Visualizzazione della replicazione del DNA mitocondriale in singole celle da amplificazione del segnale EdU

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare e visualizzare la replicazione del DNA mitocondriale nei neuroni in coltura. Questo viene ottenuto innanzitutto incubando i neuroni con l'analogo della timidina EDU per un periodo compreso tra due e 24 ore. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'etichettare l'EDU, che contiene un alchino, con l'azide fluorescente Alexa Fluor 488 mediante una reazione covalente catalizzata dal rame.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'amplificare il segnale orgon green mediante un passaggio di amplificazione del segnale con aramide, al fine di visualizzare l'EDU incorporato nel DNA mitocondriale (MT DNA) appena sintetizzato. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano la replicazione del DNA mitocondriale in specifici compartimenti subcellulari dei neuroni, grazie alla combinazione della chimica clicka EDU e successiva amplificazione del segnale tear mind. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'etichettatura con BRDU, è che l'etichettatura con EDU è più semplice e delicata, consentendo ulteriori colorazioni immunofluorescenti per marcatori neuronali.

Questo metodo può rispondere a domande fondamentali sulla regolazione del numero di mitocondri, ad esempio come i neuroni soddisfino le variazioni del fabbisogno energetico nei loro compartimenti subcellulari, inclusi i corpi cellulari, gli assoni, le dendriti e i terminali sinaptici. Pertanto, questo metodo può fornire informazioni sui meccanismi alla base della patogenesi di numerose malattie neurologiche mitocondriali, tra cui neuropatie e neurodegenerazione. Ma, cosa importante, può essere applicato anche ad altri sistemi in cui variazioni nel numero di copie del DNA mitocondriale probabilmente sottendono la patogenesi dello stato patologico, inclusa la tossicità da farmaci, il cancro e l'invecchiamento.

In questo video verrà illustrato come etichettare il DNA mitocondriale appena sintetizzato, abbreviato in mtDNA, nei neuroni del ganglio della radice dorsale coltivati su coprioggetti sterili da 12 millimetri. In una piastra per colture a 24 pozzetti, diluire il stock da 10 millimolari di 5-ethynyl-2'-deoxyuridina, abbreviato EDU, proveniente dal kit per saggio Clicka EDO Microplate, di 1 a 100 nel mezzo di coltura per ottenere uno stock di 10 XEDU. Lo stock di 10 XEDU viene quindi aggiunto direttamente nel mezzo di ogni pozzetto; incubare i neuroni trattati per due fino a 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in una cappa da laboratorio.

Fissare i neuroni in paraformaldeide al 2% per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte in PBS 1X per due-cinque minuti per ogni lavaggio. I neuroni fissati possono essere conservati in PBS 1X fresco a quattro gradi Celsius per un periodo fino a un mese.

Preparare una camera umida come descritto nel testo allegato. Utilizzare pinzette a punta fine per trasferire 28 coprioggetti fissati, inclusi controlli positivi e negativi per EDU, su fogli di paraform aldeide idrofobica all'interno della camera umida. Riapplicare da 200 a 300 microlitri di un XPBS per coprire la superficie di ciascun coprioggetto.

Preparare il kit per il saggio click it come descritto nel testo e secondo le istruzioni del produttore per etichettare il DNA mitocondriale con 75-80 microlitri di una soluzione permeabilizzante contenente 0,1% di Triton X in 1x PBS su ogni coprivetrino, quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzare una pipetta con pallina e una punta da 200 microlitri fissata all'estremità per rimuovere delicatamente il liquido senza perdere le cellule.

Utilizzare una pipetta a bolla per inondare delicatamente il coverslip. Lavare con 200-300 microlitri di XPBS per rimuovere completamente la soluzione precedente. Lavare ogni coverslip due volte.

Pipettare da 75 a 80 microlitri di perossido di idrogeno fresco al 1% in un XPBS su ciascun coverslip. Incubare, coperto, per 30 minuti a temperatura ambiente per inibire l'attività della perossidasi endogena. Lavare due volte con un XPBS come in precedenza, quindi preparare frescamente il cocktail di reazione "click" come descritto nel testo allegato.

