Name: Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Scopri un metodo per mappare e quantificare i ribonucleotidi nel DNA mitocondriale umano con risoluzione a singolo nucleotide. Questa tecnica combina digestione enzimatica e idrolisi alcalina per analizzare l'integrità del DNA.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Swedish Research Council (www.vr.se) concede a ARC (2014-6466 e la Fondazione svedese per la ricerca strategica (www.stratresearch.se) ad arco (ICA14-0060). Chalmers University of Technology ha fornito sostegno finanziario per MKME durante questo lavoro. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

questo protocollo è descritto nella Figura 1 e include l'isolamento di gDNA, digestione con enzimi di restrizione per essere in grado di quantificare il numero di ribonucleotidi, trattamento con alcali per idrolizzare fosfodiesterico di ribonucleotidi inglobato il gDNA, la fosforilazione delle estremità gratuito a 5 minuti-OH, ssDNA legatura delle schede, seconda sintesi di filo e l'amplificazione di PCR prima sequenziamento.
 1. adattatori e indice primer <ol><li>ARC49 ottenere, oligonucleotidi ARC140, ARC76/77, adattatore e ARC78-ARC107 primer di indice (Vedi tabella 1). 
	Nota: Oligonucleotidi devono essere purificato di HPLC. ARC76/77 sono ordinati come duplex.</li>
	<li>Soluzioni di riserva preparare 100 µM di ogni oligonucleotide in tampone Tris-EDTA (TE) (Vedi la Tabella materiali) e conservare a -20 ° C.</li>
	<li>Preparare 10 µM soluzioni di ARC67/77 e 2 µM di primer ARC49 e indice diluendo in tampone di eluizione (EB; si veda la Tabella materiali). Conservare a-20 ° C.</li>
</ol> 2. Crescita e raccolta di cellule <ol><li>cellule HeLa crescere in 70 mL Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale in un matraccio di Spinner 250 mL a 37 ° C.</li>
	<li>Contare il numero di cellule e raccogliere 5 x 10 6 cellule in un tubo da 50 mL, centrifugare per 5 minuti a 200 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>Lavare le cellule con 20 mL 1X PBS, centrifugare per 5 minuti a 200 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>Congelare i pellet a-20 ° C o continuare con la purificazione del DNA.</li>
</ol> 3. Purificazione del DNA e la quantificazione <ol><li>purificare gDNA mediante estrazione del fenolo-cloroformio come descritto di seguito.
	<ol><li>Risospendere le cellule in 2 mL di tampone di lisi (Vedi la Tabella materiali) ed incubare per 30 min a 42 ° C su un blocco di riscaldamento. 
		Attenzione: Il buffer di lisi contiene componenti pericolosi. Soluzione di SDS è irritante, proteinasi K sensibilizzanti, irritanti e tossici. Indossare indumenti protettivi e guanti.</li>
		<li>Dividere il campione in due provette da 2 mL e aggiungere 1 volume (V) di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1). 
		Attenzione: Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico è tossico, mutageno, corrosivi e pericolosi per gli ambienti acquatici. Utilizzare in una cappa, indossare indumenti protettivi e guanti e gettare nei rifiuti speciali fenolo-cloroformio.</li>
		<li>Mix di inversione per 30-60 s e centrifugare per 5 min 15.000 x g a temperatura ambiente. 
		Nota: Non non vortice DNA per evitare di introdurre le rotture del filo casuale, che falserebbero i risultati.</li>
		<li>Trasferire la fase acquosa superiore ad un nuovo tubo di 2 mL ed aggiungere 1 V di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1).</li>
		<li>Mix di inversione e centrifugare per 5 min a 15.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferire la fase acquosa superiore per tubo un nuovo 2 mL e aggiungere 20 µ l NaCl (5 M) e isopropanolo freddo di 1 V. 
		Attenzione: Isopropanolo è infiammabile, irritante e tossico. Conservarlo in un ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme.</li>
		<li>Mix di inversione e incubare per almeno 1 h a -20 ° C.</li>
		<li>Centrifugare per 20 min 15.000 x g, 4 ° C e scartare surnatante.</li>
		<li>Pellet di DNA di lavaggio con etanolo 70% freddo 200 µ l, centrifugare per 20 min a 15.000 x g a 4 ° C ed eliminare il surnatante. 
		Attenzione: etanolo al 70% è infiammabile e irritante. Tenere la soluzione di lavoro a-20 ° C, altrimenti negozio in ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme.</li>
		<li>Asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente per 20-25 min.</li>
		<li>Pellet di DNA sciogliere in 100 µ l TE buffer e piscina i campioni in uno tubo.</li>
	</ol></li> <li>Concentrazione di DNA quantitate utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA secondo produttore &#39; s specifiche (Vedi la Tabella materiali). 
	Nota: Utilizzare un reagente di quantificazione di dsDNA, perché spettrofotometrica quantificazione di DNA può essere influenzata da fenolo residua.</li>
	<li>Store DNA a-20 ° C o continuare con il trattamento di HincII.</li>
</ol> 4. Trattamento HincII e idrolisi alcalina mix <ol><li>Digest 1 µ g di DNA in una reazione contenente 5 µ l di tampone 10x 3.1, 1 µ l (10 U) HincII e privo di nucleasi H 2 O ad un volume finale di 50 µ l. 
	Nota: Per ottenere le condizioni ottimali per la legatura, seconda sintesi di filo e l'amplificazione di PCR, esso può essere necessario aumentare la quantità di DNA input se si prevede che il DNA contiene un numero molto basso di ribonucleotidi. Allo stesso modo, può essere necessario diminuire l'ingresso del DNA se il numero di ribonucleotidi è molto alto.</li>
	<li>Incubare per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>HincII purificare trattati DNA con perline paramagnetici. 
	Nota: Tenere il tubo coperchi aprire nei passaggi seguenti per non disturbare il pellet aprendo i tubi.
	<ol><li>Aggiungere 1,8 V di perline paramagnetici a ogni campione, mescolare accuratamente pipettando e incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Utilizzare un rack magnetico per pellet le perline per 5 min, poi rimuovere ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 150 µ l di etanolo al 70% (temperatura ambiente) per circa 30 s quindi rimuovere e scartare il supernatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 200 µ l di etanolo al 70% (temperatura ambiente) per circa 30 s, quindi rimuovere e scartare il surnatante. 
