Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

L'obiettivo generale di questo metodo RAPID è migliorare il rendimento degli ormoni peptidici endogeni da misurare nel sangue umano. Il metodo RAPID è stato recentemente sviluppato per l'uso in ratti ed è adatto anche per il sangue umano. Il metodo RAPID aumenta il rendimento e consente la rilevazione della forma molecolare corretta del peptide endogeno.

Il metodo RAPID è facile da usare. Tuttavia, il metodo RAPID richiede più tempo ed è più costoso rispetto al campionamento ematico standard. Pertanto, potrebbe essere più applicabile in un contesto di ricerca.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la diluizione tempestiva dei campioni e l'eluzione sono di grande importanza per garantire un livello adeguato di peptidi. Raccogliere il sangue venoso in un orario standardizzato dopo un digiuno notturno da una vena dell'avambraccio e processarlo secondo le procedure standard o con il metodo RAPID.

Informare i soggetti di non sottoporsi a esercizio fisico né a fumare prima del prelievo di sangue. Per la lavorazione standard, raccogliere il sangue in provette contenenti EDTA refrigerate e centrifugare entro 10 minuti a 3000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il soprannatante e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione mediante radioimmunoanalisi.

Per l'elaborazione RAPID, diluire immediatamente il sangue da uno a dieci in tampone RAPID freddo di ghiaccio. PH tre virgola sei, contenente zero virgola uno moli di ammonio acetato, zero virgola cinque moli di cloruro di sodio e inibitori enzimatici.

Entro 10 minuti, centrifugare il campione RAPID a 3000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il soprannatante utilizzando una pipetta. Successivamente, caricare le cartucce per cromatografia con acetonitrile al 100% a 10 millilitri al minuto. Dopo l'equilibrazione con acido trifluoroacetico allo 0,1%, o TFA.

Caricare il surnatante del campione RAPID a un flusso costante di un millilitro al minuto, utilizzando una pompa per siringa. Dopo aver lavato le cartucce con tre millilitri di TFA 0,1% a dieci millilitri al minuto, eluire lentamente il campione RAPID con due millilitri di acetonitrile al 70% contenente TFA 0,1% a due millilitri al minuto. Asciugare i campioni eluiti mediante centrifugazione in vuoto e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione mediante radioimmunosaggio.

Reperire peptidi umani marcati radioattivamente con iodio-125. Mantenere i peptidi in forma di polvere fino all'esperimento. Successivamente, diluirli frescamente in acido acetico 0,1%.

Per l'elaborazione standard, immediatamente dopo il prelievo del sangue, trasferire un millilitro di sangue in provette contenenti EDTA refrigerate in un tubo con 50 microlitri di radiofarmaco, contenente da 3.000 a 6.000 CPM. Per l'elaborazione RAPID, trasferire un millilitro di sangue contenente EDTA in un tubo contenente nove millilitri di tampone RAPID e 500 microlitri di radiofarmaco contenenti da 30.000 a 60.000 CPM. A causa della diluizione da uno a dieci, utilizzare un volume di radiofarmaco 10 volte superiore per l'elaborazione RAPID.

Immediatamente dopo aver applicato i diversi passaggi del metodo RAPID, valutare il recupero dei peptidi marcati radioattivamente utilizzando un contatore a scintillazione gamma. Non essiccare i campioni mediante centrifugazione sotto vuoto e non conservarli a meno 80 gradi Celsius. Per la misurazione, trasferire il soprannatante in provette adatte all'inserimento nel contatore gamma.

E valutare i conteggi al minuto. Misurare l'intero sopranatante nei campioni standard. Nei campioni RAPID, analizzare un decimo del volume totale per ottenere una quantità comparabile di radioetichetta utilizzata.

Come standard al 100%, utilizzare due campioni con 50 microlitri di peptide marcati radioattivamente con iodio 125 che non subiscono alcuna lavorazione. Misurare l'attività radioattiva di tutti i campioni contemporaneamente. Prelievo di sangue in provette contenenti EDTA refrigerate, quindi trasferire un millilitro in provette contenenti 200 microlitri di acil-ghrelina marcata radioattivamente, con un'attività compresa tra 15.000 e 20.000 CPM, per la lavorazione standard.

