Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di mappare la posizione dei ribonucleotidi incorporati a livello di risoluzione di un singolo nucleotide e di quantificare il numero di ribonucleotidi presenti nel DNA mitocondriale umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti l'integrità del DNA, i meccanismi di replicazione del DNA, i meccanismi di riparazione del DNA e il modo in cui i difetti in uno qualsiasi di questi meccanismi causano la malattia. Il vantaggio principale di questo metodo è che sia la posizione che il numero di ribonucleotidi incorporati nel DNA mitocondriale possono essere determinati in un singolo esperimento.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul contenuto di ribonucleotidi nel DNA mitocondriale umano, può anche essere applicato per studiare il DNA nucleare e il contenuto di ribonucleotidi nei genomi di sequenza di altri organismi modello. In questo esperimento viene utilizzato il DNA genomico precedentemente isolato dalle cellule HeLa e descritto nelle sezioni due e tre del protocollo di testo. Per digerire il DNA, mescolare accuratamente quanto segue in una provetta per microfuge.

Un microgrammo di DNA, cinque microlitri di tampone 10X 3.1, un microlitro di HincII e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 50 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine del digest, aggiungere 1,8 volumi di microsfere paramagnetiche a ciascun campione, accuratamente miscelate mediante pipettaggio, e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Posizionare le provette su una griglia magnetica per cinque minuti per pellettare le perline, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 150 microlitri di etanolo al 70% per circa 30 secondi, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio con 200 microlitri di etanolo al 70% per altri 30 secondi.

Asciugare i campioni a temperatura ambiente per circa 15-20 minuti. Quindi, rimuovere le provette dal rack magnetico. Eluire ogni pellet in 45 microlitri di tampone di eluizione, miscelato mediante pipettaggio accurato, e incubare per cinque minuti.

Pellettare le perle sul rack magnetico e trasferire 45 microlitri di ciascun campione di DNA in una nuova provetta. A ogni 45 microlitri di DNA isolato o purificato, aggiungere cinque microlitri di idrossido di potassio a tre molari o cinque microlitri di cloruro di potassio a tre molari, creando un volume totale di 50 microlitri. Le otto reazioni sono riassunte in questa tabella.

Incubare in un forno di ibridazione a 55 gradi Celsius per due ore, quindi incubare i campioni su ghiaccio per cinque minuti. Precipitare il DNA aggiungendo 10 microlitri di acetato di sodio a tre molari a pH 5,2 e 125 microlitri di etanolo freddo al 100% e incubare su ghiaccio per cinque minuti. Pellettare il DNA centrifugando a 21.000 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Scartare il surnatante e lavare ogni pellet di DNA con 250 microlitri di etanolo freddo al 70%, centrifugare di nuovo e scartare il surnatante. Lasciare asciugare il pellet nel tubo aperto per circa cinque-10 minuti, fino a quando il fluido visibile non è evaporato. Infine, aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione e lasciare sciogliere il pellet di DNA a temperatura ambiente per 30 minuti.

Iniziare questa procedura preparando la miscela di reazione per ciascun campione come miscela master. Per ogni campione, aggiungere 2,5 microlitri di tampone di reazione polinucleotide chinasi 10x T4, 2,5 microlitri di ATP e un microlitro di tre polinucleotide chinasi primaria fosfatasi-meno T4. Trasferire 19 microlitri di ciascun campione di DNA in una nuova provetta da 200 microlitri e denaturare a 85 gradi Celsius in un termociclatore per tre minuti.

Quindi, raffreddare i campioni di DNA con ghiaccio e aggiungere sei microlitri della miscela di reazione preparata a ciascun campione. Incubare le miscele di reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, seguite da 65 gradi Celsius per 20 minuti per fermare la reazione. Purificare il DNA utilizzando perle paramagnetiche, come dimostrato in precedenza, ma eluire con 14 microlitri di tampone di eluizione.

Preparare in anticipo la miscela di reazione come miscela master, contenente quanto segue per ogni campione. Cinque microlitri di tampone di reazione 10x T4 RNA ligasi, cinque microlitri di esamemmina cobalto(III)cloruro, 0,5 microlitri di oligonucleotide ARC140, 0,5 microlitri di ATP e 25 microlitri di PEG 8000 al 50%. Mescolare bene pipettando.

Trasferire 13 microlitri di ogni DNA purificato in una nuova provetta da 200 microlitri e denaturare a 85 gradi Celsius in un termociclatore per tre minuti. Raffreddare il DNA con ghiaccio, quindi aggiungere 36 microlitri di miscela di reazione a ciascun campione, miscelare pipettando e centrifugare brevemente. Aggiungere un microlitro di RNA ligasi T4 a ciascuna reazione, mescolare pipettando e centrifugare brevemente.

Incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per una notte. Quando la legatura del DNA a singolo filamento è completa, purificare il DNA come dimostrato in precedenza, ma utilizzare 0,8 volumi di perline paramagnetiche e pellettare le perle per 10 minuti. Eluire in 20 microlitri di tampone di eluizione e trasferire 20 microlitri di ciascun campione di DNA in una nuova provetta da 200 microlitri.

Ripetere la purificazione con 0,8 volumi di perle paramagnetiche ed eluire in 14 microlitri di tampone di eluizione. Per ogni campione, preparare la miscela di reazione come miscela master composta da due microlitri di tampone di reazione 10x T7 DNA polimerasi, due microlitri di ARC76/77, due microlitri di dNTP e 0,8 microlitri di BSA. Trasferire 12,8 microlitri di DNA purificato in una nuova provetta da 200 microlitri e denaturare a 85 gradi Celsius in un termociclatore per tre minuti.

Raffreddare il DNA con ghiaccio, quindi aggiungere 6,8 microlitri di miscela di reazione a ciascun campione, miscelare pipettando, centrifugare brevemente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere 0,4 microlitri di DNA polimerasi T7 a ciascuna reazione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver purificato il DNA con perle paramagnetiche, eluire in 11 microlitri di tampone di eluizione.

Per iniziare l'amplificazione PCR, preparare la miscela di reazione separatamente per ciascun campione in una nuova provetta da 200 microlitri composta da 7,5 microlitri di ARC49, 7,5 microlitri di primer indice unico e 25 microlitri di miscela pronta per l'avvio a caldo 2X. Aggiungere 10 microlitri di campione di DNA a ogni reazione. Amplifica la libreria utilizzando le seguenti condizioni.

Denaturare a 95 gradi Celsius per 45 secondi, seguito da 18 cicli di 98 gradi Celsius per 15 secondi, 65 gradi Celsius per 30 secondi, 72 gradi Celsius per 30 secondi e terminare con un allungamento finale a 72 gradi Celsius per due minuti. Tenere i campioni a quattro gradi Celsius dopo l'amplificazione. Purificare le librerie come descritto nel protocollo di testo ed eluire in 20 microlitri di tampone TE.

Determina la qualità e la dimensione media dei frammenti di ciascuna libreria utilizzando un sistema di elettroforesi digitale. Vengono mostrati i risultati rappresentativi di profili di libreria adeguati dopo il trattamento con idrossido di potassio o cloruro di potassio. Dopo aver calcolato la concentrazione di ciascuna libreria, estrarre quantità molari uguali di un massimo di 24 librerie amplificate con diversi primer indice per il sequenziamento come descritto nelle sezioni nove e 10 del protocollo di testo.

Aggiungere il tampone TE a un volume finale di 25 microlitri e una concentrazione di 10 nanomolari. Dopo il sequenziamento, eseguire l'analisi dei dati bioinformatici come specificato nella sezione 11 del protocollo di testo. Questi grafici mostrano le letture riassunte in tutti i siti HincII nel DNA mitocondriale umano a filamento leggero e a filamento pesante dopo il trattamento con cloruro di potassio.

Circa il 70% di tutti i cinque terminali primari rilevati localizzati nei siti di taglio, dimostrando l'elevata efficienza della digestione HincII. Il trattamento delle librerie con idrossido di potassio per idrolizzare il DNA nei ribonucleotidi incorporati riduce il numero di letture a HincII a circa il 40%Il numero relativo di letture nel DNA mitocondriale e nucleare rivela differenze nella copertura e illustra l'importanza di un'appropriata normalizzazione per rimuovere la distorsione del filamento. La normalizzazione dei conteggi delle letture in HincII fornisce una misura quantitativa del numero di ribonucleotidi per genoma mitocondriale sul filamento pesante o leggero.

Le letture dopo il trattamento con idrossido di potassio per ciascun ribonucleotide, normalizzate alla composizione della sequenza di ciascun filamento, mostrano un rapporto diverso da uno, indicando una distribuzione non casuale delle letture e suggerendo un pattern ribonucleotidico distinto e un'elevata qualità della libreria. Normalizzando le letture nei siti dei ribonucleotidi incorporati a quelle nei siti HincII, così come al contenuto di nucleotidi del genoma, genera una misura quantitativa di quanti di ciascun ribonucleotide è incorporato per 1.000 basi complementari. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in due giorni se viene eseguito correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il DNA altamente intatto ed evitare di introdurre rotture a doppio filamento durante la preparazione della libreria. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi simili per confermare i dati di quantificazione dei ribonucleotidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le librerie per la mappatura e la quantificazione di ribonucleotidi e DNA utilizzando il sequenziamento di nuova generazione.

Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche come l'idrossido di potassio può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare protezioni per gli occhi e guanti.