		Nota: Etanolo residuo può essere rimosso con una pipetta di 10 µ l. Le goccioline possono essere filate giù brevemente in anticipo.</li>
		<li>a secco i campioni a temperatura ambiente per circa 15-20 min. 
		Nota: L'ora esatta dipende dal volume di perline e la forma del pellet, pertanto i pellet devono essere controllati visivamente.</li>
		<li>Rimuovere i tubi dal rack magnetico ed eluire pellet in 45 µ l EB, mix pipettando attentamente.</li>
		<li>Incubare per 5 minuti poi a pellet le perline sul rack magnetico e utilizzare 45 µ l di DNA purificato nel passaggio 4.4.</li>
	</ol></li> <li>Aggiungere 5 µ l di KOH (3 M) o KCl (3 M) per il creazione di un volume totale di 50 µ l di DNA. 
	Attenzione: 3 soluzione di KOH M è corrosivo. Indossare indumenti protettivi e guanti.</li>
	Forno <li>Incubare per 2 ore a 55 ° C in un'ibridazione seguita da 5 min su Ice. 
	Nota: Si raccomanda di eseguire il trattamento di KOH in un forno piuttosto che un blocco di riscaldamento per mantenere un riscaldamento uniforme del tubo ed evitare la condensa presso il coperchio.</li>
	<li>DNA precipitare aggiungendo 10 µ l di sodio acetato (3 M, pH = 5.2) e 125 µ l etanolo 100% freddo. Incubare in ghiaccio per 5 min. 
	Attenzione: etanolo al 100% è infiammabile e irritante. Archiviare in un ventilato, indossare indumenti protettivi e guanti e tenere lontano da fiamme.</li>
	<li>Pellet gDNA mediante centrifugazione a 21.000 x g, 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante.</li>
	Pellet <li>Wash DNA con 250 µ l freddo 70% EtOH, centrifugare a 21.000 x g, 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante. 
	Nota: Per rimuovere le goccioline, il tubo può essere filato giù brevemente nuovamente e surnatante può essere rimosso con una pipetta di 10 µ l.</li>
	<li>Asciugare il pellet in un tubo aperto per circa 5-10 minuti fino a quando tutto il liquido visibile evaporato.</li>
	<li>Si dissolve pellet di DNA lasciate in 20 µ l EB per 30 min a temperatura ambiente.</li>
</ol> 5. fosforilazione fine a 5 minuti <ol><li>preparare la miscela di reazione per ogni campione in anticipo controesistente di 2,5 µ l 10 x 2,5 µ l ATP (10 mM), 1 della chinasi di polinucleotide T4 di 3 ´-fosfatasi-minus µ l (10 U) e tampone di reazione della chinasi di polinucleotide T4.</li>
	<li>Trasferire 19 µ l di ogni DNA del campione in una nuova provetta da 200 µ l e denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler.</li>
	<li>Cool DNA campioni su ghiaccio e aggiungere 6 µ l della miscela di reazione per ogni campione.</li>
	<li>Miscele di reazione Incubare a 37 ° C per 30 min e fermata la reazione incubando i campioni a 65 ° C per 20 min.</li>
	<li>Purificare il DNA come descritto al punto 4.3, utilizzando 1.8 V di perline paramagnetici ma eluire in 14 µ l EB.</li>
</ol> 6. ssDNA legatura <ol><li>preparare la miscela di reazione per ogni campione in anticipo composto da 0,5 µ l ATP (2 mM), 5 µ l 10 x tampone di reazione ligasi T4 RNA, 5 µ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µ l ARC140 (100 µM) e 25 µ l 50% PEG 8000. Mix ben pipettando. 
	Attenzione: CoCl 3 (NH 3) 6 è cancerogeno, sensibilizzanti e pericolosi per l'ambiente acquatico. Indossare indumenti protettivi e guanti.</li>
	<li>Trasferire 13 µ l di DNA purificato da 5.5 un passo ad un nuovo tubo di 200 µ l e denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler.</li>
	<li>Raffreddare il DNA sul ghiaccio e 36 µ l di miscela di reazione per ogni campione, mescolare pipettando e spin giù brevemente.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l (10 U) di T4 RNA ligasi ad ogni reazione, Miscelare pipettando e spin giù brevemente.</li>
	<li>Incubare i campioni a temperatura ambiente nella notte scura.</li>
</ol> 7. Sintesi secondo-filo <ol><li>purificare legato del DNA come descritto al punto 4.3, ma utilizzare 0,8 V di perline paramagnetici, pellet le perline per 10 min ed eluire in 20 µ l EB. 
	Nota: A causa della maggiore viscosità della miscela di reazione di legatura, il primo passo d'appallottolamento è prolungato.</li>
	<li>Trasferire 20 µ l di campione di DNA in una nuova provetta PCR 200 µ l. Ripetere il passaggio di purificazione mediante 0,8 V di paramagnetici perline seguendo il produttore &#39; s specifiche ed eluire in 14 µ l EB.</li>
	<li>Preparare il mix di reazione per ogni campione in anticipo che consiste di 2 µ l di tampone di reazione 10 di polimerasi del DNA del x T7, 2 µ l ARC76/77 (2 µM), 2 µ l dNTP (2 mM) e 0,8 µ l BSA (1 mg/mL).</li>
	<li>µ L trasferimento 12,8 purificato del DNA ad un nuovo tubo di 200 µ l, denaturare per 3 min a 85 ° C in un termo-cycler.</li>
	<li>Raffreddare il DNA sul ghiaccio e 6,8 µ l di miscela di reazione per ogni campione, mescolare pipettando, rallentare brevemente e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>0,4 µ l (4 U) T7 DNA polimerasi in ogni reazione ed incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Purificare il DNA come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetiche ed eluire in 11 µ l EB.</li>
</ol> 8. L'amplificazione di PCR e la quantificazione di biblioteca tubo di <ol><li>preparare il mix di reazione per ogni campione in un nuovo 200 µ l in anticipo costituito da 7,5 µ l ARC49 (2 µM), 7,5 µ l indice primer (2 µM, unico per ogni campione) e 25 µ l 2 x avviamento a caldo miscela pronta.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di campione di DNA per ogni reazione. Amplificare la libreria utilizzando le seguenti condizioni: denaturare a 95 ° C per 45 s, seguiti da 18 cicli di 98 ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s, terminando con un allungamento finale a 72 ° C per 2 min. Hold campioni al 4 ° C dopo amplificazione.</li>
	<li>Purificare librerie come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetici ed eluire in 20 µ l di tampone TE.</li>
	<li>Quantitate librerie utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA, secondo il produttore &#39; s specifiche (Vedi la Tabella materiali).</li>
	<li>Conservare i campioni a-20 ° C o continuare con analisi biblioteca.</li>
</ol> 9. Analisi della libreria e Pooling <ol><li>determinano la qualità di ogni libreria e stimare la dimensione del frammento media utilizzando un sistema di elettroforesi digitale. 
