Un metodo di calcolo per quantificare le attività circadiana volare

Nella maggior parte degli animali, gli orologi circadiani orchestrano i processi comportamentali e molecolari e li sincronizzano con il ciclo quotidiano luce-buio. Nei moscerini della frutta, l'orologio è tipicamente studiato utilizzando registrazioni locomotorie. Ecco un esempio di locomozione media di tipo selvatico misurata in un ciclo di luce di 12 ore e buio di 12 ore, il ciclo luce-buio mostrato con la barra giallo-nera in cima.

Una tipica registrazione delle mosche mostra un modello biomodale complesso con due picchi di attività, un picco mattutino che si verifica intorno all'alba e un picco serale che si verifica intorno al tramonto. Questi due picchi insieme formano una forma d'onda che è molto diversa dalle oscillazioni sinusoidali osservate nei geni dell'orologio, suggerendo che i meccanismi, oltre all'orologio, hanno un effetto profondo nel produrre il modello osservato nei dati comportamentali. Qui presentiamo il primo metodo che descrive matematicamente i pattini temporali nell'attività delle mosche.

Abbiniamo i dati dell'attività a una forma d'onda del modello che imita la locomozione del volo. Il nostro modello è composto da quattro termini esponenziali, due termini dal picco mattutino e due termini dal picco serale. Insieme al periodo circadiano, il nostro modello ha nove parametri indipendenti.

I parametri B definiscono il tasso di lievitazione mattutina, decadimento mattutino, albimento serale e decadimento serale. TM e TE definiscono le larghezze dei picchi mattutini e serali, mentre HM e HE definiscono le altezze dei picchi. Insieme, questi parametri descrivono completamente la dimensione e la forma dei picchi mattutini e serali nel modello di attività.

Il nostro metodo può essere applicato per chiarire i meccanismi e il substrato che sono alla base del modello di attività bimodale comunemente osservato nelle letture locomotorie delle mosche. Per l'esperimento di locomozione, prepara tubi individuali con il cibo su un'estremità e il cotone sull'altra. Per questo, per prima cosa, metti da cinque a sei grammi di cibo per mosche in un becher da 50 millilitri.

Tagliate il cibo a pezzetti, così sarà più facile scioglierlo nel microonde. Il monitor di attività singolo si adatta a 32 tubi singoli. Pertanto, prendi 32 tubi e collegali insieme usando un elastico.

Sciogliere il cibo nel bicchiere nel microonde. Scaldare il cibo per circa 10-15 secondi. Ferma il microonde ogni cinque secondi e agita un po' il bicchiere con il cibo per garantire uno scioglimento uniforme del cibo.

Assicurarsi che tutto il cibo sia sciolto e che non siano rimasti pezzi solidi di cibo nel bicchiere. Mentre il cibo è ancora liquido, inserire i tubi nel becher con il cibo. Sposta un po' i tubi su e giù, in modo che siano ugualmente riempiti.

Lasciare raffreddare il cibo e solidificare per circa un'ora. Dopo che il cibo è solido, rimuovere i tubi dal becher usando un movimento rotatorio in modo che il cibo non si attacchi al fondo del becher. Quindi rimuovere l'elastico.

Sigillare l'estremità con il cibo usando la cera. Per questo, per prima cosa, pulisci accuratamente il tubo usando un tovagliolo di carta. Quindi premere il tubo contro la cera.

Controllare visivamente la qualità della guarnizione e, se necessario, ripetere nuovamente la sigillatura. Usando questa tecnica, sigillare tutti i tubi per l'esperimento. L'altra estremità dei tubi si chiude con il cotone.

Il cotone lascerà passare l'aria mantenendo le mosche bloccate all'interno dei tubi. È anche facile da rimuovere e reinserire, il che sarà utile quando caricheremo i tubi con le mosche per l'esperimento. Ora, dopo che i tubi sono pronti, caricali con le mosche per l'esperimento.

Per questo, scarica le mosche sul pad con CO2. Quindi, utilizzando un pennello, inserire con cura una mosca singola in ogni singolo tubo. Metti il tubo con la patta nel monitor.

Nello stesso ordine del monitor, la locomozione del volo verrà registrata nel file di output dal sistema di monitoraggio. Collegare il monitor al computer e posizionarlo in un'incubatrice che mantenga costante la temperatura e l'umidità. Sulla base dell'esperimento, impostare le condizioni di luce/buio corrette.

Per l'esperimento luce/buio, mantieni le mosche nel ciclo luce-buio per l'intero esperimento. Non utilizzare il primo giorno di misurazioni nell'analisi. Per l'esperimento dell'oscurità costante, in primo luogo, tenere le mosche per due giorni in condizioni di luce/buio per il trascinamento e la sincronizzazione degli orologi, quindi passare all'oscurità costante.

Non utilizzare le misurazioni del primo giorno di oscurità costante nell'analisi. Prima di passare alla sezione successiva, consigliamo di leggere il protocollo. Il sistema di monitoraggio emetterà un singolo file che contiene l'attività di tutte le mosche nel monitor.

Le ultime 32 colonne del file di output contengono l'attività delle singole mosche. Il nostro programma funziona con attività a mosca singola. Pertanto, suddividere il file di output in più file di attività di volo singolo.

Ogni file deve essere un file TXT a colonna singola. Ora, dopo aver preparato i file di attività, possiamo eseguire la nostra analisi. Esegui la funzione ModelFitPS3 nella finestra di comando di MATLAB con i seguenti parametri di input.

Frequenza di campionamento, inserire l'intervallo di tempo del campione di dati in secondi. Ad esempio, i nostri dati sono stati presi con una frequenza di campionamento di 20 secondi. Pertanto, abbiamo messo 20 qui.

