Name: Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri la valutazione della neovascolarizzazione dell'emangioblastoma con l'assay di germogliamento di sferoidi in vitro. Questo metodo rivela il ruolo dell'angiogenesi classica nei tumori vascolari.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Shanghai Comitato della scienza e della tecnologia (15411951800, 15410723200). Gli autori desiderano ringraziare la Prof. ssa YuMei Wen e Prof. ssa Chao Zhao dell'Università Dipartimento microorganismo patogeno di Fudan per loro assistenza tecnica.

Questo metodo è stato eseguito in conformità con le linee guida approvate e i regolamenti della ricerca etica Comitato di Huashan Hospital, Università di Fudan. Misure di sicurezza standard corrispondenti sono stati seguiti in ogni passo. Per una presentazione schematica, fare riferimento alla Figura 1.
1. cultura e costrutto plasmidico delle cellule
<ol><li>Gestire periodicamente delle cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) in Dulbecco s modified medium dell'Aquila (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina in un 5% umidificata incubatore a CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Digerire PLKO.1 plasmide con ApaI ed EcoRI per la sintesi del frammento di shRNA. Assicurarsi che la sequenza del oligonucleotide del vettore di shRNA VHL è CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.</li>
	<li>Quindi, mescolare 20 sistema di µΜ con avanti 5 µ l di oligo, 5 µ l di oligo inversa, 5 µ l di tampone di NEB 10x e 35 µ l di ddH2O insieme (il volume totale è di 50 µ l). Riscaldare la miscela a 98 ° C per 4 min e lentamente raffreddare a temperatura ambiente in poche ore.</li>
	<li>Legare i oligos ricotto e plasmide PLKO.1 insieme ligasi T4 a 4 ° C per una notte. 16 h dopo, aggiungere 5 µ l di mix di legatura in cellule DH5α competente di 25 µ l. Quindi, i plasmidi con successo legati a schermo e verificare il frammento inserito dall'ordinamento.</li>
</ol>2. infezione e pacchetto lentivirus
<ol><li>In totale, mescolare 10 µ g del vettore PLKO.1-shVHL o PLKO.1-shScramble, 7,5 µ g di imballaggio plasmide psPAX2 e 2,5 µ g di busta plasmide pMD2.G in 500 µ l di media DMEM senza siero bovino fetale (FBS) per 25 min.</li>
	<li>Aggiungere 7 mLDMEM senza FBS alla soluzione preparata in precedenza.</li>
	<li>Cellule di cultura 293FT in DMEM senza FBS in piatti di coltura del tessuto un diametro di 10 cm. Assicurarsi che il numero delle cellule 293FT è di 1 x 107 utilizzando un contatore di cellule.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione preparata sopra al mezzo delle cellule 293FT per la transfezione. Nota: La linea cellulare di 293FT è derivato dalla linea cellulare 293F ed esprimere stabilmente il grande T antigene SV40. Pertanto, è un ospite adatto per la produzione di vettori lentivirali.</li>
	<li>Sostituire il terreno di coltura con DMEM contenente 10% FBS dopo 6 h.</li>
	<li>Raccogliere i media usando una pipetta a 48 h dopo la trasfezione. Nota: Il virus esiste in DMEM contenente 10% FBS. Le cellule morte galleggiano sul mezzo. Utilizzare sterile membrana da 0,45 µm per filtrare le cellule morte e le impurità. In generale, non c'è nessuna necessità di controllare la molteplicità di infezione (MOI). Si tratta di stabilire una linea di cellule stabili. Nell'ultima fase, tutte le cellule viventi senza successo infezione morirà da con puromicina. Il gruppo di shScramble e cellule HUVEC sono il gruppo di controllo. Garantire che tutte le cellule HUVEC morire con la concentrazione usata con puromicina 72h. Ogni pozzo ha lo stesso numero di celle.</li>
	<li>Coltura le cellule HUVEC nei media lentivirali per 72 h. Quindi, aggiungere con puromicina ai media delle cellule HUVEC ad una concentrazione di 2 µ g/mL per 24 h. uso cellule HUVEC senza alcun trattamento come gruppo di controllo. Garantire che tutti controllare le cellule muoiono entro questo tempo. Nota: Le cellule viventi rappresentano una linea cellulare stabile delle celle di colpo di VHL e shSramble delle cellule. La densità di placcatura è 5.000/pozzetto in piastre da 96 pozzetti.</li>
</ol>3. generazione di cellule endoteliali sferoidi
<ol><li>Tripsinizzano le cellule HUVEC e risospendere in mezzo DMEM con 10% FBS. Con un numero moderato di cellule in una piastra di coltura di 10 cm, aggiungere 1 mL di typsin-EDTA.</li>
	<li>Le cellule in una piastra a 96 pozzetti fondo tondo 3D, ad una densità di cella di 1 × 10-3 cellule/pozzetto del seme. Utilizzare un pozzo che può ospitare uno sferoide di 0,50 µ l di sospendere la sferoide. Contare le celle utilizzando un sistema di contatore cellulare seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO2 continuamente per 72 h. In queste condizioni, garantire che le cellule sospese formano sferoidi cellulare automaticamente. Sostituire metà nel terreno di coltura dopo 36 h.</li>
</ol>4. analisi di angiogenesi in vitro
<ol><li>Scongelare la soluzione di gel a 4 ° C e diluirlo con il mezzo di siero riduttore con un rapporto di diluizione di 1:5.</li>
	<li>Succhiare gli sferoidi da terreno di coltura DMEM con una micropipetta. Dopo aver lavato le sferoidi con 5 mL di terreno riduttori del siero, sospendere le sferoidi delicatamente e con cautela nel gel diluito. Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria.</li>
	<li>Incorporare 300 µ l di liquido misto in una piastra 15-pozzetti. Dopo incubazione a 37 ° C e 5% CO2 per 1 h, aggiungere 400 µ l il mezzo di riduttore del siero in ciascun pozzetto. Riempire di acqua sterile intorno ai pozzi per generare un ambiente umidificato per ostacolare l'evaporazione.</li>
	<li>Da allora in poi, cultura la piastra a 37 ° C in 5% CO2 al 100% di umidità per 1 h.</li>
	<li>Attentamente il vecchio mezzo di aspirare e sostituirlo con 600 µ l di siero riduttore terreno con i supplementi di crescita delle cellule endoteliali di 1% in ogni pozzetto.</li>
	<li>Dopo 12 ore o 24 ore, prendere le immagini sotto un microscopio ottico invertito (40 *).</li>
</ol>5. analisi dei dati
<ol><li>Caricare le immagini su una piattaforma di analisi di immagine online per ottenere dati di lunghezza del germoglio (Tabella materiali).</li>
	<li>Nella pagina Web, è necessario creare un account di posta elettronica.</li>
	<li>Quindi è possibile caricare le immagini facendo clic sul pulsante carica.</li>
	<li>Scaricare il risultato cliccando sul pulsante Scarica. Nota: Il software genererà l'immagine elaborata e i dati. I dati contengono cinque parti: cumulativo germoglio, germoglio di media lunghezza, la deviazione standard della lunghezza del germoglio, germoglio e sferoide area. Nell'immagine elaborata, ogni parametro è delineato in un colore diverso per semplificare l'identificazione nell'immagine elaborata: germogli di rosso rappresenta lo scheletro, giallo il numero di germogli, blu la struttura germoglio, germoglio bianco fine e arancia sferoide.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
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<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
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<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
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<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Recentemente, più campi di ricerca di biologia vascolare sono stati stimolati dallo studio dell' endotelio angiogenici15. In questo articolo, abbiamo sviluppato uno sferoide endoteliale germogliatura tecnica come modello sperimentale per studiare la formazione del vaso che proviene dalla perdita del gene VHL di funzione in cellule endoteliali manipolate identificare molecole candidate romanzo della cascata angiogenica. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo rapporto per esaminare gli...

