Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

L'obiettivo generale di questo metodo è identificare le proprietà fenotipiche e il potenziale di attecchimento delle cellule staminali ematopoietiche clonali o dei precursori delle HSC durante lo sviluppo embrionale murino. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'emopoiesi dello sviluppo sui contributi unici del lignaggio dei precursori clonali delle HSC durante lo sviluppo embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i precursori emogenici vengono analizzati a livello di singola cellula.

Ciò consente l'identificazione delle proprietà fenotipiche uniche che distinguono i rari precursori delle HSC. Inizia aggiungendo Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, tessuti sezionati da embrioni tra 9,5 e 11,5 giorni dopo il coito a un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di PBS integrato con il 10% di FBS su ghiaccio. Quando i tessuti si sono depositati sul fondo della provetta, aspirare il surnatante e aggiungere immediatamente un millilitro di collagenasi allo 0,25% ai campioni.

Dopo 25 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con un millilitro di PBS più FBS e utilizzare un puntale di pipetta da un millilitro per triturare i tessuti da 20 a 30 volte fino ad ottenere una sospensione a singola cellula. Quindi diluire le cellule con altri otto millilitri di PBS più FBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone bloccante per cinque minuti su ghiaccio.

Quindi aggiungere 500 microlitri del cocktail di anticorpi di interesse. Dopo un'incubazione di 15-20 minuti su ghiaccio, lavare le cellule in otto millilitri di PBS più FBS e risospendere il pellet in un millilitro di PBS fresco più FBS. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 35 micrometri in una provetta da cinque millilitri, lavando il filtro con altri tre millilitri di PBS più FBS per raccogliere tutte le cellule e centrifugare nuovamente le cellule.

Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS più FBS e posizionare le celle sul ghiaccio. Per impostare i gate per lo smistamento in modalità di smistamento a cella singola e indice, caricare una piccola aliquota di cellule sul citometro a flusso e impostare l'acquisizione sulla velocità di flusso più bassa. Apri un grafico dell'area di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione laterale e imposta un gate per includere celle di dimensioni variabili.

Apri un grafico dell'area di dispersione diretta rispetto alla larghezza di dispersione diretta e un grafico dell'area di dispersione laterale rispetto alla larghezza di dispersione laterale e imposta un gate in ciascun grafico per escludere i doppietti. Imposta un'area di dispersione diretta rispetto al grafico DAPI per bloccare le celle attive. Quindi creare un grafico anti-recettore endoteliale anti-endoteliale Caderina contro il recettore anti-endoteliale della proteina C e le cellule che esprimono il recettore della proteina C dell'endotelio vascolare positivo.

Per indicizzare le cellule aorta-gonadi-mesonefro, posizionare una piastra a 96 pozzetti precoltivata con cellule endoteliali AGM in terreno privo di siero AGM più citochine nel blocco piastra del citometro a flusso e caricare il campione sperimentale. Iniziare l'acquisizione del campione e confermare che la modalità di ordinamento dell'indice a cella singola sia selezionata per ordinare una singola cella in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Quando una cellula è stata selezionata in ciascun pozzetto della piastra, posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per un massimo di sette giorni.

Al termine del periodo di co-coltura, colonie ematopoietiche di varie dimensioni e morfologie possono essere visualizzate utilizzando un microscopio invertito con un ingrandimento di 100X. Per analizzare i cloni mediante citometria a flusso, utilizzare una pipetta multicanale per dissociare le cellule ematopoietiche dagli strati endoteliali senza staccare le cellule endoteliali. Quindi trasferire 100 microlitri di cellule nei singoli pozzetti di una nuova piastra con fondo a V da 96 pozzetti e restituire la piastra originale da 96 pozzetti contenente i restanti 100 microlitri di cellule all'incubatore per colture tissutali.

Pellettare le celle nella piastra con fondo a V mediante centrifugazione e rimuovere il surnatante invertendo e muovendo la piastra con un unico movimento rapido. Risospendere i pellet in ogni pozzetto con 50 microlitri di tampone di blocco a quattro gradi Celsius. Dopo cinque minuti, aggiungere il cocktail di anticorpi di interesse a ciascun pozzetto per un'incubazione di 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS più FBS, muovendo la piastra al termine della centrifugazione per scartare il surnatante. Risospendere i pellet in 50 microlitri di PBS più FBS e analizzare le cellule secondo i protocolli standard di analisi del flusso per lo screening delle colonie che contengono potenziale di cellule staminali ematopoietiche. Selezionando i pozzetti che contengono cellule con fenotipo di cellule staminali ematopoietiche mediante analisi di flusso, utilizzare una pipetta multicanale per risospendere i restanti 100 microlitri di cellule dalla co-coltura originale e aggiungere cinque volte 10 alla quarta cellula di midollo osseo di salvataggio in 100 microlitri di PBS più il 2% di FBS in ciascun pozzetto.

Dopo il trasferimento adottivo di ciascun clone in singoli animali riceventi congenici irradiati in modo letale, raccogliere campioni di sangue periferico dagli animali trapiantati a intervalli regolari dopo il trapianto. Per identificare i cloni con attecchimento a lungo termine, analizzare i campioni mediante citometria a flusso secondo i protocolli standard di analisi a flusso. Le proprietà fenotipiche di ciascun clone possono quindi essere correlate con le sue proprietà di attecchimento.

cellule staminali pre-ematopoietiche possono essere arricchite dalla positività alla caderina dell'endotelio vascolare e da un alto livello di espressione del recettore della proteina C endoteliale. La colorazione con altri anticorpi coniugati con fluorocromo consente l'analisi retrospettiva di ulteriori parametri fenotipici che possono essere registrati per ciascuna cellula durante l'ordinamento dell'indice. Dopo lo smistamento dell'indice in co-colture di cellule endoteliali aorta-gonade-mesonefro, i singoli cloni si integrano nello strato di cellule endoteliali aorta-gonade-mesonefro prima che i cloni inizino ad arrotondarsi e formare cluster ematopoietici.

Dopo cinque-sette giorni di co-coltura, è possibile rilevare colonie di varie dimensioni e morfologie. Qui, vengono mostrate quattro diverse colonie ottenute dopo la co-coltura, con tre colonie che dimostrano diverse proporzioni di cellule staminali ematopoietiche fenotipiche insieme ad altri tipi di cellule più differenziate e la quarta colonia priva di cellule con espressione di marcatori di cellule staminali ematopoietiche. Il trasferimento adottivo della progenie della cellula clone consente di valutare la capacità di attecchimento multi-lineage a lungo termine di ciascun clone in seguito al contributo del donatore ai compartimenti mieloidi delle cellule B e T del sangue periferico del ricevente nel tempo.

Sebbene la maggior parte delle colonie contenenti cellule con un fenotipo di cellule staminali ematopoietiche abbia raggiunto un attecchimento a lungo termine, il trapianto è necessario per confermare un attecchimento funzionale multi-lignaggio poiché alcuni cloni perdono l'attecchimento nel tempo. Il potenziale funzionale delle cellule staminali ematopoietiche di ciascun clone può quindi essere correlato ai parametri di smistamento dell'indice originale di quel clone per identificare le sue precise caratteristiche fenotipiche. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la coltura secondaria di progenie ematopoietica sullo stroma a supporto dello sviluppo delle cellule B e T in vitro, per rispondere a ulteriori domande sui potenziali linfocitari dei singoli precursori emogenici.