Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion In Vitro

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di imitare la trasfusione piastrinica in vitro e testarla utilizzando l'emostasi sul collagene, con flusso idrodinamico e microscopia in tempo reale. I pazienti con trombocitopenia vengono trattati con concentrati piastrinici conservati. Il nostro metodo ha lo scopo di aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trombosi e dell'emostasi, con particolare attenzione alla qualità e alla funzione di tali concentrati piastrinici conservati.

Il valore aggiunto di questa tecnica è che imita il flusso sanguigno e quindi tiene conto delle influenze reologiche sulle cellule e sulle biomolecole partecipanti. Il metodo attuale valuta il legame piastrinico al collagene. Può, tuttavia, essere applicato anche ad altri tessuti adesivi, tra cui la placca aterosclerotica, le cellule endoteliali o specifiche proteine della matrice come il fattore di Von Willebrand e il fibrinogeno.

Inizia con la preparazione del biochip. Agitare e diluire un brodo di collagene da uno a 20 nella soluzione isotonica di glucosio del produttore fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Quindi, pipettare 0,8 microlitri nelle corsie di un nuovo biochip monouso.

Riempi tutte le corsie su un'estremità del chip e contrassegnala come estremità di uscita. Quindi ispezionare il chip per assicurarsi che ogni corsia sia riempita per 5/6 con la soluzione e che non ci siano bolle d'aria. Quindi, incubare il chip a quattro gradi Celsius per quattro ore o durante la notte in un contenitore umidificato e chiuso.

Successivamente, bloccare i canali codificati pipettando il buffer di blocco nell'altra estremità delle corsie. Quindi, per ogni corsia, tagliare 12 centimetri di tubi e attaccare un perno a ogni lunghezza di tubo per renderli attaccabili al biochip. Sciacquare le lunghezze del tubo con acqua distillata da una siringa e un connettore.

Quindi, saturarli con un tampone bloccante e sigillarli in un contenitore umidificato per almeno un'ora. Successivamente, preparare la pompa e il collettore. Per prima cosa, sciacquare la pompa e il collettore con acqua distillata per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Quindi, collegare il biochip al tavolino del microscopio automatizzato. Metti un'estremità delle lunghezze in un tubo da 1,5 millilitri riempito con HBS, quindi attaccale con l'altra estremità agli ingressi del biochip. Inserire i perni del collettore nelle uscite del biochip.

Quindi, sciacquare il sistema con HBS utilizzando la pompa. Qualsiasi tampone bloccante rimanente o collagene scarsamente aderente verrà quindi rimosso. Questo completa le preparazioni della camera di flusso.

Inizia con il raggruppare le recenti raccolte di sangue da volontari sani in una provetta da centrifuga conica. Far girare il campione per circa 15 minuti a 250 Gs.Do non usare il freno, perché disturberebbe la fase inferiore poco compattata. Rimuovere ed eliminare il plasma ricco di piastrine e il buffy coat.

Conservare i globuli rossi impacchettati contenenti il minor numero possibile di piastrine, per produrre il sangue ricostituito. Ora, inizia a scongelare quattro millilitri di plasma di tipo AB a 37 gradi Celsius per cinque minuti e 20 secondi. Nel frattempo, determinare l'ematocrito dei globuli rossi preparati utilizzando un analizzatore ematologico automatizzato.

Quindi, determinare la concentrazione piastrinica di un concentrato piastrinico preparato da una banca del sangue da utilizzare per la ricostituzione del sangue intero. Calcolare i volumi necessari per un millilitro di sangue ricostituito con ematocrito al 40% e 250.000 piastrine per microlitro. Ora, utilizzando una punta di pipetta tagliata, trasferire il volume richiesto di globuli rossi, plasma e concentrato piastrinico alla concentrazione desiderata e un volume finale di un millilitro.

Mescolare il sangue ricostituito con inversioni delicate ed eseguire un esame emocromocitometrico completo. Quindi, procurati una provetta da microcentrifuga preparata contenente Calceina AM e aggiungi un millilitro di sangue ricostituito. Mescola il sangue con il colorante usando inversioni delicate.

