Name: Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri come modellare la trasfusione piastrinica in vitro con camere microfluidiche e sangue ricostituito. Questo metodo valuta l'emostasi su collageno e la funzionalità delle piastrine conservate per migliorare le terapie trasfusionali.

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Gli autori non hanno riconoscimenti.

Questo protocollo segue le linee guida etiche istituzionali per la ricerca su campioni umani e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori coinvolti. L&#39;approvazione per gli esperimenti descritti qui è stato ottenuto dal Comitato Etico dell&#39;Ospedale di Anversa University. Nota: le indicazioni di temperatura sono sempre a temperatura ambiente, se non diversamente specificato. Installazione 1. Preparazione camera di flusso <ol><li> Lanes Preparazione, tubi e Pins <ol><li> Vortex la sospensione collagene vigorosamente e diluire 1/20 nella soluzione di glucosio isotonica fornito dal fornitore per una concentrazione finale di 50 pg / ml. Nota: Usiamo collagene tendine equino, costituito principalmente di tipo I fibrille. Il equina collagene di tipo I è spesso definito come &quot;Horm&quot; collagene ed è lo standard d&#39;oro per questo tipo di test 9 per entrambe le ragioni storiche e biologiche. tipo umano collagene III può anche essere utilizzato, ma the fibrille cappotto meno bene e la risposta piastrinica non è così forte. Altre superfici rivestimento possono anche essere utilizzati, ad esempio von Willebrand (VWF), fibrinogeno, fibronectina, laminina, vitronectina, thrombospondin-1 o combinazioni di questi 16. </li><li> Prendere un nuovo biochip usa e getta dal contenitore del provider. Le dimensioni dei biochip usati qui sono 0.4W x 0,1H x 20L in mm 3. </li><li> Pipettare 0,8 microlitri nella corsia (s) del biochip microfluidico su un&#39;estremità del chip e marchio come uscita. Assicurarsi che la corsia è riempito 5/6 ° con il collagene contenente soluzione di rivestimento preparata in 1.1.1. Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria. Nota: I canali sono parzialmente rivestite per evitare l&#39;accumulo di fibre collagene all&#39;ingresso del canale (vedi la discussione). </li><li> Incubare a 4 ° C per 4 ore o durante la notte in un contenitore umidificato e chiuso. </li><li> Bloccare i canali rivestiti pipettando tampone di bloccaggio (1,0% (w / v) di siero bovino di albumina und 0.1% (w / v) di glucosio in 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) Soluzione salina tamponata (HBS, 0,9% (w / v) di NaCl, pH 7,4) all&#39;altra estremità e marchio come ingresso. Assicurarsi che la corsia è completamente riempito con il tampone bloccante evitando bolle d&#39;aria. </li><li> Tagliare il tubo a parità di lunghezza (12 cm). Utilizzare uno per corsia e collegare ogni tubo con uno spillo. Ad esempio, un esperimento a confronto due condizioni, eseguire in duplice copia richiederà quattro tratti di tubi e quattro perni per essere preparati. </li><li> Risciacquare il tubo con acqua distillata utilizzando una siringa e un ago G 26 o connettori di accompagnamento. </li><li> Saturare il tubo con tampone di bloccaggio. Conservare in un contenitore chiuso e umidificato per almeno 1 ora. </li></ol></li><li> Preparazione della pompa e collettore <ol><li> Risciacquare la pompa e il collettore con acqua distillata, rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Aspirare il tampone bloccante dalla corsia biochip (s) con la punta 10 microlitri fissato all&#39;uscita. Pulire la superficie diil biochip con una polvere di precisione senza strofinare e alcol denaturato per rimuovere impronte e polvere. </li><li> Fissare il biochip su un palco microscopio automatizzato. Se più di una corsia viene utilizzata contemporaneamente in una corsa, collegare l&#39;otto corsie collettore splitter alla presa biochip. Nota: Il collettore splitter otto corsie è un pezzo di hardware (Figura S1) collegato alla pompa e il biochip. Esso consente il funzionamento di tutti (otto) corsie su un biochip o una combinazione di corsie che possono essere operatore definito nel software di accompagnamento disponibile. </li><li> Utilizzare i perni nel tubo di risolverli in entrata biochip. Inserire l&#39;altra estremità del tubo (senza perno) in 1,5 ml provetta conica riempita con HBS. Risciacquare tutti i tubi e loro corsie comunicanti con 1 ml HBS utilizzando la pompa, in modo da eliminare resto tampone bloccante e scarsamente aderente collagene. