Visualizzazione della replicazione del DNA mitocondriale in singole celle da amplificazione del segnale EdU

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare e visualizzare la replicazione M-T-D-N-A nei neuroni in coltura. Ciò si ottiene incubando prima i neuroni con l'analogo della timidina EDU per due o 24 ore. Il secondo passo della procedura consiste nell'etichettare l'EDU che contiene un alchino con l'orgone fluorescente verde 4 88 azide attraverso una reazione covalente catalizzata dal rame.

La fase finale della procedura consiste nell'amplificare il segnale del verde orgonico con la fase di amplificazione del segnale aramidico al fine di visualizzare l'EDU che è stata incorporata nel DNA MT appena sintetizzato. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la replicazione del DNA MT in specifici compartimenti subcellulari dei neuroni attraverso la combinazione della chimica clicka EDU e la successiva amplificazione del segnale lacrimale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la marcatura BRDU, è che la marcatura EDU è più facile e più lieve, consentendo un'ulteriore colorazione immunofluorescente dei marcatori neuronali.

Questo metodo può rispondere a domande chiave nella regolazione del numero di mitocondri, come ad esempio il modo in cui i neuroni incontrano i carichi energetici variabili nei loro compartimenti subcellulari, inclusi corpi cellulari, assoni, dendriti e terminale sinaptico. Quindi questo metodo può fornire informazioni sui meccanismi alla base della patogenesi di molteplici malattie neurologiche su base mitocondriale, tra cui la neuropatia e la neurodegenerazione. Ma soprattutto, può essere applicato anche ad altri sistemi in cui i cambiamenti nella copia del DNA mitocondriale sono probabilmente alla base della patogenesi dello stato della malattia, tra cui la tossicità dei farmaci, il cancro e l'invecchiamento.

Questo video dimostrerà come etichettare il DNA mitocondriale appena sintetizzato abbreviato M-T-D-N-A nei neuroni gangliari della radice dorsale che sono stati cresciuti su vetrini sterili da 12 millimetri. In una piastra di coltura a 24 pozzetti, diluire il ceppo da 10 millimolari di cinque etanolo e due doxiuridina, abbreviato EDU dal kit di saggi per micropiastre Clicka EDO da uno a 100 in terreno di coltura per un ceppo da 10 XEDU. Il 10 stock di XEDU viene quindi aggiunto direttamente nel terreno in ogni pozzetto, incuba i neuroni trattati per 2-24 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in una cappa aspirante.

Fissare i neuroni in aldeide paraforme al 2% per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte in un XPBS per due o cinque minuti a ogni lavaggio. I neuroni fissati possono essere conservati in un XPBS fresco a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese.

Preparare una camera umida come descritto nel testo allegato. Utilizzare una pinza a punta fine per trasferire 28 vetrini di copertura fissi, compresi i controlli EDU positivi e negativi, su fogli di paraforma idrofobica M all'interno della camera umida. Riapplicare da 200 a 300 microlitri di un XPBS per coprire la superficie di ogni vetrino coprioggetto.

Preparare il kit del saggio click it come descritto nel testo e nei produttori e nelle istruzioni per etichettare il DNA mitocondriale a 75-80 microlitri di una soluzione permeabile contenente lo 0,1% di tritton X in un XPBS per ogni coperchio, scivolare, coprire e incubarlo a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzare una pipetta per il trasferimento a bulbo con un puntale da 200 microlitri fissato all'estremità. Per rimuovere delicatamente il liquido senza perdere cellule.

Utilizzare una pipetta a bulbo per allagare delicatamente il coperchio. Scivolare con 200-300 microlitri di un XPBS per lavare accuratamente la soluzione precedente. Lavare ogni vetrino coprioggetto due volte.

