Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

L'obiettivo generale della fabbricazione di microcriogel macroporosi elastici 3D utilizzando la criogelazione è quello di facilitare la terapia rigenerativa iniettabile e lo screening di farmaci ad alto rendimento in vitro. Questo video presenta i protocolli per fabbricare microtessuti 3D versatili e applicarli alla terapia rigenerativa e allo screening dei farmaci. La tecnica di terapia rigenerativa migliora la ritenzione delle cellule staminali, la sopravvivenza e le funzioni terapeutiche dopo l'iniezione in un sito della ferita.

Lo screening antidroga è migliorato anche grazie alla facilità d'uso e al potenziale per lo screening ad alto rendimento. In generale, le persone che si avvicinano per la prima volta alla cultura 3D hanno difficoltà a causa dei protocolli complicati. Questa tecnica semplifica la coltura 3D e offre ai ricercatori un maggiore controllo dei microtessuti 3D risultanti.

Ad assistere alla dimostrazione di queste procedure saranno Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian e You Zhifeng, quattro studenti laureati del nostro laboratorio. Lavare i chip dell'array di microstencil in PMMA con acqua deionizzata per rimuovere i detriti rimasti dall'incisione laser. Quindi, asciuga i chip dell'array di microstencil a 60 gradi Celsius.

Quindi, trattare le patatine essiccate in un pulitore al plasma in gruppi di quattro. Innanzitutto, far funzionare la pompa del vuoto per due minuti. Quindi, utilizzare 18 watt di potenza RF per tre minuti per aumentare l'idrofilia dei chip.

Ora, prepara un millilitro di soluzione precursore della gelatina ogni cinque patatine. Sciogliere la gelatina in un bagnomaria a 60 gradi Celsius e incubare la soluzione con ghiaccio per cinque minuti. Una volta raffreddata leggermente ma ancora liquida, mescolare accuratamente la glutaraldeide nella soluzione del precursore della gelatina fino a una concentrazione finale dello 0,3% di glutaraldeide.

Ora, pipettare 200 microlitri di soluzione preparata sulla superficie superiore di ogni chip. Distribuire uniformemente la soluzione sui trucioli utilizzando una bacchetta di vetro piegata. Quindi, trasferire immediatamente i chip dell'array caricati con soluzione in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 16 ore per la criogelazione.

Il giorno successivo, raffreddare un liofilizzatore a meno 40 gradi Celsius per circa 30 minuti. Quindi, caricare i chip dell'array e liofilizzarli per due ore sotto vuoto. Il ghiaccio sublimerà in queste condizioni e i trucioli saranno quindi pronti per l'uso.

Inizia raccogliendo singoli microcriogel dai chip. Iniziate sovrapponendo il chip dell'array di microcryogel fabbricato sopra l'array di pin dell'espulsore PDMS fabbricato. Allineare ogni microcriogel con un perno di espulsione.

Quindi premere il chip dell'array di microcryogel nell'array per spostare i microcryogel dai loro pozzetti. Ora, raccogli i microcriogel espulsi in un bagno d'acqua e raccoglili con l'aiuto di un colino cellulare. Usa un colino per raccogliere tutti i microcriogel da un chip.

Quindi, lavare i microcriogel con boroidruro di sodio su ghiaccio. Lasciare estinguere i residui di aldeidi non reticolati per circa 20 minuti. Quindi, scartare il boroidruro di sodio e lavare i microcriogel con cinque millilitri di acqua deionizzata per 15 minuti.

Eseguire un totale di tre o cinque lavaggi con acqua prima di procedere. Dopo aver rimosso i microcriogel dall'ultimo lavaggio con acqua, usa una pinzetta per trasferirli dal colino cellulare a una capsula di Petri da 35 millimetri. Ogni collezione di microcriogel costituisce un cluster.

Ora, aggiungi da 50 a 70 microlitri di acqua deionizzata a ciascun grappolo di microcriogel e copri il piatto. Quindi, picchiettare delicatamente la piastra per livellare eventuali microcriogel impilati. Quindi, congelare i microcriogel a meno 20 gradi Celsius per quattro-16 ore.

Successivamente, liofilizzarli per due ore come prima. Il passo successivo è quello di realizzare i microtessuti 3D. Per prima cosa, sterilizzare i microcriogeli.