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di campioni di sangue <ol><li> Raccolta e separazionesangue intero fresco da un volontario sano. 17 <ol><li> Raccogliere i primi millilitri di sangue in un tubo sottovuoto contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) come anticoagulante e utilizzare esclusivamente questo campione per la completa emocromo (CBC) con un analizzatore ematologico automatico. </li><li> Raccogliere un volume di sangue in un anticoagulante adeguato utilizzando tubi evacuati. anticoagulanti standard per esperimenti di camera di flusso sono eparina o irudina quando fibrina formazione non è parte del protocollo di studio e citrato di sodio quando è. Nota: eparina è stato usato come anticoagulante per tutti gli esperimenti descritti nei risultati. Nota: La quantità di sangue dipende dal numero di esperimenti da eseguire. Circa 1 tubo (7 ml) per 3 corsie. </li><li> Posizionare i tubi su un rotatore in attesa di ricostituzione del sangue. Nota: Il test dovrebbe essere completato entro 3 ore di salasso. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 250 g per preparare plasma ricco di piastrine (PRP). Non utilizzare la pausa centrifuga per evitare disturbi del pellet poco compresso. <ol><li> Quando più di un tubo è stato raccolto, unire il sangue in un singolo tubo di centrifugazione conica. Nota: centrifugazione può essere fatto più lentamente o meno lungo, a seconda della resa PRP e &quot;contaminazione&quot; differenziale cellulare preferito. </li></ol></li><li> Rimuovere e gettare la PRP e buffy coat cedendo globuli rossi concentrati con poche piastrine. Nota: la conta piastrinica nella frazione di globuli rossi al sacco è 13 ± 5 x 10 3 per ml (media ± SD, n = 12), in media, nelle nostre mani. </li></ol></li><li> Ricostituzione del sangue <ol><li> Scongelare gruppo sanguigno AB (Rhesus D negativo) plasma a 37 ° C per 5 min e 20 sec per 4 ml. </li><li> Determinare l&#39;ematocrito dei globuli rossi concentrati preparati in 2.1.5 utilizzando un analizzatore ematologico automatico. </li><li> Determinare la concentrazione di piastrine nella banca del sangue preparato concentrato piastrinico that saranno utilizzati per ricostituire la frazione di globuli rossi sopra. </li><li> Calcolare il volume di globuli rossi concentrati e concentrato piastrinico che consentiranno di ottenere il 40% di ematocrito e 250 x 10³ piastrine / ml in un campione di 1 ml. Nota: Altri titoli bersaglio di cellule possono essere fissate in modo arbitrario, a seconda del protocollo di studio. </li><li> Trasferimento imballato globuli rossi e il plasma in una nuova provetta utilizzando una punta della pipetta tagliata e aggiungere delle piastrine concentrato fino a raggiungere un volume di campione di 1 ml. Nota: a seconda delle variabili studiate, la frazione di plasma deve essere uguale in tutti i campioni ricostituiti perché plasma ha una notevole influenza sul tasso di formazione di trombi. Per esempio, ripetuti di congelamento-scongelamento o plasma presi da donatori diversi o in differenti anticoagulanti può influenzare il risultato. </li><li> Mescolare il sangue ricostituito con cura capovolgendo ed eseguire un CBC. </li><li> Preparare un campione di controllo &quot;vuoto&quot;, in cui viene sostituito il volume della frazione piastrinicodallo stesso volume di 0,9% (m / v) di cloruro di sodio in acqua per determinare la concentrazione di piastrine endogeni (cioè piastrine bancari non sangue) nel sangue ricostituito utilizzando un CBC. </li></ol></li><li> etichettatura <ol><li> Pipettare 1 ml ricostituito sangue in una provetta contenente 1 ml 5 mM calceina AM (5 mM concentrazione finale). Nota: Altri coloranti cellulari possono essere utilizzati 14. </li><li> Mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Incubare per 5 min a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 3. perfusione Assay <ol><li> Fuoco l&#39;obiettivo sulle fibre di collagene aderito al fondo delle corsie. Idealmente, utilizzare le impostazioni differenziale contrasto interferenziale (DIC) a contrasto di fase o per questa strategia messa a fuoco. Seleziona &#39;Z corrente impostato per le regioni di piastrelle selezionate&#39; nel software esperimento per