	Nota: La dimensione del frammento medio è valutato stimando dove l'area sotto la curva dell'elettroferogramma è dimezzato, trascurando le cime da marcatori. Risultati rappresentativi di profili adatti biblioteca dopo trattamento KOH o KCl sono riportati nella Figura 2A.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione (nM) delle librerie come: 
	/(p*650) (c/10 3)] * 10 9 dove c è la concentrazione della libreria in ng / µ l e p è la dimensione del frammento medio in bp, come valutato in 9.1.</li>
	<li>Piscina molare quantità uguali di fino a 24 biblioteche amplificati con gli iniettori di indice diverso per il sequenziamento. Aggiungere buffer di TE ad un volume finale di 25 µ l e alla concentrazione di 10 nM. 
	Nota: A seconda del numero di librerie per eseguire il pooling, la quantità di DNA da ogni libreria è regolato. Se sono stati rilevati dimeri dell'iniettore nel passaggio 9.1 come un picco distinto di circa 130 bp, il volume finale della piscina biblioteca può superare 25 µ l, perché la fase di purificazione viene ripetuta come descritto al punto 4.3, utilizzando 0,8 V di perline paramagnetici, e DNA è eluito in 25 µ l TE buf Fer.
	<ol><li>Determinare la concentrazione di piscina biblioteca nuova utilizzando un reagente di quantificazione di dsDNA secondo produttore &#39; s specifiche e la media dimensione di picco come descritto sopra. Procedere al sequenziamento e analisi dei dati (articoli 10 e 11).</li>
	</ol></li></ol> 10. Sequenziamento <ol><li>eseguire sequenziamento accoppiato-fine 75-base su librerie pool 12.</li></ol>
 11. analisi dei dati <ol><li>Trim tutte le letture per rimuovere sequenze adattatore, filtrare per qualità e leggere lunghezza. 
	Nota: Questo può essere fatto utilizzando cutadapt 1.2.1 20 con il comando ' cutadapt -f fastq - incontro-lettura-i caratteri jolly - tranquillo -m 15 - q 10 - un NNNNNNN &#60; FILE &#62;', dove NNNNNNN viene sostituito con la sequenza effettiva adattatore e &#60; FILE &#62; è sostituito con il nome del file fastq.</li>
	<li>Rimuovere accoppiamenti di letture che sono stati eliminati nel passaggio precedente utilizzando script personalizzati.</li>
	<li>Allineare Mate 1 dei restanti paia ad un indice contenente la sequenza di tutti gli oligonucleotidi utilizzati per la preparazione di biblioteca (ad es., utilizzando Bowtie 0.12.8 21 e la riga di comando Opzioni - m1-v2). Scarta tutte le coppie con successo allineamenti.</li>
	<li>Allineare coppie rimanenti al genoma di riferimento organismo utilizzando Bowtie con la riga di comando Opzioni - v2 -X 10000..--meglio.</li>
	<li>Mappa legge che spaziano tra la molecola mitocondriale inizio e fine allineando Mate 1 di tutte le coppie non allineate (utilizzando Bowtie con la riga di comando Opzioni - v2).</li>
	<li>Determinare il conteggio delle 5 ´-estremità per tutti gli allineamenti di fine singolo o coppia. Spostare la posizione di questi da una base a Monte sulla posizione dove erano l'idrolizzato ribonucleotidi.</li>
	<li>Esportazione dati dal file di bowtie formato in un formato di file di bedgraph utilizzando script personalizzati per la visualizzazione in comune browser genoma. Normalizzare le letture per ogni ciocca per letture al milione.</li>
	<li>Utilizzando i conteggi e la posizione del file di bedgraph, fare riferimento la sequenza del genoma di organismo per determinare l'identità di incorporated ribonucleotidi. 
	Nota: Per il genoma mitocondriale umano si legge dalle regioni 16.200-300 e 5.747-5.847 per ogni filo dovrebbe essere esclusi dal momento che queste regioni contengono molti 5 ´-estremità libere non correlate all'incorporazione del ribonucleotide di DNA polimerasi γ.</li>
	<li>Dividere il totale letture, non tra cui letture a undici siti HincII, con il numero medio di letture al sito HincII per ottenere il numero di ribonucleotidi per rottura del singolo filo, (cioè il numero di ribonucleotidi per molecola mitocondriale).</li>
</ol>

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<li>Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+embedded+ribonucleotides+and+other+noncanonical+nucleotides+using+emRiboSeq+and+EndoSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq.</a> Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui presentiamo una tecnica per contemporaneamente mappare e quantificare ribonucleotidi in gDNA e mtDNA in particolare, la semplice introduzione di fenditura del DNA in siti specifici di sequenza del genoma come un'aggiunta al protocollo stabilito HydEn-seq. Mentre questo studio si concentra sul mtDNA umano, originariamente il metodo HydEn-seq è stato sviluppato in Saccharomyces cerevisiae, che illustrano la traduzione del metodo a altri organismi12,16.