Per l'elaborazione RAPIDA, trasferire un millilitro di sangue in un tubo contenente nove millilitri di tampone rapido e 200 microlitri di acil ghrelina radiomarcata contenente da 15.000 a 20.000 CPM. Successivamente, elaborare i campioni come in precedenza. Per ulteriori analisi mediante HPLC in fase inversa, caricare direttamente i campioni su una colonna C18 stable bond equilibrata al 17% di acetonitrile in acqua addizionata con 0,1% di TFA.

Dopo cinque minuti di equilibrazione, utilizzare un gradiente dal 17 al 40% di acetonitrile per eluire il campione in 40 minuti, a un flusso di un millilitro al minuto. Raccogliere frazioni di un millilitro ogni minuto e analizzare la radioattività mediante un contatore a scintillazione gamma. In un esperimento separato, caricare direttamente sulla colonna 200 microlitri di acil ghrelina radiomarcata contenente da 15.000 a 20.000 CPM ed eseguire la HPLC come in precedenza.

Per il radioimmunodosaggio, scongelare i soprannatanti congelati e la polvere liofilizzata a temperatura ambiente. Immediatamente prima del radioimmunodosaggio, risospendere i campioni RAPID essiccati in acqua bidistillata, in base al volume originale del plasma. Valutare kisspeptina e grelina totale, nonché grelina acilata, utilizzando radioimmunodosaggi commerciali seguendo i protocolli del produttore.

Utilizzare provette in borosilicato che consentano una formazione stabile della palette. Nel primo giorno, incubare i campioni con il buffer per il saggio e con l'anticorpo primario, nel diluizione indicata dal produttore, per un periodo di 24 ore. Nel secondo giorno, aggiungere il tracciante iodio 125, vortexare e incubare per un periodo di 24 ore.

Al terzo giorno, aggiungere il reagente precipitante, vortexare e incubare come raccomandato dal produttore. Successivamente, centrifugare i tubi a 3.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere i soprannatanti e contare l'attività radioattiva nelle provette, utilizzando un contatore gamma.

Calcolare la grelina desacilata come differenza tra la grelina totale e la grelina acilata. Valutare il rapporto tra grelina acilata e grelina desacilata dividendo la grelina acilata per quella desacilata per ciascun campione individuale. Se possibile, elaborare tutti i campioni in un unico lotto, per evitare variabilità tra i saggi.

La lavorazione rapida del sangue aumenta il rendimento di peptidi marcati con iodio 125 nel sangue umano, rispetto alla lavorazione standard del sangue. Dopo la lavorazione standard del sangue, il recupero di peptidi marcati radioattivamente è variato dal 48% al 68% per nove peptidi. La lavorazione RAPID ha migliorato il rendimento in tutti i peptidi marcati con iodio 125, con un recupero compreso tra il 71% e il 98%. Qui viene mostrato il profilo di eluizione dell’acil-ghrelina marcata con iodio 125 nel sangue umano dopo lavorazione standard o RAPID del sangue.

Dopo l'elusione della ghrelina marcata con iodio 125, si osserva la posizione prevista a seguito della procedura RAPID. Mentre dopo la procedura standard, si osserva un picco precedente, probabilmente corrispondente alla ghrelina desacilata.

Questo ha rappresentato una degradazione del 62% del peptide. L'elaborazione rapida del sangue migliora il rapporto tra ghrelina acilata e desacilata rispetto all'elaborazione standard. Dopo l'elaborazione RAPID, il rapporto tra ghrelina acilata e desacilata nel sangue di soggetti con peso normale era di uno a tre.

Rispetto a uno a 23 seguenti la lavorazione standard del sangue. Risultati simili sono stati osservati in condizioni di anoressia e obesità. La lavorazione rapida del sangue determina un aumento dei livelli ematici endogeni di kisspeptina rispetto alla lavorazione standard.

In soggetti anoressici e con peso normale, i livelli circolanti di kisspeptina endogena erano significativamente più elevati dopo il trattamento RAPID rispetto alla lavorazione standard. La differenza non ha raggiunto la significatività in condizioni di obesità. Una volta padroneggiata ed eseguita correttamente, questa tecnica può essere completata in meno di un'ora.

Questo metodo è particolarmente importante quando la concentrazione prevista del peptide è bassa o le differenze tra i gruppi sono ridotte. Non può essere fornita una raccomandazione generale valida per tutti i peptidi. Il potenziale beneficio per ciascun peptide dovrebbe essere testato una volta all'inizio.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori di diversi settori per esplorare la resa e, cosa più importante, la forma molecolare corretta degli ormoni peptidici endogeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare il metodo RAPID per l'elaborazione del sangue negli esseri umani.