Quindi, raccogliere le cellule con la tripsina, quantificare la loro densità e risospenderle a otto milioni di cellule per millilitro nel terreno di crescita. Quindi, pipettare 60 microlitri di sospensione cellulare su ciascun grappolo di microcriogel. Conservare le piastre in una camera umidificata e incubarle a 37 gradi Celsius per due ore in modo che le cellule vengano assorbite dai gel.

Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di terreno di coltura a ciascun piatto e continuare la coltura, cambiando il terreno a giorni alterni. In due giorni si saranno formati i microtessuti 3D. Per iniettare i microtessuti 3D in un topo, trasferirli prima in una pipetta da cinque millilitri, quindi caricarli in un colino cellulare per filtrare il terreno di coltura.

Quindi, risospendere i microtessuti 3D in una soluzione di gelatina al 15%. Dopo aver preparato l'animale per l'impianto, iniettare per via intramuscolare i microtessuti in tre posizioni del muscolo gracile. Ogni iniezione deve contenere 150 microcriogel in 150 microlitri di soluzione.

Utilizzare una siringa da un millilitro con un ago calibro 23. Dopo aver assemblato l'array di microcriogel per la coltura cellulare su chip, posizionarli con cura in una camera di umidità preriscaldata senza bagnarli. Quindi aliquotare accuratamente tre microlitri di sospensione cellulare accuratamente miscelata direttamente su ciascun pozzetto di microcryogel.

Lasciare che la punta della pipetta tocchi leggermente la superficie del microcryogel prima di espellere la soluzione. Non seminare i pozzetti periferici. Dopo aver caricato i pozzetti, aggiungere 10 microlitri di terreno selettivo a ciascun pozzetto e aggiungere il terreno ai pozzetti periferici per rallentare l'evaporazione utilizzando un erogatore di liquidi a 96 canali.

Quindi, coltiva i chip nella camera di umidità per 24 ore per formare microtessuti 3D. Il giorno successivo, utilizzando il distributore di liquidi a 96 canali, aggiungere 10 microlitri di farmaci a ciascun pozzetto in un gradiente di concentrazione quattro volte per completare l'aggiunta di tutti i 384 pozzetti, compresi i controlli DMSO. Quindi, continua la coltura per 24 ore.

Dopo 24 ore di trattamento farmacologico, aggiungere quattro microlitri di soluzione madre di resazurina a ciascun pozzetto e incubare la piastra per due ore, consentendo alle cellule di metabolizzare la resazurina. Per analizzare il metabolismo della resazurina nelle cellule, utilizzare un lettore di piastre. I microcriogel di gelatina raccolti avevano forme e dimensioni predefinite.

L'analisi del SEM ha mostrato che i microcriogel contenevano strutture macroporose interconnesse con dimensioni dei pori comprese tra 30 e 80 micron. L'iniettabilità dei microcriogel di gelatina è stata valutata quantitativamente coltivandoli dopo l'iniezione. 1.000 per millilitro sono stati iniettati a sei newton in meno rispetto alla forza clinicamente accettabile di 10 newton.

Le cellule staminali nei microcriogel hanno mantenuto un'elevata vitalità e una grande capacità proliferativa dopo l'iniezione durante cinque giorni di coltura. Utilizzando tali cellule, il modello di ischemia degli arti di topo è stato trattato terapeuticamente e lo stato fisiologico degli arti ischemici è stato esaminato 28 giorni dopo l'intervento chirurgico. Il trattamento dei microtessuti con 100.000 cellule staminali ha migliorato il recupero degli arti.

Solo il 25% dei topi ha mostrato un'amputazione spontanea delle dita dei piedi dopo 28 giorni. In un'altra applicazione, l'array di microtessuti 3D è stato utilizzato per test farmacologici ad alto rendimento. Le cellule di carcinoma epatocellulare sono state trattate con doxorubicina e le cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule sono state trattate con IMMLG-8439.

In entrambi i casi, la resistenza ai farmaci è stata aumentata dalla coltura 3D. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare microcriogel microporosi 3D elastici per colture 3D off-chip utilizzando la terapia rigenerativa iniettabile o array di colture cellulari 3D su chip per lo screening di farmaci ad alto rendimento in vitro. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia rigenerativa cellulare e dello screening farmacologico, per utilizzare la coltura cellulare 3D, facendo così progredire entrambi i campi di ricerca.

Non dimenticare che lavorare con glutaraldeide e boroidruro di sodio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare indumenti protettivi adeguati e lavorare sotto una cappa da laboratorio.