Visualizzazione non-litica Esocitosi di Cryptococcus neoformans Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare l'esocitosi non litica di cryptococcus neoformans da macrofagi primari dei neuroni del midollo osseo. Ciò si ottiene prima placcando e infettando i neuromacrofagi attivati con cellule fungine per consentire la fagocitosi e l'internalizzazione di Xeomin. Il secondo passo consiste nel rimuovere le cellule fungine extracellulari per garantire un chiaro monostrato di macrofagi infetti e non infetti.

Successivamente, i macrofagi vengono incubati in una camera a temperatura controllata di anidride carbonica e registrati per 24 ore al fine di catturare casi di esocitosi non litica e altre interazioni. Il passaggio finale consiste nel creare un filmato comprimendo tutti i fotogrammi realizzati in un periodo di 24 ore. In definitiva, la visualizzazione dei macrofagi con la microscopia ottica digitale viene utilizzata per osservare la varietà di tipi di esocitosi non litica che i macrofagi subiscono durante un'infezione di 24 ore.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione ospite-patogeno, come la tempistica e la quantificazione degli eventi cellulari Il giorno prima dell'esperimento, selezionare una singola colonia di caposquadra senior che è stata coltivata su una piastra di sbarro agar e inoculare. 10 millilitri di brodo di sbarro. Lasciare che la coltura cresca durante la notte a 37 gradi Celsius, agitando a una velocità di 250 giri/min dopo l'eutanasia dei topi come descritto nel protocollo scritto.

Sterilizzare l'intero corpo con alcol etilico al 70%. Rimuovere sia i femori che la tibia e posizionare le ossa in un duo sterile, un mezzo di aquila modificato o DMEM. Quindi rimuovere il tessuto e i muscoli in eccesso utilizzando salviette delicate fino a quando le ossa non sono completamente pulite.

Mettere solo le ossa intatte in una capsula di Petri contenente alcol etilico al 70% e incubare per tre minuti per uccidere i microrganismi associati. Rimuovere le ossa e metterle in una capsula di Petri con DMEM sterile. Quindi, taglia con cura le estremità delle ossa.

Tenere l'osso su un tubo conico da MT 50 millilitri posto sul ghiaccio e utilizzare un ago da 25 gauge per sciacquare accuratamente 10 millilitri di DMEM freddo attraverso ciascun osso. Quindi centrifugare la sospensione cellulare raccolta a temperatura ambiente per 10 minuti a 650 volte G.Durante questa centrifugazione, preparare e filtrare sterilizzare i mezzi di alimentazione dei macrofagi del midollo osseo come descritto nel protocollo di testo. Quindi, risospendere la tavolozza risultante con 10 millilitri di terreno di alimentazione.

Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri per disgregare i grumi cellulari e rimuovere i detriti di grandi dimensioni. Quindi piastra un millilitro della sospensione di cellule di deformazione in 10 millilitri di terreno di alimentazione, piastre di Petri specificate per l'uso in coltura tissutale. Lasciare che le celle aderiscano a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica per sette giorni.

Sostituzione del mezzo di alimentazione come descritto nel protocollo di testo il giorno prima dell'esperimento. Staccare i macrofagi dalla piastra rimuovendo il terreno di alimentazione e aggiungere cinque millilitri di un reagente delicato per lo stripping cellulare alla piastra dopo l'incubazione delle cellule per cinque-10 minuti. A 37 gradi Celsius, rimuovere i macrofagi con un pipettaggio delicato.

Pellettare le celle mediante centrifugazione a 650 volte G per 10 minuti prima di piegare nuovamente il pellet in un millilitro di terreno di alimentazione. Utilizzando una diluizione da uno a 20, calcolare la concentrazione di macrofagi pipettando 10 microlitri di sospensione cellulare in un emocitometro con fondo di vetro da 14 millimetri. Le piastre di Petri posizionano una concentrazione di uno per 10 al quinto macrofagi direttamente nel pozzetto interno, che contiene un massimo di 200 microlitri.

Fare attenzione a non superare questo volume. Lasciare che le cellule aderiscano alla capsula di Petri di vetro posizionando le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere uno o due millilitri di terreno di alimentazione integrati con lipopolisaccaride a un milligrammo per millilitro e interferone gamma.