correggere digitalmente gli Z-posizioni selezionate. </li><li> Selezionare una regione di interesse (ROI) in corsia (xy) nel software esperimento del microscope che verrà registrato durante l&#39;esperimento. Nota: Il ROI può essere qualsiasi superficie arbitrariamente scelto all&#39;interno di una corsia di perfusione. Si consiglia di non analizzare formazione di trombi vicino al ingresso e l&#39;uscita di una corsia in modo da evitare effetti collaterali del profilo portata variabile in quella regione, anche se questo è relativamente piccola. La superficie ROI deve contenere un numero significativo di piastrine o trombi per consentire il livellamento del segnale. In questo protocollo il ROI è un aggregato digitalmente cucita di tre immagini uguali dimensioni side-by-side conseguente 0,62 millimetri 2 al centro della lunga corsia 2 cm. </li><li> Miscelare i campioni con cura capovolgendo e posizionare questi accanto al biochip sul palcoscenico automatizzato. </li><li> Posizionare il tubo che è collegato con l&#39;ingresso del biochip in provette contenenti i campioni ematici ricostituiti. </li><li> Avviare la pompa a 50 dyne / cm 2 (o altre sollecitazioni di taglio a piacere) per quei canali legati alla Provettecontenente i campioni di sangue ricostituiti utilizzando il software della pompa. Nota: Altri sollecitazioni di taglio possono essere usati. </li><li> Registrazione di immagini ogni 15 secondi per 5 minuti in tempo reale utilizzando il software di acquisizione e l&#39;esperimento del microscopio. Nota: altre serie tempo può essere utilizzato a seconda del set-up sperimentale. Nota: Generalmente usiamo un ingrandimento 100X (obiettivo 10X e 10X lenti), ma superiore (o inferiore) ingrandimento può essere facilmente utilizzato come alternativa. </li></ol> 4. Lavare Out <ol><li> Lavare tutti i tubi attaccato alla presa e collegato al collettore multicanale o pompa con acqua distillata, seguito da ipoclorito di sodio (candeggina) 0,5% (v / v) ed infine 0,1 M NaOH in acqua. Scartare il tubo appuntato verso l&#39;ingresso del biochip come rifiuti pericolosi. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Determinare cinetica di crescita trombo con il software di analisi delle immagini. I seguenti comandi sono specifici per ZEN2012. <ol&gt; <li> Aprire il plug-in di analisi dell&#39;immagine per determinare la copertura della superficie delle piastrine. </li><li> Impostare la soglia di fluorescenza nella Analizzare scheda interattiva per definire l&#39;intensità dei pixel che si correla con un segnale positivo, vale a dire di una targhetta aderito o piastrine aderenti. </li><li> Usare Creare tabelle per generare automaticamente un foglio di calcolo che conterrà le superfici separate (in micron 2) di quegli &quot;oggetti&quot; che contengono pixel con un segnale tra le soglie selezionate. Questa operazione viene eseguita per ogni punto. Nota: Una volta che le soglie di fluorescenza sono stati scelto, il software di analisi rileva automaticamente &quot;oggetti&quot; nel campo che soddisfano i criteri. Questi oggetti sono trombi, piccoli aggregati piastrinici o piastrine singole e coprono un numero di pixel. Ogni oggetto è elencata nel foglio di calcolo a parte. </li><li> Salvare questi fogli di calcolo in formato XML e aprirli in un programma di foglio di calcoloper ulteriori calcoli. </li><li> Totale aree della superficie degli oggetti selezionati per sommatoria e dividere il risultato per la superficie totale del campo di misura (micron 2). Questo produrrà la copertura della superficie relativa (%). Farlo per ogni punto di tempo. </li><li> Tracciare queste coperture superficiali in funzione del tempo di perfusione e calcolare la pendenza mediante regressione lineare, ottiene il cinetica di crescita trombo di quella particolare condizione. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Esperimenti camera di flusso microfluidici sono un ottimo strumento per studiare la funzione delle piastrine nel sangue che scorre e sono utilizzate per valutare l&#39;emostasi in vitro in diversi contesti sperimentali. Nonostante scarsa standardizzazione interlaboratorio 9, dimostriamo che all&#39;interno del nostro laboratorio la variazione sperimentale è accettabile. Questo permette di confrontare in modo affidabile campioni (appaiati) all&#39;interno di un determinato studio. Questo è stato conva...