Per ottenere risultati affidabili ottenuti da questo approccio, si devono sottolineare alcuni passaggi critici: (A) dato che schede di sequenziamento legare a tutti i disponibili a 5 minuti-end, è fondamentale lavorare con DNA altamente intatto. DNA deve essere isolato e biblioteche dovrebbero essere effettuate preferibilmente immediatamente dopo isolamento del DNA o il DNA può essere conservato a-20 ° C. Non si consiglia di conservare il DNA in frigo per un lungo periodo o di congelare e scongelare ripetutamente. (B) per generare librerie adatte con questo metodo, è fondamentale eseguire il trattamento di KOH del DNA in un forno di incubazione, piuttosto che un blocco di riscaldamento, garantendo il riscaldamento omogeneo dell'intero campione e idrolisi quantitativa. (C) Inoltre, è fondamentale per controllare la qualità delle librerie prima di pooling e sequenziamento. Il DNA devono essere quantificati e analizzati utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzata per garantire un'adeguata quantità di DNA, delle biblioteche confermare dimensioni frammento appropriato e controllare i dimeri dell'iniettore.
Per un'analisi di dati significativi, è anche importante notare che il valore informativo di questo metodo dipende da controlli appropriati per valutare sfondo conteggi e pregiudizi sequenza o filo. Abbiamo regolarmente raggiungere un'efficienza di mappatura in campioni di KCl di quasi il 70% quando solo digerire con l'endonucleasi specifiche di sequenza (Figura 2B, pannelli a sinistra). Inoltre, è importante confermare che il trattamento di endonucleasi non colpisce il totale rilevamento di ribonucleotidi incorporati confrontando HincII trattati e non trattati di campioni (Figura 3B). In questi esperimenti, abbiamo usato HincII per introdurre tagli specifici del sito, anche se potrebbero essere utilizzati anche altri enzimi di restrizione ad alta fedeltà.
Il protocollo potrebbe essere adattato per studiare altri tipi di lesioni del DNA che possono essere elaborati a 5 ´-fosfato o a 5 minuti-OH finisce. La precisione dei risultati dipende la specificità dell'elaborazione e richiede controlli adeguati (ad es., wild-type o non trattati) per la verifica. Inoltre, quando si adatta questo metodo ad altre applicazioni o per l'utilizzo con altri organismi, si dovrebbe considerare che il metodo nel suo attuale setup richiede circa 1 µ g di DNA che viene elaborato in una raccolta. Poiché il numero delle estremità è dipenda dal numero di ribonucleotidi incorporati, che varia a seconda dell'organismo o mutante, campioni tra cui un numero inferiore di ribonucleotidi richiederebbe più di input del DNA per generare un numero sufficiente di estremità nella costruzione della libreria successivi. Allo stesso modo, se i campioni di DNA hanno un numero molto più elevato di ribonucleotidi, sarebbe anche necessario usando il DNA meno input per ottenere condizioni ottimali per la legatura, seconda sintesi di filo e l'amplificazione di PCR. È interessante nota che la costruzione della libreria come descritto in questo protocollo generato anche dati che riguardano il genoma nucleare (come visualizzato in Figura 2D) e solo l'analisi dei dati si è concentrata sul mtDNA. Ciò illustra che più grandi genomi con frequenze ribonucleotide moderatamente inferiori sono anche catturati da questo metodo.
Quando si considera questo metodo, si devono tener conto di alcune limitazioni: Sebbene questo metodo dovrebbe, in teoria, essere applicabile a qualsiasi organismo, un genoma di riferimento adeguato è necessario per l'allineamento di letture. Inoltre, i risultati ottenuti dal nostro protocollo rappresentano le letture da un gran numero di cellule. Modelli di incorporazione ribonucleotide specifici di un sottoinsieme delle cellule non possono essere identificati da questo approccio. Se ribonucleotidi sono mappati in genomi più grandi con un numero molto basso di ribonucleotidi, e può essere difficile discriminare ribonucleotidi da Nick casuale e pertanto sono necessari controlli appropriati.
Il metodo che descriviamo qui, estende le tecniche disponibili in vivo come HydEn-Seq16, ribosio-Seq17, Pu-Seq18o emRiboSeq19. Questi approcci approfittare della sensibilità dei ribonucleotidi incorporato per alcaline o trattamento di RNasi H2, rispettivamente, che impiegano sequenziamento di nuova generazione per identificare ribonucleotidi genoma, che permette loro mappatura e il confronto delle relativa incorporazione. Fendendo la sequenza di DNA in modo specifico, come descritto in precedenza, oltre a idrolisi alcalina presso ribonucleotidi incorporati, le letture per ribonucleotidi possono essere normalizzate in quei siti di clivaggio, permettendo non solo l'identificazione e la mappatura del ribonucleotidi, ma anche la loro quantificazione per ogni molecola di DNA. L'applicazione della nostra tecnica nel contesto di malattie legate alla replicazione del DNA, riparazione del DNA e TLS potrebbe fornire una più profonda comprensione del ruolo di ribonucleotidi in base dei meccanismi molecolari e l'integrità genomica in generale.

In una cellula eucariotica, la concentrazione di ribonucleotidi (rNTPs) è molto superiore alla concentrazione di deossinucleotidi (dNTPs)1. Polimerasi del DNA di discriminano ribonucleotidi, ma questa discriminazione non è perfetta e, di conseguenza, ribonucleotidi invece di deossinucleotidi possono essere incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA. Ribonucleotidi possono essere i più comuni nucleotidi non canonico incorporati nel genoma2. La maggior parte di questi ribonucleotidi vengono rimosse durante la maturazione del frammento di Okazaki di riparazione per escissione iniziati ribonucleotide RNasi H2 (RER) o da 1 topoisomerasi (rivisto in riferimento3). Ribonucleotidi non possono essere rimosso soggiorno stabilmente incorporati nel DNA2,4 e possono influenzare in modi sia nocivi che benefici (rivisto in ha commentato5). Oltre ad essere in grado di agire come segnali positivi, ad esempio nell'accoppiamento tipo passare in Schizosaccharomyces pombe6 e marcatura filo del DNA nascente durante la mancata corrispondenza di riparazione (MMR)7,8, ribonucleotidi influenzano la struttura9 e stabilità del DNA circostante a causa del gruppo di idrossile 2 di loro ribosio10, con conseguente instabilità di stress e genoma replicativa11. L'abbondanza di ribonucleotidi in DNA genomic (gDNA) e la loro rilevanza nella replica e meccanismi di riparazione, nonché le implicazioni per la stabilità del genoma, dare motivo per indagare il loro avvenimento preciso e la frequenza in maniera genoma.
