Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Le differenze nelle colture semplificate in vitro 2D rispetto agli ambienti tissutali 3D hanno aumentato l'interesse per i sistemi 3D per rappresentare la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi. Il processo di fabbricazione non richiede tecniche di struttura o fotolitografia. Tuttavia, il dispositivo 3D PDMS include i vettori necessari per le applicazioni dell'ambiente fisiologico 3D.

Per la preparazione del dispositivo mesofluidico, utilizzare un programma software di progettazione tridimensionale tridimensionale per progettare la maschera dello stampo per il dispositivo polidimetilsilossano o PDMS e stampare lo stampo utilizzando apparecchiature di litografia stereo con una resina termoresistante. Quando lo stampo è pronto, mescolare approssimativamente tre millilitri di soluzione monomero PDMS per stampo con un agente polimerizzante con un rapporto 10 a uno e utilizzare un vuoto per degasare la miscela in un essiccatore sottovuoto per un'ora. Al termine dell'essiccazione, utilizzare un pezzo di nastro adesivo per rimuovere qualsiasi polvere dalla superficie dello stampo e riempire accuratamente lo stampo con la soluzione PDMS degassata.

Quindi, polimerizza il PDMS a 80 gradi Celsius per due ore prima di lasciare raffreddare lo stampo a temperatura ambiente. Quando lo stampo viene raffreddato al tatto, utilizzare una lama per tagliare il limite tra lo stampo e pdms e sbucciare con cura il PDMS dallo stampo. Tagliare il PDMS per adattarlo a un coverslip da 22 per 22 millimetri e fare un foro all'ingresso.

Utilizzando tessuti di lanugine bassi e 70%etanolo, pulire il dispositivo e asciugare e tamponare il dispositivo con un nuovo pezzo di nastro adesivo per rimuovere eventuali particelle di polvere di grandi dimensioni. Quindi autoclave il dispositivo PDMS e coverslip a 121 gradi Celsius per otto minuti bagnati e 15 minuti asciutti e trattare la superficie inferiore della parte PDMS e coprilip con una pistola di scarico corona per cinque minuti in un cappuccio di coltura tissutale prima di legare i pezzi insieme. Per caricare il dispositivo, è necessario innanzitutto rimodere le cellule di interesse in un volume appropriato di mezzo di crescita integrato con 1%penicillina e streptomicina e 1%insulina-transferrina-selenio-x.

Successivamente mescolare 50 microlitri della sospensione cellulare della ghiandola mammaria con 425 microlitri di soluzione di collagene neutralizzata preparata al momento e riempire una pipetta da 200 microlitri con la sospensione della cellula di collagene. Iniettare la sospensione attraverso l'ingresso nel dispositivo PDMS fino a riempire l'intera camera e posizionare il dispositivo nell'incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per un'ora per indurre la gelazione prima di riempire i serbatoi su entrambi i lati con mezzo di crescita e riportare il dispositivo all'incubatore fino all'imaging confocale. Per l'imaging e la quantificazione 3D, installare una camera di coltura di imaging cellulare vivo su un microscopio confocale e preimpostare la temperatura e l'anidride carbonica rispettivamente a 37 gradi Celsius e al 5%.

Aggiungere acqua al serbatoio della camera di imaging per umidificare la camera, posizionando le salviette umidificate nella camera se necessario e posizionando il dispositivo PDMS nella camera. Aggiungere il fattore di crescita epidermico a uno dei bacini come fonte del fattore nella formazione del gradiente lasciando che l'altro serbatoio serva da lavandino per lo sviluppo della distribuzione del fattore di crescita epidermica mediamente graduata. Quindi impostare l'intervallo della pila Z che copre il volume degli organoidi di interesse e avviare l'imaging.

Alla fine dell'esperimento, utilizzare un programma di analisi delle immagini appropriato per misurare la lunghezza e l'angolo dei rami che si estendono dagli organoidi o la migrazione delle singole cellule. Sia nei test silico che in vitro ha rivelato la formazione di un gradiente del fattore di crescita epidermico lineare stabile attraverso l'area di coltura cellulare che dura circa due giorni senza rifornimento dei serbatoi della sorgente o del lavandino suggerendo che il fattore di crescita epidermico, una proteina da 6,4 kilodalton, può formare un gradiente stabile a base di diffusione all'interno di un gel di collagene preparato come dimostrato in un periodo di tempo relativamente breve. Gli organoidi mammari formano più rami in presenza di un fattore di crescita epidermico nanomolare spaziale uniforme 2,5 senza pregiudizi direzionali per tre giorni se il fattore di crescita epidermico viene aggiunto nel gradiente lineare per avere 0,5 nanomolare per millilitro.

Tuttavia, la formazione del ramo mostra una distorsione direzionale significativa. Da notare che l'aggiunta di inibitori della giunzione gap sopprime la capacità degli organoidi di rispondere al gradiente. Il pH della soluzione di collagene è fondamentale per la gelazione e la vitalità cellulare.

Se il collagene non viene neutralizzato prima della miscelazione, la vitalità cellulare sarà bassa. Questo metodo può essere esteso per adattarsi a modelli di tessuti più realistici e potrebbe ospitare la formazione di reti vascolari da singole cellule all'interno del gel.