Quindi, incubare il sangue ricostituito per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Nel software, selezionare la regione di interesse nella corsia di perfusione. Concentrati sulle fibre di collagene aderenti nella parte inferiore delle corsie con un ingrandimento di 100x.

Idealmente, utilizzare il contrasto di fase o il contrasto di interferenza differenziale. Scegli l'opzione imposta Z corrente per le regioni delle tessere selezionate per fissare digitalmente le posizioni Z selezionate. Il fuoco ottico prima della perfusione dovrebbe essere sul collagene ameloblasto, ma questo può essere complicato.

Un'alternativa è quella di impostare la messa a fuoco del microscopio sulle piastrine aderenti iniziali. A questo punto, mescolate delicatamente i campioni e posizionateli accanto al biochip. Quindi, inserire il tubo collegato alla corsia osservata nel sangue ricostituito.

Successivamente, utilizzando il software che controlla la pompa, applicare una pressione di 50 dyne per centimetro quadrato per spostare il campione di sangue nella corsia e avviare l'esperimento. Durante l'esperimento, registrare immagini ogni 15 secondi per cinque minuti. Determinare la cinetica di crescita dei trombi utilizzando il software di analisi delle immagini.

In questo caso, viene utilizzato Zen 2012. Inizia con l'apertura del plug-in analisi delle immagini per determinare la copertura superficiale delle piastrine. Impostare la soglia di fluorescenza nella scheda interattiva di analisi per definire l'intensità dei pixel correlata a un segnale positivo, che proverrebbe dalle piastrine aderenti.

Quindi, utilizza crea tabelle per generare automaticamente un foglio di calcolo con un elenco delle aree superficiali dei segnali positivi per ogni punto temporale. Salva questi fogli di calcolo in formato XML e aprili in un programma per fogli di calcolo per ulteriori calcoli. In ogni punto temporale, calcolare le aree totali della superficie degli oggetti selezionati ed esprimere questo valore come percentuale di superficie coperta.

Quindi, tracciare i dati in funzione del tempo di perfusione e calcolare la pendenza mediante regressione lineare. Questo modella la cinetica di crescita dei trombi di quella particolare condizione sperimentale. Tre campioni identici di sangue intero ricostituito sono stati perfusi simultaneamente su superfici rivestite di collagene.

Ciò ha portato a un coefficiente di variazione dell'8,7%, suggerendo una variazione intra-test e intra-laboratorio accettabile per il confronto dei test. La trasfusione è stata simulata ricostituendo il sangue con il componente carente. Sono state eseguite diverse ricostituzioni con concentrazioni piastriniche decrescenti.

Come previsto, una conta piastrinica più bassa ha comportato una minore adesione in funzione del tempo di perfusione. Successivamente è stato studiato l'effetto della diminuzione delle temperature dopo la raccolta del sangue e durante la perfusione. Si è scoperto che i trombi si accumulano più lentamente quando il sangue viene raffreddato a temperatura ambiente.

Rispetto a un campione mantenuto a 37 gradi Celsius durante lo studio. Durante la circolazione, le piastrine si legano ai siti di lesione dei vasi in condizioni di elevato stress della parete. Come previsto, la variazione della velocità nelle camere di flusso microfluidico ha modificato l'adesione piastrinica totale.

Queste condizioni modificano anche la cinetica di crescita del trombo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti in camera di flusso microfluidico utilizzando sangue ricostituito per testare la qualità e la funzione dei concentrati piastrinici conservati. Questa tecnica può essere eseguita in circa sette ore.

Gli esperimenti in camera a flusso microfluidico hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo della trasfusione piastrinica per esplorare l'impatto delle variabili di donazione, preparazione e conservazione. Un esempio rilevante è l'inattivazione dei patogeni. Abbiamo fornito l'esempio di un solo soggetto sperimentale.

Tuttavia, le variazioni della concentrazione di calcio, dello stress puro e dei rivestimenti superficiali possono essere utilizzate per affrontare diverse domande di ricerca. Analogamente a questa procedura, è possibile eseguire altre misurazioni in camere a flusso microfluidico per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, le prestazioni delle piastrine immagazzinate per la coagulazione sul flusso.