Attività di RNasi H2 non è stato trovato in mitocondri umani e ribonucleotidi pertanto vengono rimossi in modo non efficiente in DNA mitocondriale (mtDNA). Parecchie vie sono coinvolti nella fornitura di nucleotidi di mitocondri umani e per studiare se le dispersioni nella piscina del nucleotide mitocondriale causano un elevato numero di ribonucleotidi nel mtDNA umano, abbiamo sviluppato un protocollo per mappare e quantificare questi ribonucleotidi nel mtDNA umano isolato da fibroblasti, cellule HeLa e paziente cella linee12.
Maggior parte degli approcci in vitro (rivisto in ha commentato13) per determinare la selettività di polimerasi del DNA contro rNTPs sono basata su esperimenti inserimento o primer ribonucleotide singola estensione dove rNTPs concorrenti sono inclusi nella reazione mescolare, consentendo l'identificazione o la quantificazione relativa di incorporazione ribonucleotide in breve modelli di DNA. Approcci quantitativi su brevi sequenze possono non riflettere piscine dNTP e rNTP presso le concentrazioni cellulari e pertanto fornire approfondimenti selettività della polimerasi, ma sono di limitata importanza per quanto riguarda interi genomi. È stato dimostrato che la quantità relativa di ribonucleotidi incorporato durante la replica di un modello di DNA più lungo, ad esempio un plasmide, possa essere fruita su un gel di sequenziamento utilizzando dNTP radioattivo e d'idrolizzazione il DNA in un ambiente alcalino14. Inoltre, è stato analizzato gDNA il Southern blot dopo idrolisi alcalina, consentendo filo specifico sondaggio e determinazione dei tassi di assoluta del ribonucleotide incorporazione in vivo15. Questi approcci consentono un confronto relativo della frequenza di incorporazione ma non consegnare spaccato la posizione o l'identità dei ribonucleotidi incorporati. Approcci più recenti per analizzare il contenuto del ribonucleotide gDNA in vivo, come HydEn-Seq16, ribosio-Seq17, Pu-Seq18o emRiboSeq19, approfitta dei ribonucleotidi incorporati sensibilità a alcalini o trattamento di RNasi H2, rispettivamente e impiegano il sequenziamento di nuova generazione per identificare ribonucleotidi genoma. Questi metodi non forniscono spaccato la frequenza assoluta incorporazione della ribonucleotidi rilevati. Aggiungendo il passo di scissione enzimatica specifica sequenza del protocollo HydEn-seq, il metodo che qui descritto convenientemente estende le informazioni acquisite da un approccio di sequenziamento, consentendo la mappatura simultanea e quantificazione di embedded ribonucleotidi12. Questo metodo è applicabile a qualsiasi organismo dato che estratti di DNA altamente intatti possono essere generati e un genoma di riferimento adeguati è disponibile. Il metodo potrebbe essere adattato per quantificare e determinare la posizione di qualsiasi lesione che può essere digerita da una nucleasi e lascia un 5 ´-fosfato o un fine 5 ´-OH.
Per mappare e quantificare ribonucleotidi in DNA genomic, il metodo combina la scissione di un'endonucleasi specifiche di sequenza e idrolisi alcalina generando 5 ´-fosfato finisce in siti in cui si trova la sequenza di riconoscimento specifico per l'endonucleasi e a 5 minuti- OH finisce alle posizioni dove si trovavano ribonucleotidi. Poiché le estremità libere generate successivamente sono legate con adattatori e sequenziati mediante sequenziamento di nuova generazione, è di importanza utilizzare DNA altamente intatto ed evitare la frammentazione casuale durante la preparazione del DNA estrazione e biblioteca. Valutare queste letture normalizzate per la legge presso i siti di fenditura dell'endonucleasi permette una quantificazione simultanea e la mappatura dei ribonucleotidi rilevati. A 5 minuti-estremità libere vengono rilevate in esperimenti di controllo dove l'idrolisi alcalina del DNA viene sostituito dal trattamento con KCl. I dati acquisiti forniscono approfondimenti ribonucleotide posizione e quantità e permette analisi rispetto alla frequenza di contenuto e incorporazione del ribonucleotide.

<table><tbody><tr><td>10x tampone di reazione della chinasi polinucleotidica T4</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone di reazione della RNA ligasi T4</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216L</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>dissolve 1 compressa in H2O fino a un volume finale di 1 L</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>provetta da centrifuga da 50 mL</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (ATP, 10 mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td>diluito con EB a 2 mM</td></tr><tr><td>Kit Agilent DNA 1000 Agilent</td><td>Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>BSA, grado di biologia molecolare (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>diltue con H2O privo di nucleasi a 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Tampone EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td>denominato EB</td></tr><tr><td>CleanPCR perle paramagnetiche</td><td>CleanNA</td><td>CPCR-0050</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di soluzioni di deossinucleotidi (dNTP) (10 mM ciascuna)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>diluito con EB a 2 mM</td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 96 Side</td><td>Thermo Fisher</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 99,5% grado analitico</td><td>Solveco</td><td>1395</td><td>diluire con acqua milliQ al 70% di</td></tr> <tr><td>soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampone pH 8,0 (1 M) sterile BC</td><td>AppliChem</td><td>A6906,0125</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto (III) di esammina (CoCl3(NH3)6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7891-5G</td> si <td>dissolve in H2O senza nucleasi per 10&nbsp; Soluzione M, filtro sterile. ATTENZIONE: cancerogeno, sensibilizzante e pericoloso per l'ambiente acquatico.