'icona del poligono. Quindi, crea un altro grafico a punti di BV605 rispetto a PE-CF594 che mostra solo le celle gate mt-Keima. In questo dot plot, disegna un cancello attorno alle cellule mt-Keima-positive non trattate.
Questa porta è indicata come la porta bassa. Quindi disegna un'altra porta contenente la regione sopra la porta bassa. Questo cancello è indicato come cancello alto perché contiene cellule con un'elevata attività mitofagica.
Quindi selezionare il menu Mostra gerarchia popolazione. Il valore Percentuale del genitore rappresenta la percentuale di celle nel cancello alto tra la popolazione mt-Keima positiva. Ora esegui ogni campione e registra almeno 10.000 eventi nel cancello di arresto di mt-Keima.
L'analisi della citometria a flusso di cellule HeLa non trattate che esprimono mt-Keima ha mostrato un basso livello di mitofagia. Il trattamento con CCCP ha indotto un drammatico aumento delle cellule mitofagiche nell'high gate. La percentuale di cellule mitofagiche è aumentata di oltre 10 volte a sei ore dal trattamento con CCCP.
Questo aumento della mitofagia con il trattamento con CCCP è stato completamente abolito dal co-trattamento con bafilomicina A. Una volta che le cellule che esprimono mito-Keima sono pronte, la misurazione del mitofago mediante citometria a flusso può essere condotta entro un'ora se preparata correttamente. Per un'analisi accurata dei mitofagi mediante citometria a flusso, è importante impostare i cancelli alti e bassi corretti. Quando si analizzano nuovi tipi di cellule, è necessario utilizzare cellule ben note come le cellule HeLa come controllo.
Inoltre, è importante ricordare che il mitofago dovrebbe essere pienamente confermato da caratteristiche aggiuntive, come una diminuzione della proteina mitocondriale e una riduzione del DNA mitocondriale. Questa tecnica può essere applicata a un'ampia varietà di tipi di cellule. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come analizzare il mitofago mediante citometria a flusso.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica sensibile per misurare l'attività di mitofagia cellulare utilizzando la citometria a flusso. Il metodo consente una valutazione rapida e facile della mitofagia in cellule vive senza colorazione aggiuntiva.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienza
- Metabolismo cellulare
Sfondo
- La mitofagia è la degradazione selettiva dei mitocondri.
- Gioca un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi mitocondriale.
- La deregolamentazione della mitofagia è legata a varie malattie umane.
- I metodi attuali per misurare la mitofagia sono limitati.
Obiettivo dello studio
- Fornire un saggio sensibile per misurare l'attività di mitofagia.
- Dimostrare l'efficacia della tecnica di citometria a flusso.
- Migliorare la comprensione del ruolo fisiologico della mitofagia.
Metodi utilizzati
- Citometria a flusso per misurare l'attività di mitofagia.
- Valutazione della mitofagia delle cellule HeLa dopo il trattamento con CCCP.
- Misura della mitofagia senza colorazione aggiuntiva.
- Dimostrazione da parte dei ricercatori Jee-Hyun Um e Young Yeon Kim.
Risultati principali
- Valutazione di successo dell'aumento della mitofagia nelle cellule HeLa.
- Capacità di misurazione rapida e sensibile dimostrate.
- Validazione dell'applicabilità della tecnica in cellule vive.
- Fornite intuizioni sui meccanismi della mitofagia.
Conclusioni
- La tecnica di citometria a flusso è efficace per misurare la mitofagia.
- Questo metodo può facilitare ulteriori ricerche sulla dinamica mitocondriale.
- Ha il potenziale per comprendere varie malattie legate alla mitofagia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of mitophagy is essential for de-risking mitochondrial-targeted therapeutic hypotheses in neurodegenerative and metabolic disease programs. The mt-Keima flow cytometry assay provides a rapid, quantitative readout that supports early-stage target validation by linking mitochondrial clearance to phenotypic outcomes. This enables predictive confidence in lead identification and prioritization of compounds modulating mitochondrial quality control.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial autophagic flux as a functional readout of pathway engagement.
- Operational Value: Enables rapid screening of genetic or pharmacological modulators without fixation or additional staining, preserving live-cell physiology.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating mitophagy induction with known activators like CCCP and inhibition by bafilomycin A, establishing assay specificity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, flow-based percentages of mitophagy-active cells, enabling dose-response and kinetic analysis for hit confirmation.
- Operational Value: Compatible with high-throughput flow cytometry platforms, allowing standardized, reproducible measurements across cell lines and treatment conditions.
- Scalability: Lentiviral mt-Keima expression creates a stable reporter system reusable across multiple experiments, reducing assay development time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Mitophagy activity measured in live cells aligns with disease-relevant models where mitochondrial dysfunction contributes to pathology.
- Preclinical Readiness: The assay’s sensitivity to lysosomal inhibition (e.g., bafilomycin A) supports mechanistic follow-up in autophagic flux studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of mitophagy flux with downstream biomarkers such as mitochondrial DNA loss or ROS production when combined with orthogonal assays.
Pipeline & Workflow Integration
The mt-Keima flow cytometry method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing a mechanistic biomarker for mitochondrial health interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of mitophagy regulators by quantifying flux changes in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and inter-laboratory comparability.
- Analytics: Generates percentage-based readouts (high gate vs. mt-Keima-positive population) that enable statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by confirming target engagement in disease-relevant cellular models of mitochondrial stress.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mitochondrial flux platform applicable across therapeutic areas involving neurodegeneration, metabolism, and aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial pathway modulation by providing direct, live-cell readouts of autophagic clearance.
- Operational Value: Eliminates need for fixation or permeabilization, enabling same-day analysis and reducing assay variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound effects to mitochondrial quality control, reducing late-stage attrition due to off-target mitochondrial toxicity.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on functional mitophagy modulation in human cell systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, flow cytometry compensation, and gating strategy design for dual-fluorescence reporters.
- Dependent on access to flow cytometers with violet (405 nm) and yellow-green (561 nm) laser lines and appropriate filters (BV605, PE-CF594).
- Necessitates standardization of mt-Keima expression levels and puromycin selection across cell lines to ensure consistent signal-to-noise ratios.
- Requires validation of mitophagy specificity using lysosomal inhibitors (e.g., bafilomycin A) and mitochondrial uncouplers (e.g., CCCP) as positive and negative controls.
- Limited to cells amenable to lentiviral transduction and puromycin selection; alternative delivery methods may be needed for primary or hard-to-transfect systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:02
Generation of Cells Expressing mt-Keima
3:25
Inducing Mitophagy using CCCP Treatment and Preparing FACS Samples
4:29
FACS Analysis of Mitophagy
7:16
Results: Analysis of CCCP-induced Mitophagy in HeLa-mt-Keima Cells by Flow Cytometry
7:55
Conclusion