A 500 unità per millilitro, lasciare che le cellule incubino durante la notte il giorno dell'esperimento. Rimuovere un millilitro di una coltura di cellule G inoculata durante la notte e tamponare le cellule di lievito mediante centrifugazione per cinque minuti di 420 volte G.To rimuovere i terreni e i prodotti criptococcici extracellulari, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS seguito da centrifugazione come prima. Dopo aver sospeso il pellet di cellule di lievito in un millilitro di PBS sterile e aver effettuato una diluizione da uno a 100, pipettare 10 microlitri di diluizione in un emocitometro e contare le cellule.

Calcola la concentrazione di cellule di lievito necessarie per una molteplicità di infezioni da una a cinque. Aggiungere il volume calcolato di sospensione di cellule criptococciche a un millilitro di terreno di alimentazione con l'anticorpo monoclonale, 18 B sette a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Incubare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi, rimuovere il terreno di alimentazione dalla capsula di Petri in vetro e lavare i macrofagi una volta con PBS sterile. Quindi aggiungere 100 microlitri di opsonize cmin direttamente nel pozzetto, seguito dall'incubazione con il lievito per due ore a 37 gradi Celsius e 10% di anidride carbonica laterale. Dopo la coincubazione, controllato al microscopio che i macrofagi abbiano c-eLe forme da considerare, le cellule criptococciche internalizzate dovrebbero essere chiaramente visibili entro i confini del macrofago, come indicato dalla grande punta della freccia.

La punta della freccia più piccola indica un macrofago non infetto senza cellule fungine. Lavare la capsula di Petri tre volte con PBS sterile per rimuovere tutti i neoformani extracellulari. Quindi aggiungere uno o due millilitri di terreno di alimentazione senza l'anticorpo monoclonale per eseguire questi esperimenti.

Prima dell'esperimento è necessario un microscopio dotato di una camera di incubazione collegata che includa l'erogazione di anidride carbonica e un'unità di riscaldamento. Preriscaldare la camera di incubazione per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius. Assicurarsi che l'unità di anidride carbonica legga il 5% all'inizio dell'esperimento.

Posizionare la capsula di Petri con fondo di vetro sul coperchio della piattaforma del microscopio con un'illuminazione ad anidride carbonica e chiudere tutti gli sportelli per garantire che non fuoriesca calore utilizzando l'obiettivo 10 x con il microscopio a contrasto di fase, mettere a fuoco un campo chiaro di macrofagi infetti, impostare il software del microscopio per scattare un'immagine ogni quattro minuti per un periodo di 24 ore. Dopo 24 ore, l'esperimento sarà giunto a termine e saranno state raccolte un totale di 361 immagini. Esporta queste immagini come JPEG con una compressione del 5%.

Utilizzando il software Image J, visualizza le immagini come una pila visiva a cinque fotogrammi al secondo. Il fotogramma iniziale del film mostra molti macrofagi in tutto il campo, alcuni non infetti e altri con dimensioni variabili di cellule criptococciche. Man mano che il film procede, le cellule sono tutte mo e possono essere viste muoversi sul campo in questo film, è chiaro che le cellule criptococciche si trovano all'interno dei confini di un macrofago infetto.

Il macrofago si agita e si può vedere una cellula di lievito, ma all'interno della zona FGA, le cellule criptococciche vengono rapidamente espulse nell'ambiente circostante. Un secondo macrofago infetto subisce esocitosi non litica e più cellule di lievito vengono rilasciate nello spazio extracellulare. Le cellule ospiti rimangono vitali dopo l'esocitosi criptococcica, come indicato dalla loro capacità di continuare a muoversi.

A volte, i macrofagi interagiscono in modo tale da facilitare il trasferimento delle cellule criptococciche tra le cellule ospiti. Le cellule di lievito non sono esposte all'ambiente extracellulare e le cellule ospiti rimangono vitali. In questo film, due macrofagi infetti creano ponti cellula-cellula in due occasioni separate per trasportare le cellule criptococciche da un macrofago all'altro.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia ottica digitale per visualizzare i macrofagi sottoposti a esocitosi non litica e altre interazioni tra patogeni dell'ospite.