Emostasi richiede l&#39;attività combinata e regolata di cellule, proteine, ioni e tessuti in un contesto spazio-temporale limitato 1. Attività incontrollata può portare a emorragia o trombosi e morbilità o mortalità in uno spettro di disturbi legati alla coagulazione del sangue. Un esperimento camera di flusso microfluidica è una tecnica impegnativa che imita emostasi in vitro. Questo approccio permette di indagine della complessa interazione di processi che prendono parte a emostasi con un ruolo di primo piano per le piastrine del sangue. A seguito di danno vascolare, le piastrine aderiscono alle proteine ​​della matrice sottoendoteliale esposto (glico) per prevenire la perdita di sangue. Dopo l&#39;adesione, piastrine attivano e aggregate in risposta automatiche e segnalazione paracrina che alla fine porta alla formazione di una rete di piastrine, stabilizzata da fibrina e conseguente fermo, avvolti trombo 2 sigillatura. A differenza di molti altri test di funzionalità piastrinica, rienzementi con camere di flusso tengono conto del parametro fisico del flusso sanguigno e quindi l&#39;influenza della reologia sulle cellule e biomolecole 3,4 partecipanti. esperimenti camera di flusso hanno generato intuizioni punto di riferimento in emostasi e trombosi variando i parametri chiave che influenzano emostatico (sub) processi tra cui i profili matrice adesiva, reologia e di flusso, composizione cellulare, la presenza di tossine o farmaci, forza ionica e molti altri. Negli ultimi due decenni, bassa produttività esperimenti camera di flusso che richiedono grandi volumi di campione (10-100 ml) si sono evoluti per camere di microfluidica spesso costituite da piccole camere a piatti paralleli e tra le moderne tecnologie per la perfusione di sangue intero in condizioni di parete di taglio a controllo 5. Microscaling ha notevolmente aumentato il throughput test soprattutto perché la configurazione hardware è semplificato ed è richiesto meno (del sangue) del volume, rendendo l&#39;esperimento più accessibile e versatiLe. Per esempio, il sangue da piccoli animali da laboratorio può ora essere utilizzato senza dover sacrificare animali. I campioni di sangue di topi geneticamente modificati hanno quindi aiutato l&#39;identificazione di molecole chiave che promuovono o inibiscono emostasi e in nuove intuizioni fondamentali 6. Laboratori di ricerca specializzati spesso usano ancora camere a flusso su misura, ad esempio, da polidimetilsilossano (PDMS) 7 che polimerizza su stampi litografate che può essere blueprinted da un software. La camera risultante è poco costoso, monouso e può essere facilmente smontato per l&#39;analisi post hoc. Inoltre, in pratica qualsiasi progettazione di navi, comprese le biforcazioni o curve strette può essere costruito su comando. Questo vantaggio è anche il suo lato negativo in quanto la standardizzazione era già il problema principale con gli esperimenti camera di flusso, e PDMS su misura le camere non hanno aiutato questo. In cima a questa particolare questione, rivestimento (condizioni), sonde fluorescenti, anticoagulante, temperaturaeratura e ora tra il campionamento e l&#39;analisi sono tutti poco standardizzati 8. La standardizzazione di queste variabili è impegnativo, ma comunque atti a consentire un confronto dei risultati tra laboratori. Questo argomento è il principale soggetto della Società Internazionale sulla Trombosi e Emostasi in sottocomitato scientifico e standardizzazione su Biorheology 9,10. concentrati piastrinici (PC) sono trasfusi in pazienti affetti da varie malattie che causano trombocitopenia e / o sanguinamento. Ma piastrine in PC sono noti per desensibilizzare, soprattutto in funzione del tempo di memorizzazione 11, un processo di degrado legato all&#39;invecchiamento e comunemente indicato come lesione stoccaggio delle piastrine. A volte si afferma che tali piastrine ripristinare in circolazione una volta trasfuse 12, ma la prova di questo è scarsa. Inoltre, la funzionalità delle piastrine che compongono un PC non è normalmente testato perché il rapporto tra tali analisi eefficacia terapeutica o profilattica non è chiaro 13. camere di flusso microfluidica offrono un mezzo per indagare la funzione piastrinica in PC per ottimizzare la catena di manipolazioni tra raccolta e rilascio. Si tratta di un potente strumento di ricerca per (appaiati) il confronto diretto dei PC, come abbiamo precedentemente pubblicati 14,15 ed è descritto qui.