</td></tr><tr><td>HincII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0103S</td><td>fornito con l'ibridatore NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>HB-1D</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lisi <td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, proteinasi K (200 &micro; g/mL), 1% SDS</td></tr><tr><td>Micro provetta 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Moltiplicare&nbsp; &micro; StripPro provetta da 0,2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.992</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo &ndash; cloroformio &ndash; alcool isoamilico (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>VWR</td><td>26764.232</td> si <td>dissolve in H2O senza nucleasi per 3&nbsp; Soluzione M, filtro sterile</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>VWR</td><td>26668.296</td><td>sciogliere in H2O privo di nucleasi per 3&nbsp; Soluzione M, filtro sterile</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Provette per test Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit per test</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>ATTENZIONE: Contiene componenti infiammabili e tossici</td></tr> Kit per test <tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>ATTENZIONE: Contiene componenti infiammabili e tossici</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata 4K15</td><td>Centrifughe da laboratorio Sigma</td><td>n. 10740</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione SDS, 10%</td> <td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone acetato di sodio, pH 5,2, 3 M (NaAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td>sciogliere in H2O privo di nucleasi per 5&nbsp; Soluzione M, filtro sterile</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi (3' fosfatasi meno)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0236L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligasi 1 (ssRNA ligasi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>fornito con PEG 8000 (50%)</td></tr><tr><td>T7 DNA polimerasi (non modificato)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td>fornito con 10 tamponi di reazione DNA polimerasi T7</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F2.0</td><td>Eppendorf</td><td>5387000013</td><td></td></tr></tbody></table>

mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del dna mitocondriale umano

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Gli approcci di stimare il numero di ribonucleotidi presenti in un genoma stabiliti sono limitati per la quantificazione di ribonucleotidi incorporati utilizzando brevi frammenti sintetici di DNA o plasmidi come modelli e quindi estrapolare i risultati a tutta la genoma. In alternativa, si può stimare il numero di ribonucleotidi presenti in un genoma usando gel alcalino o Southern blot. Approcci più recenti in vivo impiegano sequenziamento di nuova generazione che consente la mappatura del genoma di ribonucleotidi, fornendo la posizione e l'identità di ribonucleotidi incorporati. Tuttavia, non consentono la quantificazione del numero di ribonucleotidi, che sono incorporati in un genoma. Qui descriviamo come contemporaneamente mappare e quantificare il numero di ribonucleotidi, che sono incorporati in umano mitocondriale del DNA in vivo mediante sequenziamento di nuova generazione. Usiamo il DNA altamente intatto e introdurre sequenza specifico doppio filamento interruzioni di digerirlo con un'endonucleasi, successivamente idrolizzazione ribonucleotidi incorporati con alcali. Le estremità generate sono legate con adattatori e queste estremità sono in sequenza su una macchina di sequenziamento di nuova generazione. Il numero assoluto di ribonucleotidi può essere calcolato come il numero di letture all'esterno del sito di riconoscimento per il numero medio di letture presso il sito di riconoscimento per l'endonucleasi specifiche di sequenza. Questo protocollo può anche essere utilizzato per mappare e quantificare gratis nicks nel DNA e permette l'adattamento mappare altri lesioni del DNA che possono essere elaborati a 5 ´-OH estremità o estremità 5 ´-fosfato. Inoltre, questo metodo può essere applicato a qualsiasi organismo, dato che un genoma di riferimento adeguati è disponibile. Questo protocollo fornisce pertanto un importante strumento per studiare la replicazione del DNA, a 5 minuti-fine elaborazione, danno del DNA e riparazione del DNA.

Illustrando la metodologia descritti sopra, rappresentante i dati sono stati generati l'analisi del DNA mitocondriale umano da HeLa cellule12. Figura 2B Mostra il riepilogate letture affatto HincII siti in pesanti (HS) e filo di luce (LS) del mtDNA umano dopo il trattamento di KCl (pannelli a sinistra). Circa 70% di tutti i rilevati 5 ´-End localizzare i siti di taglio, che dimostrano l'alta efficienza della digestione HincII. Trattamento di librerie con KOH per idrolizzare il DNA ribonucleotidi incorporati riduce il numero di letture HincII siti per circa il 40% (Figura 2B, pannelli di destra). Questo è previsto dal momento che un numero elevato di 5 ´-estremità vengono generato presso i siti di incorporazione ribonucleotide ed è indicativo di una sufficiente qualità di biblioteca. Figura 2 illustra la localizzazione e la frequenza di 5 minuti-estremità (verde) dopo letture e trattamento di KCl generati da HydEn-seq (magenta) dopo il trattamento di KOH, rilevazione sia gratuita a 5 minuti-estremità e generato in ribonucleotidi da idrolisi alcalina. A 5 minuti-estremità libere e ribonucleotidi localizzazione al HS del mtDNA umano vengono mostrati nel pannello di sinistra e quelli eseguendo la localizzazione del LS sono mostrati nel pannello di destra. Ai numeri relativi di crude letture presso ribonucleotidi (Figura 2D, pannello superiore) o siti di HincII (pannello inferiore) in HS e LS di mtDNA mostrano, rispettivamente, una copertura più forte 14-fold o 31-fold del LS rispetto il HS, mentre una simile polarizzazione non è stata osservata per DNA nucleare. Questa polarizzazione di filo può essere spiegata con la netta differenza nella composizione di base dei due fili e illustra l'importanza della normalizzazione per letture a HincII siti.