Come intervallo di contenimento, inserisci l'intervallo di tempo in minuti, in cui i dati verranno raggruppati per una migliore visualizzazione. Consigliamo di raggruppare a 20 o 30 minuti, ma, per ora, ne metto 10 qui, giusto per mostrarvi in seguito come può essere facilmente modificato. Per la tendenza, inserisci uno se i dati mostravano la tendenza di base e zero in caso contrario.

I nostri dati non hanno alcuna tendenza di base. Pertanto, ho messo zero qui. Premere Invio per eseguire la funzione.

Nella finestra popup, selezionare il file di attività di volo singolo e premere Apri. Il programma calcolerà e traccerà lo spettro di potenza dei dati. In questa finestra, determinare il periodo principale nei dati.

Per questo, fare clic con il tasto sinistro del mouse sul picco nel periodo circadiano o con il tasto destro del mouse sul picco nella seconda armonica, replicato approssimativamente nel periodo circadiano diviso per due. Nel nostro caso, il picco alla seconda armonica è molto più grande e più acuto del picco al periodo circadiano. Pertanto, utilizziamo la seconda opzione.

Quindi, il programma traccerà i dati in contenitori all'intervallo di contenitori selezionato. Come puoi vedere, a intervalli di 10 minuti, il picco mattutino e serale non sono molto ben visualizzati. Pertanto, vogliamo modificare questo valore.

Per farlo, fai semplicemente clic con il pulsante destro del mouse in un punto qualsiasi del grafico. Nella finestra di dialogo Nuovo digitare il nuovo valore per l'intervallo intervallo. Si consiglia di aggiungere un intervallo di tempo di 20 minuti.

Pertanto, abbiamo messo 20 qui. Premere OK. Il programma ridisegna immediatamente i dati con il nuovo valore dell'intervallo bin. Per accettare questo valore, è sufficiente fare clic con il pulsante sinistro del mouse in un punto qualsiasi del grafico.

Il programma ora ridisegnerà i dati e mostrerà solo cinque giorni di misurazione. In questa finestra, selezionare il primo picco mattutino che verrà utilizzato nell'analisi. A volte è necessario saltare i primi uno o due giorni, il che richiede alla mosca di adattarsi al ciclo luce-buio.

Per selezionare il picco mattutino, è sufficiente fare clic sul picco preferito. Il programma ridisegnerà i dati e ora mostrerà solo tre giorni di misurazioni a partire dal picco mattutino selezionato. Le linee verticali blu e rosse mostrano il primo picco serale e il secondo picco mattutino in base al periodo selezionato nella prima finestra.

In questa finestra, selezionare il punto utilizzato dal tubo per l'adattamento preliminare dei dati con la funzione modello. Per questo, fai clic sui seguenti punti in questo particolare ordine. Per prima cosa, fai clic sulla parte superiore del primo picco mattutino.

Il clic è indicato con la stella rossa in basso, che mostra la posizione del clic. Quindi fare clic sulla fine del picco mattutino, quindi sull'inizio del picco serale, quindi sulla parte superiore del picco serale, quindi sulla fine del picco serale e infine sulla parte superiore del picco mattutino del giorno successivo. Il programma traccerà nuovamente lo spettro di potenza poiché i parametri finali sono ottenuti dall'adattamento spettrale.

Lo spettro ora è tracciato come frequenza sull'asse x e il picco circadiano si trova sul lato sinistro del grafico. Il periodo determinato nel primo passaggio è indicato con una linea verticale rossa. Per selezionare i punti di adattamento, in primo luogo, determinare approssimativamente il periodo primario.

Per questo, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco al periodo circadiano o fare clic con il pulsante destro del mouse sul picco alla seconda armonica. Useremo di nuovo la seconda opzione. Successivamente, apparirà un cursore in basso per selezionare i punti per l'adattamento spettrale.

I punti verranno visualizzati con cerchi rossi e appariranno dopo aver spostato il cursore. Sposta il cursore a sinistra e a destra e posiziona i punti il più vicino possibile alle cime dei picchi spettrali. Dopo aver ottenuto l'immagine migliore, premere il pulsante Accetta e il programma adatterà i punti selezionati con l'espressione analitica per lo spettro di potenza del modello.

Dopo il montaggio, il programma emetterà altri due grafici. Il primo è uno spettro di potenza del modello costruito con i parametri estratti. Il secondo è costituito dai dati adattati al modello.

I dati vengono visualizzati con una linea nera e il modello viene visualizzato con una linea rossa. Si può vedere che la funzione assomiglia molto ai dati, in particolare gli ultimi tre giorni di attività. I parametri estratti vengono salvati nel file TXT dei parametri di adattamento del modello.

Dopo il nome del file, i parametri vengono salvati nel seguente ordine, prima b del decadimento mattutino, poi b del risveglio mattutino, b del risveglio serale, b del decadimento serale, periodo circadiano, quindi larghezza del picco mattutino diviso per il periodo circadiano, ampiezza del picco serale diviso per il periodo circadiano, altezza del picco mattutino, l'altezza del picco serale e l'errore di adattamento spettrale. Oltre al file dei parametri di adattamento del modello, il programma produrrà anche altri due file. In primo luogo, i dati si adattano alla funzione del modello e in secondo luogo è un adattamento spettrale.

Eseguire questa analisi con altri file di attività. Tutti i parametri estratti vengono salvati nel file TXT dei parametri di adattamento del modello e possono essere ulteriormente utilizzati per collegare l'output comportamentale ai meccanismi sottostanti che regolano il comportamento quotidiano del volo controllato dal modello di attività.