<table><tbody><tr><td>Tubo vacutainer BD con EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>provetta vacutainer BD con eparina</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>provetta vacutainer BD con citrato di sodio</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin Tubo di sangue</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Ago per prelievo di sangue con supporto premontato</td></tr><tr><td>Puntali per pipette 100-1.000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Provetta 5 ml</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Salviette di precisione</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Nominato in Figura S1 A come 'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>Tubo</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Denominato in Figura S1 B come "Tubo monouso"</td></tr><tr><td>Aghi Vena8</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Denominato in Figura S1 B come "Pin"</td></tr><tr><td>Connettori per cavi di ingresso singolo di biochip</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Denominato in Figura S1 B come "Tubo riutilizzabile" e "Splitter"</td></tr><tr><td>Scatola umidificata</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Software pompa microfluidica</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Collagene nativo del tendine equino (tipo I) La soluzione isotonica di glucosio per diluire il collagene è integrata</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata HEPES (HBS)</td><td>preparazione in casa</td> preparazione <td>in casa</td><td>10 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanusolfonico acido (HEPES) soluzione salina tamponata (0,9% (p/v) NaCl, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Tampone bloccante</td><td>in casa preparazione in casa preparazione</td> in <td>casa</td><td>1,0% (p/v) albumina sierica bovina e 0,1% (p/v) glucosio in HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sonde molecolari</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina 10%</td><td>in casa preparazione</td><td>in casa preparazione</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M NaOH</td><td>in casa preparazione</td><td>in casa preparazione</td><td></td>in casa</tr><tr><td>Alcool denaturato</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>con Multiflow8. Nominato in Figura S1 A come 'Pump' e 'Manifold'Microscopio</td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>dotato di un colibrì-LED e di una telecamera CCD ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Software microscopio&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Analizzatore ematologico</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore piastrinico</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Incubazione a bagnomaria</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Marca</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Roller</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di aggancio sterile</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante per tubi</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic flusso camere con sangue ricostituito al modello emostasi e piastrine transfusion<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Le piastrine del sangue preparate per la trasfusione perdono gradualmente la funzione emostatica durante la conservazione. La funzione piastrinica può essere studiata utilizzando una varietà di esperimenti in vitro (indiretti), ma nessuno di questi è completo come le camere a flusso microfluidico. In questo protocollo, la ricostituzione del sangue fresco trombocitopenico con le piastrine conservate viene utilizzata per simulare la trasfusione di piastrine. Successivamente, il campione ricostituito viene perfuso in camere a flusso microfluidico che imitano l'emostasi su proteine della matrice subendoteliale esposte. Gli effetti della donazione di sangue, del trasporto, della separazione dei componenti, della conservazione e dell'inattivazione dei patogeni possono essere misurati in disegni sperimentali accoppiati. Ciò consente un confronto affidabile dell'impatto che ogni manipolazione nella preparazione dei componenti del sangue ha sull'emostasi. I nostri risultati dimostrano l'impatto dei cicli di temperatura, delle velocità di taglio, della concentrazione piastrinica e della durata di conservazione sulla funzione piastrinica. In conclusione, questo protocollo analizza la funzione delle piastrine della banca del sangue e questo aiuta in ultima analisi nell'ottimizzazione della catena di elaborazione, compresa la flebotomia, il trasporto, la preparazione dei componenti, la conservazione e la trasfusione.

Per dimostrare la variazione intra-saggio, tre identici campioni di sangue intero sono stati ricostituiti perfusi simultaneamente su superfici di collagene rivestito (Figura 1). Ciò ha determinato un coefficiente di variazione del 8,7%. Questa statistica suggerisce accettabile intra-saggio e la variazione intralaboratorio permettendo il confronto affidabile tra i campioni relativi. L&#39;entrata della camera d...

