Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

L'obiettivo generale di questo metodo RAPID è quello di migliorare la resa degli ormoni peptidici endogeni da misurare nel sangue umano. Il metodo RAPID è stato recentemente introdotto per l'uso nei ratti ed è adatto anche per l'uso nel sangue umano. Il metodo RAPID migliora la resa e consente di rilevare la corretta forma molecolare del peptide endogeno.

Il metodo RAPID è facile da usare. Tuttavia, il metodo RAPID richiede più tempo e costa più tempo rispetto al prelievo di sangue standard. Quindi potrebbe essere più applicabile nell'ambito della ricerca.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto la diluizione tempestiva dei campioni e l'eluizione sono di grande importanza per garantire un corretto livello di peptidi. Raccogliere il sangue venoso a un tempo standardizzato dopo un digiuno notturno da una vena dell'avambraccio. E lavorare secondo le procedure standard o il metodo RAPID.

Istruire i soggetti a non fare esercizio fisico o fumare prima del prelievo di sangue. Per la lavorazione standard, raccogliere il sangue in provette contenenti EDTA refrigerato e centrifugare entro 10 minuti a 3000 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione mediante test radioimmunologico.

Per la lavorazione RAPID, diluire immediatamente il sangue da uno a 10, in un tampone RAPID ghiacciato. PH tre virgola sei, contenente zero virgola un molare amoniumasitato. Cloruro di sodio a cinque molari virgola zero e inibitori enzimatici.

Entro 10 minuti, centrifugare il campione RAPID a 3000 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante utilizzando una pipetta. Successivamente, caricare le cartucce per cromatografia con il 100% di actitonitrile, a 10 millilitri al minuto. Dopo l'equilibratura con trifluoroacetico allo 0,1% o TFA.

Caricare con il surnatante del campione RAPID, a una velocità costante di un millilitro al minuto, utilizzando una pompa a siringa. Dopo aver lavato le cartucce con tre millilitri di TFA allo 0,1%, a 10 millilitri al minuto, eluire lentamente il campione RAPID con due millilitri di acetonitrile al 70% contenente TFA allo 0,1%, a due millilitri al minuto. Asciugare i campioni eluiti utilizzando la centrifugazione sotto vuoto e conservarli a meno 80 gradi Celsius, fino a un'ulteriore elaborazione mediante test radioimmunologico.

Ottenere iodio: 125 peptidi umani radiomarcati. Conservare i peptidi in polvere fino all'esperimento. Quindi diluire nuovamente in acido acetico allo 0,1%.

Per il trattamento standard, subito dopo il prelievo di sangue, in provette contenenti EDTA refrigerato, trasferire un millilitro di sangue in una provetta con 50 microlitri di radiomarcatore, contenente da 3000 a 6000 CPM. Per l'elaborazione RAPID, trasferire un millilitro di sangue contenente EDTA in una provetta contenente nove millilitri di tampone RAPID e 500 microlitri di radiomarcatore contengono da 30.000 a 60.000 CPM. A causa della diluizione da uno a 10, utilizzare un volume di radiomarcatore 10 volte superiore per l'elaborazione RAPID.

Subito dopo aver applicato le diverse fasi del metodo RAPID, valutare il recupero dei peptidi marcati radioattivamente utilizzando un contatore gamma. Non asciugare i campioni mediante centrifugazione sottovuoto e conservare a meno 80 gradi Celsius. Per la misurazione, trasferire il surnatante in tubi che si inseriscono nel contatore gamma.

E valuta i conteggi al minuto. Misurare l'intero surnatante in campioni standard. Nei campioni RAPID, analizzare un decimo del volume totale per ottenere una quantità comparabile di radiomarcatore utilizzato.

Come standard al 100%, utilizzare due campioni con 50 microlitri di peptide radiomarcato di iodio 125 che non subiscono elaborazione. Misurare la radioattività di tutti i campioni contemporaneamente. Prelevare il sangue, in provette refrigerate contenenti EDTA, e trasferire un millilitro in provette contenenti 200 microlitri di acilgrelina radiomarcata, contenenti da 15.000 a 20.000 CPM, per il trattamento standard.