Aspirare su e giù per mescolare. Non vortexare; fissare le cellule nervose con da 75 a 80 microlitri di fissativo click at EDU per ogni coprivetrino, incubando a temperatura ambiente per cinque minuti. Durante l'incubazione di post-fissazione, diluire il cocktail di reazione con un volume uguale di fissativo clicka EDU.

Aggiungere il cocktail di reazione su ogni lamellino per proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 25 minuti. Rimuovere delicatamente il cocktail di reazione e lavare due volte con un buffer bloccante diluito 1x sotto un microscopio a fluorescenza episcopica. Verificare la colorazione verde orgon nei nuclei al termine della colorazione EDU.

Iniziare l'amplificazione del segnale mediante TSA aggiungendo una soluzione bloccante TSA al 1% su ogni coprislip e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Centrifugare brevemente l'anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (antione green horse radish peroxidase) preparato da 2 a 24 ore prima della diluizione TSA; diluire l'anticorpo primario 1:300 nella soluzione bloccante TSA e mescolare capovolgendo o pipettando delicatamente per evitare vortici eccessivi. Aggiungere 75 microlitri su ogni coprislip e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, eseguire tre risciacqui con un volume di XPBS a temperatura ambiente. Incubare i coprioggetti nell'ultimo lavaggio per un ulteriore periodo di 30-60 minuti per assicurare la rimozione dell'anticorpo primario non legato. Preparare la reazione IDE immediatamente prima dell'uso seguendo la parte testuale di questo protocollo.

Incubare i vetrini con la reazione IDE per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con un XPBS, incubando nell'ultimo lavaggio per 30-60 minuti come in precedenza, sotto il microscopio. Verificare l'etichettatura del DNA mitocondriale; montare i neuroni correttamente colorati su vetrini di vetro con un mezzo di montaggio ANTIFA contenente DPI; le immagini mostrate qui sono rappresentative di immagini in contrasto di interferenza differenziale di neuroni del ganglio della radice dorsale embrionali e adulti, comunemente utilizzati per l'analisi.

Questi diagrammi schematici rappresentano la procedura per l'etichettatura di EDU nell'acido nucleico mitocondriale (MTD NA) mediante un segnale fluorescente verde. Le cellule di neuroblastoma F11 mitoticamente attive fungono da controllo positivo e illustrano il modello di marcatura di EDU incorporato nel DNA nucleare e mitocondriale, mostrato in queste immagini fluorescenti rappresentative sovrapposte al campo chiaro. I segnali verdi puntiformi mostrano il segnale amplificato di EDU incorporato nel M-D-D-N-A appena sintetizzato sia nei neuroni del ganglio della radice dorsale embrionale che adulto.

La procedura di marcatura con EDU consente una successiva colorazione immunofluorescente di marcatori neuronali come il neurofilamento in rosso. Questi diagrammi schematici rappresentano il procedimento per la marcatura di EDU e MTD NA con un segnale fluorescente rosso. Le cellule di neuroblastoma F11 mitoticamente attive fungono da controllo positivo e illustrano il modello di marcatura di EDU incorporato nel DNA nucleare e mitocondriale.

Questo diagramma schematico rappresenta la procedura per l'etichettatura di BRDU nel M-T-D-N-A appena sintetizzato, utilizzando un segnale fluorescente verde o rosso. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di eseguire controlli utilizzando cellule mitoticamente attive al fine di verificare l'etichettatura efficace di EDU e dei nuclei cellulari prima di procedere ai passaggi di amplificazione per visualizzare l'etichettatura del DNA mitocondriale seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'immunofluorescenza standard, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio su come la sintesi del DNA mitocondriale sia regolata in specifiche sottopopolazioni di neuroni o compartimenti neuronali. Grazie al suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare la regolazione del numero di mitocondri in modelli cellulari di fisiologia normale, nonché in modelli cellulari che simulano condizioni patologiche compromesse.

Stati neurologici.