Normalizzando la lettura conta a HincII dà una misura quantitativa del numero di ribonucleotidi al genoma mitocondriale (Figura 3A). Come illustrato in Figura 3B, le letture dopo trattamento di KOH per ogni ribonucleotide normalizzato per la composizione di sequenza di ogni filo Visualizza un rapporto diverso da 1, che indica una distribuzione non casuale di letture suggerendo un ribonucleotide distinti modello e una libreria alta qualità. Tale rapporto viene influenzato dalla digestione precedente con HincII, verificare la specificità di clivaggio dell'enzima. Normalizzare le letture presso i siti di ribonucleotidi incorporati ai siti di clivaggio HincII, come pure ai contenuti del nucleotide del genoma, genera una misura quantitativa di quanti di ogni ribonucleotide sono incorporati per 1.000 basi complementari ( Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
Figura 1: schematico per DNA lavorazione e preparazione di biblioteca. (1) intero genomic DNA viene scisso dalla HincII per la normalizzazione nella successiva quantificazione di ribonucleotidi, generando estremità smussata in siti HincII (freccia nera). (2) il DNA è trattato con KOH per idrolizzare presso siti ribonucleotide, portando a 2, 3 ´-ciclico fosfato (Pentagono rosso) a 3 ´-estremità e gratuito a 5 minuti-OH. (3) a 5 minuti-OH estremità sono fosforilate da T4 polinucleotide chinasi 3 ´-fosfatasi-minus. (4) tutte a 5 minuti-estremità che trasportano un gruppo fosfato sono legate per il oligonucleotide ARC140 di ligasi T4 RNA. (5) il secondo filo è sintetizzato utilizzando T7 polimerasi del DNA e il ARC76-77 oligonucleotidi contenenti sequenze casuali di6 N. (6) la biblioteca è amplificata da una polimerasi di DNA ad alta fedeltà utilizzando ARC49 e uno dei ARC78 di ARC107 primer di indice contenente un codice a barre univoco per multiplexing. (7) a 5 minuti-estremità si trovano tramite sequenziamento accoppiato-fine. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
Figura 2: validazione del metodo. (A) rappresentante elettroferogrammi generato utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzata per determinare la qualità del generato librerie trattate con segnale KOH o KCl. (B) riassunti in siti HincII pesanti (HS) e filo di luce (LS) mtDNA umano dopo KCl (pannelli a sinistra) o trattamento di KOH (pannelli di destra). Circos (C) figura di 5 ´-estremità libere (verde) e da HydEn-Seq (a 5 minuti-estremità libere e ribonucleotidi, magenta) in HS (pannello di sinistra) e mtDNA umano LS (pannello di destra). Picchi sono normalizzate per milioni letture e il picco massimo è regolato per il numero massimo di letture della biblioteca HydEn-seq. (D) riassunti raw legge alla ribonucleotidi (pannello superiore) e HincII siti (pannello inferiore) in pesante (H) e filo di luce (L) nel mtDNA umano (Mito.) o in senso inverso (RV) o avanti (FW) strand in nucleare (Nuc). DNA. Figure B, C e D sono adattate dal riferimento12. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
Figura 3: rappresentante risultati. (A), il relativo numero di ribonucleotidi normalizzata a letture HincII siti per le librerie KOH trattati sul pesante (H) o filo di luce (L). (B) rapporto di identità ribonucleotide alla composizione del genoma mtDNA per KOH trattati (KOH) e HincII spaccati con KOH trattati (HincII + KOH) librerie sul pesante (H) o filo di luce (L) del mtDNA. (C) frequenza Ribonucleotide normalizzato a 1.000 basi complementari per HincII e KOH trattati librerie sul pesante (H) o filo di luce (L) del mtDNA. Figure sono adattati dal riferimento12. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome</td>
			<td colspan="4">Sequenza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>TCT
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/ 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

Tabella 1: oligonucleotidi. Sono elencati gli oligonucleotidi utilizzati per HydEn-segg. Grassetto indica l'indicizzazione. * indica un legame fosforotioato. ARC140 contiene un gruppo amminico a 5 minuti invece di un gruppo di 5 ´-OH, in combinazione con un linker di C6. Questa modifica riduce la formazione di ARC140 concatemeri durante la legatura.

Qui descriviamo un metodo suscettibile di quantificare contemporaneamente e ribonucleotidi Mappa del genoma nel DNA altamente intatto alla risoluzione del singolo-nucleotide, che unisce la scissione enzimatica del DNA genomico con la sua idrolisi alcalina e successivi 5 ´-fine sequenziamento.

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di mappare la posizione dei ribonucleotidi incorporati a livello di risoluzione di un singolo nucleotide e di quantificare il numero di ribonucleotidi presenti nel DNA mitocondriale umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti l'integrità del DNA, i meccanismi di replicazione del DNA, i meccanismi di riparazione del DNA e il modo in cui i difetti in uno qualsiasi di questi meccanismi causano la malattia. Il vantaggio principale di questo metodo è che sia la posizione che il numero di ribonucleotidi incorporati nel DNA mitocondriale possono essere determinati in un singolo esperimento.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul contenuto di ribonucleotidi nel DNA mitocondriale umano, può anche essere applicato per studiare il DNA nucleare e il contenuto di ribonucleotidi nei genomi di sequenza di altri organismi modello. In questo esperimento viene utilizzato il DNA genomico precedentemente isolato dalle cellule HeLa e descritto nelle sezioni due e tre del protocollo di testo. Per digerire il DNA, mescolare accuratamente quanto segue in una provetta per microfuge.Un microgrammo di DNA, cinque microlitri di tampone 10X 3.1, un microlitro di HincII e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 50 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine del digest, aggiungere 1,8 volumi di microsfere paramagnetiche a ciascun campione, accuratamente miscelate mediante pipettaggio, e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.Posizionare le provette su una griglia magnetica per cinque minuti per pellettare le perline, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 150 microlitri di etanolo al 70% per circa 30 secondi, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio con 200 microlitri di etanolo al 70% per altri 30 secondi.Asciugare i campioni a temperatura ambiente per circa 15-20 minuti. Quindi, rimuovere le provette dal rack magnetico. Eluire ogni pellet in 45 microlitri di tampone di eluizione, miscelato mediante pipettaggio accurato, e incubare per cinque minuti.Pellettare le perle sul rack magnetico e trasferire 45 microlitri di ciascun campione di DNA in una nuova provetta. A ogni 45 microlitri di DNA isolato o purificato, aggiungere cinque microlitri di idrossido di potassio a tre molari o cinque microlitri di cloruro di potassio a tre molari, creando un volume totale di 50 microlitri. Le otto reazioni sono riassunte in questa tabella.Incubare in un forno di ibridazione a 55 gradi Celsius per due ore, quindi incubare i campioni su ghiaccio per cinque minuti. Precipitare il DNA aggiungendo 10 microlitri di acetato di sodio a tre molari a pH 5,2 e 125 microlitri di etanolo freddo al 100% e incubare su ghiaccio per cinque