Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

L'obiettivo generale di questa procedura è generare rendering tridimensionali di frammenti di alberi dei villi placentari adatti all'analisi delle reti vascolari contenute. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel nostro campo, come ad esempio perché un bambino può avere una crescita limitata o quale stress e quanto grave potrebbe essere stato lo stress che ha portato alla nascita pretermine. Il vantaggio principale della nostra procedura è che ora siamo in grado di immunomarcare il tessuto dell'albero dei villi placentari chiari e quindi visualizzare le loro reti vascolari e utilizzare tali visualizzazioni per caratterizzare e analizzare queste reti vascolari.

Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi a molte diagnosi e terapie, poiché la maggior parte delle scienze della vita si basa sulla caratterizzazione istologica bidimensionale. A dimostrare la procedura sarà la signora Valerie Schwenk che effettuerà l'immunomarcatura e la pulizia del tessuto placentare e poi il signor Phillip Necaise eseguirà la dissezione del tessuto placentare e farà anche la pulizia inversa del tessuto. Per prepararsi alla dissezione dell'albero villoso, sciacquare prima il tessuto placentare formale e fissato con soluzione fisiologica tamponata con fosfato.

Quindi posizionare in una capsula di Petri sul tavolino di un microscopio da dissezione. Per localizzare l'albero villoso, usa il bisturi e una pinza fine per strappare il tessuto placentare. Quindi, sezionare pezzi dell'albero villoso di circa cinque millimetri di lunghezza e trasferirli in una microprovetta contenente un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato.

Sostituire la soluzione salina tamponata con fosfato con una nuova e attendere 10 minuti con un vortice occasionale. Quindi, sostituire la soluzione salina tamponata con fosfato con tampone permeabilizzante per permeabilizzare il tessuto e bloccare il legame non specifico degli anticorpi secondari. Quindi, incubare per 30 minuti.

Quindi, sostituire il tampone permeabilizzante con soluzione salina tamponata con fosfato contenente il due percento di siero di capra con monoclonale di topo anti CD31 e coniglio anti CK7. Lasciare il tessuto a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere gli anticorpi rimanenti con ulteriori lavaggi con soluzione salina tamponata con fosfato con siero di capra al due percento.

Quindi, rimuovere la soluzione salina tamponata con fosfato con il due percento di siero di capra e aggiungere lo stesso tampone, integrato con immunoglobulina G anti-topo di capra accoppiata con un fluoroforo verde e immunoglobulina G anti-coniglio di capra accoppiata con un fluoroforo a infrarossi. Incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Quindi, lavare il fazzoletto una volta con PBS-GS e conservare il fazzoletto etichettato al buio a temperatura ambiente fino alla schiaritura.

Lavare i campioni tre volte con PBS a intervalli di 10 minuti. Per disidratare il tessuto, rimuovere la soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere il 50% di etanolo al tessuto e incubare per 10 minuti. Dopo l'incubazione, scartare e successivamente lavare tre volte con etanolo al 70% a intervalli di 10 minuti, seguiti da tre lavaggi con etanolo al 100% a intervalli di 15 minuti.

Quindi, utilizzare una pinza a punta fine per trasferire il tessuto in una microprovetta riempita con un millilitro di soluzione per quattro ore. Dopo quattro ore, trasferire il tessuto in una microprovetta riempita con la soluzione due e incubare per altre quattro ore. Per montare il tessuto in una camera Sykes-Moore, utilizzare una pinza a punta fine per posizionare un vetrino coprioggetti rotondo da 25 millimetri sulla base della camera.

Ancora una volta, usa la pinza a punta fine per posizionare una guarnizione di gomma nella base del vetrino coprioggetti. Rimuovere il fazzoletto immerso nella soluzione due e posizionarlo al centro del vetrino coprioggetto. Quindi, aggiungere una goccia di soluzione due, circa 40 microlitri, sul fazzoletto.