Pipettare da 75 a 80 microlitri di perossido di idrogeno fresco all'1% in un XPBS su ciascun vetrino coprioggetto. Incubare coperto per 30 minuti a temperatura ambiente per estinguere l'attività della perossidasi endogena. Risciacquare due volte con un XPBS come prima, preparare il cocktail a reazione a scatto come descritto nel testo allegato.

Pipa su e giù per mescolare. Non postfissare i neuroni con 75-80 microlitri di fissativo EDU per vetrino coprioggetti, incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Durante l'incubazione del postfix, diluire il cocktail di reazione con un volume uguale di fissativo clicka EDU.

Aggiungere il cocktail di reazione a ciascun coprioggetto per proteggerlo dalla luce e incubarlo a temperatura ambiente per 25 minuti. Rimuovere delicatamente il cocktail di reazione due volte con un tampone bloccante diluito al microscopio epifluorescente. Verificare la presenza di colorazione verde orgonica nei nuclei quando la colorazione EDU è completa.

Iniziare l'amplificazione del segnale delle termiti o TSA, aggiungere una soluzione di blocco TSA all'1% a ciascun vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Far girare brevemente l'anticorpo coniugato antione verde rafano perossidasi Preparato da due a 24 ore prima della TSA, diluire l'anticorpo primario da uno a 300 in soluzione bloccante TSA e invertire o pipettare per mescolare il vortice del nodo di sintonizzazione. Aggiungere 75 microlitri a ciascun coperchio, infilare e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, risciacquare tre volte con un XPBS a temperatura ambiente. Incubare i vetrini coprioggetti nel lavaggio finale per altri 30-60 minuti per assicurarsi che l'anticorpo primario non legato venga rimosso. Preparare la reazione IDE in base alla parte di testo di questo protocollo immediatamente prima dell'uso.

Incubare i vetrini coprioggetto con la reazione IDE per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con un XPBS in incubazione nel lavaggio finale per 30-60 minuti come prima al microscopio. Verificare la presenza di neuroni colorati con successo su vetrini con un mezzo di montaggio ANTIFA contenente DPI, qui sono riportate immagini rappresentative di contrasto interferenziale differenziale di neuroni gangliari della radice dorsale embrionali e adulti che vengono tipicamente utilizzati per l'analisi.

Questi diagrammi schematici rappresentano la procedura per la marcatura dell'EDU in MTD NA con un segnale fluorescente verde. Le cellule di neuroblastoma F 11 mitoticamente attive fungono da controllo positivo e illustrano il modello di marcatura dell'EDU che è stato incorporato nel DNA nucleare e mitocondriale in queste immagini di fluorescenza rappresentative sovrapposte al campo chiaro. I segnali punteggiati verdi mostrano il segnale EDU amplificato incorporato in M-D-D-N-A di nuova sintesi di neuroni gangliari della radice dorsale embrionali e adulti.

La procedura di marcatura EDU consente la successiva colorazione immunofluorescente di marcatori neuronali come il neurofilamento in rosso. Questi diagrammi schematici rappresentano la procedura per l'etichettatura di EDU e MTD NA con un segnale fluorescente rosso. Le cellule di neuroblastoma F 11 mitoticamente attive fungono da controllo positivo e illustrano il modello di marcatura dell'EDU che è stato incorporato nel DNA nucleare e mitocondriale.

Questo diagramma schematico rappresenta la procedura per l'etichettatura di BRDU in M-T-D-N-A di nuova sintesi con un segnale fluorescente verde o rosso. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire controlli utilizzando cellule mitoticamente attive per verificare la corretta marcatura dell'EDU e dei nuclei cellulari prima di procedere alle fasi di amplificazione per visualizzare la marcatura del DNA MT Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'immunofluorescenza standard, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui la sintesi del DNA dei mitocondri è regolata in specifiche sottopopolazioni di neuroni o compartimenti neuronali Grazie al suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare la regolazione del numero mitocondriale in modelli di coltura sia di fisiologia normale che di modelli di coltura che simulano la malattia compromessa.

Stati neurologici.