Per l'elaborazione RAPID, trasferire un millilitro di sangue in una provetta contenente nove millilitri di tampone rapido e 200 microlitri di acilgrelina radiomarcata contenente da 15.000 a 20.000 CPM. Successivamente, elaborare i campioni come prima. Per ulteriori analisi mediante HPLC in fase inversa, caricare direttamente i campioni su una colonna C18 a legame stabile bilanciata in acetonitrile al 17% in acqua integrata con TFA allo 0,1%.

Dopo cinque minuti di equilibratura, utilizzare un gradiente dal 17 al 40% di acetonitrile, per eluire il campione in 40 minuti, a un millilitro al minuto. Raccogli frazioni di un millilitro al minuto e analizza la radioattività utilizzando un contatore gamma. In un esperimento separato, caricare 200 microlitri di acilgrelina radiomarcata contenente da 15.000 a 20.000 CPM direttamente sulla colonna ed eseguire l'HPLC come prima.

Per il dosaggio radioimmunologico, scongelare i surnatanti congelati e la polvere essiccata sottovuoto a temperatura ambiente. Immediatamente prima del dosaggio radioimmunologico, sospendere nuovamente i campioni secchi di RAPID in acqua bidistillata, in base al volume originale di plasma. Valutare la kisspeptina e la grelina totale, nonché l'acilgrelina, utilizzando saggi radioimunoassays commerciali secondo i protocolli del produttore.

Utilizzare tubi in borosilicato che consentano una formazione stabile della tavolozza. Il primo giorno, incubare i campioni con il tampone di analisi e l'atibody primario nella diluizione fornita dal produttore per un periodo di 24 ore. Il secondo giorno, aggiungere il tracciante di iodio 125, agitare e incubare per un periodo di 24 ore.

Il terzo giorno, aggiungere il reagente precipitante, il vortice e incubare come raccomandato dal produttore. Quindi, centrifugare le provette a 3.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere i surnatanti e contare la radioattività nelle tavolozze, utilizzando un contatore gamma.

Calcola la desacilgrelina, come la differenza tra la grelina totale meno l'acilgrelina. Valuta il rapporto acil, desacil-grelina, immergendosi acilla per desacil-grelina per ogni singolo campione. Se possibile, elaborare tutti i campioni in un unico lotto, per evitare la variabilità tra i saggi.

Il trattamento rapido del sangue aumenta la resa di peptidi radiomarcati con iodio 125 nel sangue umano, rispetto al trattamento del sangue standard. Dopo il trattamento standard del sangue, il recupero dei peptidi radiomarcati variava dal 48% al 68% in nove peptidi. L'elaborazione RAPIDA ha migliorato la resa in tutti i peptidi marcati con iodio 125, con un recupero compreso tra il 71% e il 98%Di seguito è mostrato il profilo di eluizione dell'acilgrelina marcata con iodio 125 nel sangue umano dopo l'elaborazione del sangue standard o RAPIDA.

Dopo l'elaborazione RAPID, la grelina marcata con iodio 125 è fuoriuscita nella posizione prevista. Mentre dopo la procedura standard, è stato osservato un picco precedente. Probabilmente corrispondente alla desacilgrelina.

Ciò rappresentava una degradazione del 62% del peptide. L'elaborazione rapida del sangue migliora il rapporto acil, desacilgrelina rispetto all'elaborazione standard. Dopo l'elaborazione RAPID, il rapporto acil, desacilgrelina nel sangue di soggetti di peso normale era di uno a tre.

Rispetto a uno a 23 dopo il trattamento del sangue standard. Risultati simili sono stati osservati in condizioni anoressiche e obese. L'elaborazione rapida del sangue provoca un aumento dei livelli ematici di kisspeptina endogena rispetto all'elaborazione standard.

Sia nei soggetti anoressici che in quelli normopeso, i livelli di kisspeptina endogena circolante erano significativamente più alti dopo RAPID rispetto al trattamento standard. La differenza non ha raggiunto la significatività in condizioni di obesità. Una volta padroneggiata ed eseguita correttamente, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora.

Questo metodo è particolarmente importante quando la concentrazione prevista del peptide è bassa o le differenze tra i gruppi sono piccole. Non è possibile fornire una raccomandazione generale per i peptidi. Il potenziale beneficio per ciascun peptide dovrebbe essere testato una volta all'inizio.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori in diversi campi per esplorare la resa e, soprattutto, la corretta forma molecolare degli ormoni peptidici endogeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare il metodo RAPID per l'elaborazione del sangue negli esseri umani.