Ricerca di base in medicina al Plasma - un approccio di Throughput da liquidi a celle

L'obiettivo generale di questi saggi basati su sequenze multi-pozzetto è quello di comprendere meglio gli effetti del plasma fisico freddo sugli ossidanti, sulle risposte biologiche in vitro, utilizzando la spettroscopia di emissioni ottiche, l'analisi dei liquidi e l'attività cellulare, la microscopia e i saggi di citometria a flusso. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina del plasma, in particolare per quanto riguarda le specie direttive derivate dal plasma, importanti per l'induzione della morte immunogenica delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo approccio semi-automatizzato.

Utilizza piastre a 96 pozzetti, per aumentare la velocità e la produttività della ricerca. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle future terapie al plasma, come in dermatologia o oncologia. E, poiché forniscono i mezzi per identificare le specie direttive derivate dal plasma, che sono rilevanti per le risposte biologiche.

A dimostrare la procedura sarà Felix Niessner, un tecnico del nostro laboratorio. Per il monitoraggio delle specie di plasma, posizionare un getto di plasma atmosferico davanti a uno spettrofotometro a emissioni ottiche, perpendicolare all'asse del pennacchio, e utilizzare il software dedicato per registrare la fotoemissione e la lunghezza d'onda di ciascuna condizione di gas, a due litri standard al minuto di flusso di gas di alimentazione. Per l'analisi del superossido trattato al plasma, impostare un protocollo finale per la tabella XYZ, con i rispettivi tempi di trattamento e le posizioni dei pozzetti appropriati.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di master mix appena preparato ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti trasparente a fondo piatto in triplice copia e utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 550 nanometri. Per analizzare gli effetti del trattamento al plasma sulle risposte metaboliche cellulari, in una cappa a flusso laminare, seminare una volta 10 alle quattro cellule di interesse in 100 microlitri di terreno di coltura cellulare completamente integrato, per pozzetto, in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e incubare durante la notte. Dopo la coltura notturna in un incubatore per colture cellulari, utilizzare il tavolo XYZ per trattare i pozzetti con solo plasma o gas, secondo l'analisi sperimentale, e rimettere le cellule nell'incubatore per altre 20 ore.

Al termine della seconda incubazione, aggiungere alle cellule 25 microlitri di terreno di coltura cellulare fresco, integrato con 500 micromolari di Resazurina, nonché ai tre pozzetti di controllo di fondo di sola Resazurina. Rimettere le cellule nell'incubatrice, per un'incubazione di tre ore. Quindi, misurare la fluorescenza in un lettore di micropiastre.

Per l'imaging delle cellule trattate con plasma, dopo aver letto la fluorescenza, sostituire i surnatanti con 100 microlitri di terreno di coltura cellulare fresco, integrati con un microgrammo per millilitro di ioduro di propidio. Posizionare la piastra su un tavolino da microscopio motorizzato e selezionare l'obiettivo 20x per visualizzare le cellule. Quindi, utilizzare il software di analisi quantitativa delle immagini appropriato per determinare l'area citosolica totale nelle immagini digitali a contrasto di fase, di tutti i campi visivi visualizzati in ciascun pozzetto.

Per l'analisi citofluorimetrica delle cellule trattate con plasma, dopo l'imaging, lavare le cellule in ciascun pozzetto due volte con 200 microlitri di PBS, integrati con calcio e magnesio per lavaggio, seguiti dalla marcatura, con 15 anagrammi per millilitro di anticorpo monoclonale anti-calreticulina di topo, in 50 microlitri di PBS, più calcio e magnesio per pozzetto. Dopo 15 minuti nell'incubatore per colture cellulari, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di terreno di coltura cellulare completo e aggiungere 100 microlitri di soluzione di distacco cellulare in ciascun pozzetto per 20 minuti, a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, caricare la piastra sul citometro a flusso e acquisire un minimo di 1.000 eventi nella popolazione di scatter diretta e laterale, solitamente associati a cellule vitali.

Quindi, utilizzare il software di analisi della citometria a flusso appropriato per controllare la popolazione di interesse e determinare l'intensità media di fluorescenza dell'espressione della calreticulina. La spettroscopia di emissioni ottiche può essere utilizzata per seguire i picchi distinti legati ai componenti reattivi del plasma in diverse condizioni di gas di alimentazione. Per il trattamento al plasma dei liquidi, viene determinata per prima l'evaporazione causata dal gas argon e dal plasma argon, con le condizioni che producono risultati di evaporazione diversi, poiché il plasma esercita anche effetti sulla temperatura.

Analogamente ai risultati della spettroscopia di emissioni ottiche per i radicali ossidrilici, la deposizione di perossido di idrogeno diminuisce significativamente con l'aggiunta di ossigeno o azoto, ma aumenta con il gas di alimentazione umidificato. Inoltre, l'aggiunta di azoto al gas di alimentazione porta a concentrazioni di nitrati significativamente più elevate, rispetto ai liquidi trattati con plasma di argon. La maggior parte del super ossido viene prodotta in condizioni di gas argon secco, con miscele di ossigeno e/o azoto che estinguono significativamente la generazione di super ossido, tranne in presenza di plasma di argon ossigeno umidificato.

Le intensità di fluorescenza della Resazurina e delle cellule trattate con plasma sono simili ai cambiamenti fisici osservati visivamente nei surnatanti delle colture cellulari, confermando gli effetti citotossici del trattamento prolungato con plasma. Una diminuzione dell'area cellulare totale è osservata anche nei pozzetti dei campioni per il trattamento al plasma, in particolare in condizioni di gas di alimentazione umidificato, con una sovraregolazione complessiva della colorazione con calreticulina sulle cellule di melanoma miren, in risposta a esposizioni più brevi al trattamento con plasma. Se eseguiti correttamente, i saggi cellulari dei mytoplex e la lettura possono essere completati in poche ore.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti anche altri metodi, come la co-coltura con cellule immunitarie o l'analisi dei surnatanti delle colture cellulari. Questo aiuta a rispondere a ulteriori domande, sul rilascio di madri, client cyto o proteine redux, nonché sul riconoscimento immunitario delle cellule di melanoma trattate con plasma. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ulteriori ricerche sui cicli del melanoma, ad esempio con sferoidi tumorali 3D.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la ricerca di base nella medicina del plasma, dalla fase gassosa al plasma, alle molecole e ai liquidi reattivi, alle risposte biologiche nelle cellule di melanoma.