La trasfusione piastrinica e l'emostasi sono state modellate utilizzando la ricostituzione del sangue e camere a flusso microfluidico per studiare la funzione delle piastrine della banca del sangue. I dati dimostrano le conseguenze della lesione da accumulo piastrinico sull'emostasi, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di simulare in vitro la trasfusione di piastrine e testarla mediante l’emostasi su collagene, con flusso idrodinamico e microscopia in tempo reale. I pazienti con trombocitopenia vengono trattati con concentrati piastrinici conservati. Il nostro metodo mira a rispondere a domande fondamentali nel campo della trombosi e dell’emostasi, con particolare attenzione alla qualità e alla funzionalità di tali concentrati piastrinici conservati.Il valore aggiunto di questa tecnica consiste nel mimare il flusso sanguigno, tenendo così in considerazione gli effetti reologici sulle cellule e sulle biomolecole coinvolte. Il metodo attuale valuta l'adesione delle piastrine al collagene. Tuttavia, può essere applicato anche ad altri tessuti adesivi, inclusi la placca aterosclerotica, le cellule endoteliali o specifiche proteine della matrice come il fattore di Von Willebrand e il fibrinogeno.Iniziare preparando il biochip. Vortexare e diluire un rapporto di uno a 20 il collagene stock nella soluzione di glucosio isotonica del produttore, ottenendo una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Successivamente, pipettare 0,8 microlitri nei canali di un nuovo biochip monouso.Riempire tutte le corsie da un lato del chip e contrassegnare questo lato come estremità di uscita. Quindi ispezionare il chip per assicurarsi che ciascuna corsia sia riempita per 5/6 con la soluzione e che non siano presenti bolle d'aria. Successivamente, incubare il chip a quattro gradi Celsius per quattro ore oppure tutta la notte in un contenitore chiuso e umidificato.In seguito, bloccare i canali codificati pipettando il buffer di blocco nell'altra estremità dei canali. Quindi, per ogni canale, tagliare dei pezzi di tubo lunghi 12 centimetri e fissare un perno a ciascun pezzo di tubo in modo da poterli collegare al biochip. Sciacquare i pezzi di tubo con acqua distillata utilizzando una siringa e un connettore.Quindi, saturarli con buffer bloccante e sigillarli in un contenitore umidificato per almeno un'ora. Successivamente, preparare la pompa e il collettore. Per prima cosa, risciacquare la pompa e il collettore con acqua distillata per rimuovere eventuali bolle d'aria.Successivamente, collegare il biochip al supporto del microscopio automatico. Inserire un'estremità dei tubicini in una provetta da 1,5 millilitri riempita con HBS, quindi collegarli all'altra estremità agli ingressi del biochip. Inserire i perni del collettore nelle uscite del biochip.Quindi, risciacquare il sistema con HBS utilizzando la pompa. In questo modo verrà rimossa qualsiasi traccia residua di buffer bloccante o di collagene scarsamente aderente. In questo modo si completano i preparativi della camera di flusso.Iniziare raccogliendo prelievi di sangue recenti da volontari sani in un tubo conico da centrifuga. Centrifugare il campione per circa 15 minuti a 250 G. Non utilizzare il freno, poiché potrebbe disturbare la fase inferiore poco compatta. Rimuovere e scartare il plasma ricco di piastrine e il buffy coat.Conservare i globuli rossi concentrati contenenti il minor numero possibile di piastrine, per preparare il sangue re costituito. Ora, iniziare a scongelare quattro millilitri di plasma di gruppo AB a 37 gradi Celsius per cinque minuti e venti secondi. Nel frattempo, determinare l'ematocrito dei globuli rossi concentrati preparati mediante un analizzatore ematologico automatico.Quindi, determinare la concentrazione di piastrine in un concentrato piastrinico preparato da banca del sangue da utilizzare per la ricostituzione del sangue intero. Calcolare i volumi necessari per un millilitro di sangue ricostituito con un ematocrito del 40% e 250.000 piastrine per microlitro. Ora, utilizzando una punta di pipetta tagliata, trasferire i volumi richiesti di globuli rossi, plasma e concentrato piastrinico alla concentrazione desiderata e a un volume finale di un millilitro.Mescolare il sangue ricostituito con inversioni delicate ed eseguire un emocromo completo. Successivamente, prendere un tubo da microcentrifuga preparato contenente Calcein AM e aggiungere un millilitro di sangue ricostituito. Mescolare il sangue con il colorante mediante inversioni delicate.Quindi, incubare il sangue