Quindi, prendi un secondo vetrino coprioggetti e posizionalo sopra la guarnizione. Quindi, comprimere saldamente il vetrino coprioggetto e la guarnizione avvitando un anello di bloccaggio nella parte superiore della base. Quindi, inserire un ago calibro 25 attraverso la guarnizione nella porta sulla base.

Quindi, riempi una siringa da tre millilitri con un virgola cinque millilitri di soluzione due. Quindi, montare un ago calibro 25 sulla siringa e inserire l'ago nella porta opposta attraverso la guarnizione. Quindi, iniziare a iniettare la camera con la soluzione due e controllare che l'aria all'interno della camera fuoriesca attraverso l'altro ago da 25 gauge.

Quando la camera è piena, rimuovere l'ago e la siringa e posizionare il supporto della camera Sykes-Moore sul tavolino del microscopio confocale. Utilizzare un obiettivo 10X per mettere a fuoco il tessuto posizionato sulla camera. Quindi, impostare un punto di riferimento per il tavolino e spostare il tavolino del microscopio su e giù attraverso il piano focale per identificare e impostare la parte superiore e inferiore del tessuto.

Imposta la dimensione del passo su due virgola cinque micrometri e raccogli un file di immagine confocale contenente una serie di immagini del tessuto dall'alto verso il basso. Quindi, trasferire il tessuto in una microprovetta contenente più di 20 volte il volume di etanolo al 100% per invertire la cancellazione. Quindi, dopo ogni intervallo di un'ora, sostituire con 70 e successivamente con etanolo al 50% e infine soluzione salina tamponata con fosfato.

Conservare a quattro gradi Celsius al buio fino all'incorporazione. Qui, per mostrare la rete vascolare placentare, sono state acquisite immagini microscopiche sia microscopiche che confocali di una placenta umana. Queste immagini microscopiche della placenta mostrano l'albero villoso radiante che è penetrato nel parenchima placentare.

Queste immagini microscopiche mostrano la presenza di una porzione distale di pezzi di albero villoso che terminano nel grappolo di villi. Successivamente, per mostrare lo strato di trofoblasto dei villosi, la porzione distale dell'albero dei villi è stata immunomarcata. Nell'immagine, lo strato esterno del trofoblasto è mostrato in verde e i capillari sono mostrati in rosso.

Quindi, per controllare il tessuto placentare prima e dopo la cancellazione, sono state acquisite immagini confocali di tessuti placentari non chiariti e chiari. Le immagini mostrano che per un tessuto non pulito, l'immunofluorescenza può essere catturata a una profondità di 100 micrometri o inferiore del tessuto. Al contrario, per il tessuto placentare pulito, l'immunofluorescenza può essere catturata a una profondità molto più elevata.

Inoltre, per confrontare il tessuto convenzionale con le sezioni chiare invertite, il tessuto pulito è stato disidratato in un processo inverso con etanolo. La colorazione immunoistochimica del tessuto placentare con anti CK7 prima e dopo la clearing non dimostra alcuna alterazione significativa della morfologia tissutale dovuta alla clearing. L'animazione mostra che il tessuto villoso immunocolorato è distribuito lungo l'intera profondità del volume del tessuto.

Una volta che ti senti a tuo agio nell'eseguire la procedura, puoi aspettarti che ci vogliano circa 18 ore, suddivise in tre giorni. Nel tentativo di eseguire questa procedura è importante ricordare che richiede diverse competenze. Bisogna essere in grado di fare patologia placentare, microscopia confocale.

È necessario essere in grado di generare rendering tridimensionali dell'imaging e di avere dimestichezza con l'elaborazione e l'analisi immunologica. Seguendo questa procedura, possono essere condotti altri metodi come l'istologia tradizionale, la pagina STS o il maldi. Con il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada nel campo della medicina materno-fetale, della neonatologia e della biologia del trofoblasto per esplorare le cause profonde alla base della pre-eclampsia, della scarsa crescita fetale e della sofferenza fetale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come pulire, renderizzare e analizzare il tessuto dell'albero dei villi placentari. Grazie mille per aver guardato il video e buona fortuna con i tuoi esperimenti.