Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di colorare la capsula polisaccaridica dei ceppi di C. neoformans per la visualizzazione e la misurazione del diametro della capsula. Questi metodi possono aiutare i ricercatori con l'induzione, l'imaging e la misurazione delle dimensioni della capsula in Cryptococcus neoformans. Il vantaggio principale delle tecniche di colorazione e imaging è che sono semplici, veloci e consentono una misurazione accurata del diametro della capsula.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi del software possono creare confusione la prima volta che viene utilizzato. Il diametro della capsula di Cryptococcus neoformans è spesso usato come misura della virulenza. La capacità di automatizzare questo processo può far risparmiare molto tempo all'analisi.

Per indurre la produzione di capsule, incubare prima una colonia di C. neoformans in brodo di peptone destrosio di lievito a 37 gradi Celsius agitando per 18-36 ore fino a quando la coltura è in fase logaritmica. Al termine della coltura, pellettare il lievito mediante centrifugazione e lavare il lievito tre volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il lievito a due volte da 10 a 5 cellule per due millilitri di concentrazione di DMEM e incubare la coltura a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 18 ore.

Il giorno successivo, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimuovere tutti tranne gli ultimi 10 microlitri di surnatante. Per colorare il lievito con inchiostro di china, risospendere il pellet nel surnatante rimanente e trasferire quattro microlitri di sospensione cellulare e quattro microlitri di inchiostro di china su un vetrino da microscopio. Mescolare delicatamente la soluzione risultante senza creare bolle.

Quindi posizionare un vetrino coprioggetto di vetro numero 1,5 di spessore 13 millimetri sul campione di cella e sigillare i bordi con un sigillante non tossico. Per colorare il lievito con un colorante fluorescente, risospendere il pellet di coltura notturno in 50 microlitri di PBS integrato con l'1% di siero bovino e incubare le cellule in 55-60 microlitri di anticorpo monoclonale 18B7 in capsula coniugata calcofluor-white e Alexa Fluor 488 per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere il pellet in 10 microlitri di PBS più albumina sierica bovina.

Quindi trasferire otto microlitri di cellule su un vetrino da microscopio, coprire il campione di cellule con un vetrino coprioggetti di vetro numero 1,5 di spessore 13 millimetri e sigillare i bordi con un sigillante atossico. Per colorare il lievito con entrambi i coloranti, incubare prima le cellule con una capsula fluorescente e colorare la parete cellulare come appena dimostrato. Quindi aggiungere quattro microlitri di cellule colorate con fluorescenza e quattro microlitri di inchiostro di china su un vetrino di vetro e posizionare un vetrino coprioggetti sigillato sul campione di cellule fungine come dimostrato.

Per visualizzare le cellule al microscopio ottico, selezionare l'obiettivo 100X e visualizzare almeno 50 cellule non sovrapposte per condizione con tempi di esposizione ottimizzati per massimizzare il contrasto dell'immagine riducendo al minimo la sfocatura causata da piccoli movimenti cellulari. Per visualizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza, aprire il software di imaging al microscopio e selezionare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate per i fluorofori utilizzati. Nel pannello di controllo dello stack Z, seleziona la penultima opzione.

Utilizzando il controllo della messa a fuoco fine sul microscopio, mettere a fuoco prima sotto il punto più largo del corpo cellulare di una singola cellula di lievito e le capsule per tutte le cellule all'interno del campo visivo corrente e fare clic su imposta per primo. Quindi, utilizzare il controllo di messa a fuoco fine per mettere a fuoco sopra il punto più largo del corpo cellulare della stessa cellula e della capsula per tutte le cellule all'interno del campo visivo corrente e fare clic su imposta ultimo. Quindi apri la scheda di acquisizione e fai clic su avvia esperimento per acquisire lo stack Z per la posizione corrente.

Per misurare manualmente i diametri delle capsule e delle cellule, aprire un programma di misurazione delle cellule appropriato e selezionare l'immagine da misurare. Seleziona misura e usa il cursore per disegnare una linea retta attraverso il punto più largo dell'intera cella per misurare il diametro totale della cella. Fare nuovamente clic su misura e tracciare una linea retta attraverso il corpo della cella per misurare il diametro del corpo della cella e aprire la cella successiva.

Quando tutte le celle sono state misurate, salvare le immagini. Per la misurazione automatica dei diametri delle capsule e delle cellule, aprire prima un programma di modifica delle immagini appropriato e invertire tutte le immagini delle celle macchiate di inchiostro di china. Successivamente, per importare sia l'immagine originale che quella invertita nel software di misurazione delle celle, aprire il menu File nel programma di misurazione e selezionare Importa sequenza, Carica immagine, Definisci sequenza manualmente, Dimensiona il canale, Importa e Applica.

Per rilevare e mascherare il corpo cellulare, selezionare il protocollo di fluorescenza dell'analizzatore di colonie per la prima immagine invertita di interesse e fare clic su Applica. Selezionare nuovamente il protocollo di fluorescenza dell'analizzatore di colonie per segmentare le immagini invertite del corpo cellulare di C.neoformans dalle loro capsule e fare nuovamente clic su Applica per creare una maschera di conteggio. Fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare il corpo cellulare della maschera di conteggio e utilizzare il protocollo di proliferazione cellulare sull'immagine originale per rilevare e mascherare la capsula.

Fare clic su Applica per creare una maschera di conteggio per l'immagine originale e rinominare la capsula della maschera di conteggio. Per creare una nuova maschera sull'immagine originale per partizionare le capsule adiacenti l'una dall'altra, selezionare la partizione della capsula e la capsula per l'area della capsula. Per esportare i dati, fare clic su foglio di calcolo, quindi fare clic sull'icona di esportazione in foglio di calcolo.

Seleziona le misurazioni che desideri esportare e infine salva i dati. Un aumento delle dimensioni delle capsule è evidente nella maggior parte dei ceppi dopo l'induzione, sebbene alcuni ceppi mostrino capsule naturalmente piccole. In questo esperimento rappresentativo, è stata costantemente osservata una differenza significativa nelle dimensioni della capsula tra il ceppo più grande e i due ceppi più piccoli.

Le differenze nelle dimensioni delle capsule possono essere rilevate anche utilizzando coloranti fluorescenti. L'acquisizione dell'immagine Z stack garantisce l'acquisizione del diametro massimo della capsula e del corpo cellulare per ogni cellula. Le pile possono quindi essere elaborate per produrre proiezioni di massima intensità per la misurazione manuale della capsula cellulare di lievito e del diametro della cellula.

Non vi è alcuna differenza significativa all'interno dell'esperimento tra le misurazioni delle capsule utilizzando entrambi i metodi di colorazione, sebbene si osservi una maggiore variabilità tra gli esperimenti quando si utilizza l'inchiostro di china per misurare i diametri delle capsule rispetto alla colorazione con colorante fluorescente. In genere non si osservano differenze significative nelle misurazioni del diametro della capsula tra i diversi ricercatori, indipendentemente dal metodo utilizzato, mentre piccole ma significative differenze nelle dimensioni della capsula possono essere rilevate utilizzando il metodo di misurazione automatizzato. Per una misurazione automatizzata di successo, le cellule devono essere a fuoco, avere una capsula medio-grande e non essere eccessivamente raggruppate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la capsula in Cryptococcus neoformans, colorarla usando inchiostro di china o colorazione fluorescente, visualizzare la capsula e misurarla tramite un software automatizzato.