ricostituito per cinque minuti a 37 gradi celsius. Nel software, selezionare la regione di interesse nel canale di perfusione. Concentrarsi sulle fibre di collagene aderenti al fondo dei canali a un ingrandimento di 100x.In via ideale, utilizzare contrasto di fase o contrasto a interferenza differenziale. Selezionare l'opzione Imposta corrente Z per le regioni selezionate a riquadri per fissare digitalmente le posizioni Z selezionate. La messa a fuoco ottica prima della perfusione dovrebbe essere sull'amelo-blasto collagene, ma ciò può risultare difficoltoso.Un'alternativa consiste nell'impostare il fuoco del microscopio sui primi piastrine aderenti. Ora, mescolare delicatamente i campioni e posizionarli accanto al biochip. Successivamente, inserire il tubo collegato al canale osservato nel sangue ricostituito.Successivamente, utilizzando il software di controllo della pompa, applicare una pressione di 50 dyne per centimetro quadrato per spostare il campione di sangue nel canale e avviare l'esperimento. Durante l'esperimento, acquisire immagini ogni 15 secondi per cinque minuti. Determinare la cinetica di crescita del trombo mediante software di analisi delle immagini.In questo caso viene utilizzato Zen 2012. Iniziare aprendo l'analisi dell'immagine del plugin per determinare la copertura superficiale delle piastrine. Impostare la soglia di fluorescenza nella scheda analisi interattiva per definire l'intensità dei pixel che corrisponde a un segnale positivo, proveniente dalle piastrine aderenti.Quindi, utilizzare la funzione di creazione tabelle per generare automaticamente un foglio elettronico contenente un elenco delle aree superficiali dei segnali positivi per ciascun punto temporale. Salvare questi fogli elettronici in formato XML e aprirli in un programma di fogli di calcolo per ulteriori calcoli. In ogni punto temporale, calcolare l'area superficiale totale degli oggetti selezionati ed esprimere questo valore come percentuale della superficie coperta.Quindi, tracciare i dati in funzione del tempo di perfusione e calcolare la pendenza mediante regressione lineare. Questo modella la cinetica di crescita del trombo per quella particolare condizione sperimentale. Tre campioni identici di sangue intero ricostruito sono stati perfusi contemporaneamente su superfici rivestite di collagene.Ciò ha determinato un coefficiente di variazione dell'8,7%, suggerendo una variabilità accettabile all'interno del saggio e all'interno del laboratorio per il confronto dei test. La trasfusione è stata simulata ricostituendo il sangue con il componente carente. Sono state effettuate diverse ricostituzioni con concentrazioni decrescenti di piastrine.Come previsto, conteggi piastrinici più bassi hanno determinato un'adesione minore in funzione del tempo di perfusione. Successivamente, è stato analizzato l'effetto della riduzione della temperatura dopo il prelievo del sangue e durante la perfusione. Si è osservato che i trombi si formavano più lentamente quando il sangue veniva raffreddato a temperatura ambiente.Rispetto a un campione mantenuto a 37 gradi Celsius per tutta la durata dello studio. Durante la circolazione, le piastrine si legano ai siti di lesione del vaso in condizioni di elevato stress di taglio della parete. Come previsto, la variazione della velocità di taglio nelle camere di flusso microfluidiche ha modificato l'adesione piastrinica totale.Queste condizioni modificano anche la cinetica di formazione del trombo. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti con camera di flusso microfluidica utilizzando sangue ricostituito per testare la qualità e la funzionalità dei concentrati piastrinici conservati. Questa tecnica può essere eseguita in circa sette ore.Gli esperimenti con camera di flusso microfluidica hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo della trasfusione di piastrine per esplorare l'impatto di variabili legate alla donazione, alla preparazione e alla conservazione. Un esempio rilevante è l'inattivazione dei patogeni. Abbiamo fornito l'esempio di un solo soggetto sperimentale.Tuttavia, variazioni nella concentrazione di calcio, nello sforzo di taglio e nei rivestimenti superficiali possono essere utilizzate per affrontare diverse domande di ricerca. Analogamente a questo procedimento, altre misurazioni in camere di flusso microfluidiche possono essere eseguite per rispondere a ulteriori quesiti. Ad esempio, le prestazioni delle piastrine conservate nella coagulazione sotto flusso.

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