minuti. Pellettare il DNA centrifugando a 21.000 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il surnatante e lavare ogni pellet di DNA con 250 microlitri di etanolo freddo al 70%, centrifugare di nuovo e scartare il surnatante. Lasciare asciugare il pellet nel tubo aperto per circa cinque-10 minuti, fino a quando il fluido visibile non è evaporato. Infine, aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione e lasciare sciogliere il pellet di DNA a temperatura ambiente per 30 minuti.Iniziare questa procedura preparando la miscela di reazione per ciascun campione come miscela master. Per ogni campione, aggiungere 2,5 microlitri di tampone di reazione polinucleotide chinasi 10x T4, 2,5 microlitri di ATP e un microlitro di tre polinucleotide chinasi primaria fosfatasi-meno T4. Trasferire 19 microlitri di ciascun campione di DNA in una nuova provetta da 200 microlitri e denaturare a 85 gradi Celsius in un termociclatore per tre minuti.Quindi, raffreddare i campioni di DNA con ghiaccio e aggiungere sei microlitri della miscela di reazione preparata a ciascun campione. Incubare le miscele di reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, seguite da 65 gradi Celsius per 20 minuti per fermare la reazione. Purificare il DNA utilizzando perle paramagnetiche, come dimostrato in precedenza, ma eluire con 14 microlitri di tampone di eluizione.Preparare in anticipo la miscela di reazione come miscela master, contenente quanto segue per ogni campione. Cinque microlitri di tampone di reazione 10x T4 RNA ligasi, cinque microlitri di esamemmina cobalto(III)cloruro, 0,5 microlitri di oligonucleotide ARC140, 0,5 microlitri di ATP e 25 microlitri di PEG 8000 al 50%. Mescolare bene pipettando.Trasferire 13 microlitri di ogni DNA purificato in una nuova provetta da 200 microlitri e denaturare a 85 gradi Celsius in un termociclatore per tre minuti. Raffreddare il DNA con ghiaccio, quindi aggiungere 36 microlitri di miscela di reazione a ciascun campione, miscelare pipettando e centrifugare brevemente. Aggiungere un microlitro di RNA ligasi T4 a ciascuna reazione, mescolare pipettando e centrifugare brevemente.Incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per una notte. Quando la legatura del DNA a singolo filamento è completa, purificare il DNA come dimostrato in precedenza, ma utilizzare 0,8 volumi di perline paramagnetiche e pellettare le perle per 10 minuti. Eluire in 20 microlitri di tampone di eluizione e trasferire 20 microlitri di ciascun campione di DNA in una nuova provetta da 200 microlitri.Ripetere la purificazione con 0,8 volumi di perle paramagnetiche ed eluire in 14 microlitri di tampone di eluizione. Per ogni campione, preparare la miscela di reazione come miscela master composta da due microlitri di tampone di reazione 10x T7 DNA polimerasi, due microlitri di ARC76/77, due microlitri di dNTP e 0,8 microlitri di BSA. Trasferire 12,8 microlitri di DNA purificato in una nuova provetta da 200 microlitri e denaturare a 85 gradi Celsius in un termociclatore per tre minuti.Raffreddare il DNA con ghiaccio, quindi aggiungere 6,8 microlitri di miscela di reazione a ciascun campione, miscelare pipettando, centrifugare brevemente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere 0,4 microlitri di DNA polimerasi T7 a ciascuna reazione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver purificato il DNA con perle paramagnetiche, eluire in 11 microlitri di tampone di eluizione.Per iniziare l'amplificazione PCR, preparare la miscela di reazione separatamente per ciascun campione in una nuova provetta da 200 microlitri composta da 7,5 microlitri di ARC49, 7,5 microlitri di primer indice unico e 25 microlitri di miscela pronta per l'avvio a caldo 2X. Aggiungere 10 microlitri di campione di DNA a ogni reazione. Amplifica la libreria utilizzando le seguenti condizioni.Denaturare a 95 gradi Celsius per 45 secondi, seguito da 18 cicli di 98 gradi Celsius per 15 secondi, 65 gradi Celsius per 30 secondi, 72 gradi Celsius per 30 secondi e terminare con un allungamento finale a 72 gradi Celsius per due minuti. Tenere i campioni a quattro gradi Celsius dopo l'amplificazione. Purificare le librerie come descritto nel protocollo di testo ed eluire in 20 microlitri di tampone TE.Determina la qualità e la dimensione media dei frammenti di ciascuna libreria utilizzando un sistema di elettroforesi digitale. Vengono mostrati i risultati rappresentativi di profili di libreria adeguati dopo il trattamento con idrossido di potassio o cloruro di potassio. Dopo aver calcolato la concentrazione di ciascuna libreria, estrarre quantità molari uguali di un massimo di 24 librerie amplificate con diversi primer indice per il sequenziamento come descritto nelle sezioni nove e 10 del protocollo di testo.Aggiungere il tampone TE a un volume finale di 25 microlitri e una concentrazione di 10 nanomolari. Dopo il sequenziamento, eseguire l'analisi dei dati bioinformatici come specificato nella sezione 11 del protocollo di testo. Questi grafici mostrano le letture riassunte in tutti i siti HincII nel DNA mitocondriale umano a filamento leggero e a filamento pesante dopo il trattamento con cloruro di potassio.Circa il 70% di tutti i cinque terminali primari rilevati localizzati nei siti di taglio, dimostrando l'elevata efficienza della digestione HincII. Il trattamento delle librerie con idrossido di potassio per idrolizzare il DNA nei ribonucleotidi incorporati riduce il numero di letture a HincII a circa il 40%Il numero relativo di letture nel DNA mitocondriale e nucleare rivela differenze nella copertura e illustra l'importanza di un'appropriata normalizzazione per rimuovere la distorsione del filamento. La normalizzazione dei conteggi delle letture in HincII fornisce una misura quantitativa del numero di ribonucleotidi per genoma mitocondriale sul filamento pesante o leggero.Le letture dopo il trattamento con idrossido di potassio per ciascun ribonucleotide, normalizzate alla composizione della sequenza di ciascun filamento, mostrano un rapporto diverso da uno, indicando una distribuzione non casuale delle letture e suggerendo un pattern ribonucleotidico distinto e un'elevata qualità della libreria. Normalizzando le letture nei siti dei ribonucleotidi incorporati a quelle nei siti HincII, così come al contenuto di nucleotidi del genoma, genera una misura quantitativa di quanti di ciascun ribonucleotide è incorporato per 1.000 basi complementari. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in due giorni se viene eseguito correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il DNA altamente intatto ed evitare di introdurre rotture a doppio filamento durante la preparazione della libreria. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi simili per confermare i dati di quantificazione dei ribonucleotidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le librerie per la mappatura e la quantificazione di ribonucleotidi e DNA utilizzando il sequenziamento di nuova generazione.Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche come l'idrossido di potassio può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare protezioni per gli occhi e guanti.

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