Hemangioblastomas (HBs) sono tumori vascolari benigni che si trovano esclusivamente nell'ambito umano sistema nervoso centrale (CNS). Si sviluppano in pazienti con malattia di von Hippel-Lindau (VHL) o lesioni sporadiche. VHL-HBs sono difficili da curare attraverso trattamento chirurgico a causa della frequente ricorrenza e lesioni multiple che derivano da questo genetico disturbo1. Sebbene l'inattivazione del gene soppressore del tumore VHL è stata considerata la causa principale di tumorigenesis di VHL-HBs, l'origine citologica (tra cui neovascolarizzazione) e il processo evolutivo di HBs rimangono in gran parte controverso2. Di conseguenza, una migliore comprensione dei meccanismi biologici HB-neovascolare può fornire utili intuizioni più promettenti strategie anti-vascolare per VHL-HBs.
Recenti ricerche hanno suggerito che HB-neovascolarizzazione è simile alla vasculogenesi embriologica3,4,5. Classico fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)-mediata angiogenesi che ha provenuto dall'endotelio vascolare e che è guidato da perdita VHL di funzione ha provocato la proliferazione e la formazione neovascolare, che è stato sfidato6. Nel 1965, Cancilla e Zimmerman trovato, usando la microscopia, HBs originata dal endotelio7. Più successivamente è stato trovato che le cellule stromal sono derivate da vasoformative elemento8. Nel 1982, Vladimír et al ha trovato che le cellule stromale sono di origine endoteliale9. Pertanto, abbiamo ipotizzato che le cellule endoteliali vascolari umane sono celle originali di HB-neovascularization10. Anche se è preferibile utilizzare le colture primarie da HB cellule derivate da pazienti ambulatori VHL, la nostra ricerca precedente indicato che colture primarie da HB non sono stabili, e linee cellulari non potevano essere stabilita3. Inoltre, le colture primarie nell'ambiente 3D non ha potevano identificare l'origine citologica della HB-neovascolarizzazione perché essi comprendono i progenitori di HB-vascolare ingredienti10,11. Pertanto, come un modello classico e primitivo delle cellule endoteliali, cellule vascolari endoteliali (HUVEC) potrebbero servire come modello cellulare alternativo per HBs.
Il dosaggio di germogliatura sferoide è un nuovo modello in tessuto ingegneria12,13. In questa carta, un 3D basati su collagene coculture sistema in vitro utilizzando la sferoide germogliatura dosaggio è stato sviluppato, con un obiettivo globale per valutare se l'angiogenesi del tumore classico esiste in HBs, come pure il suo ruolo in HBs.

<table><tbody><tr><td>cellula endoteliale della vena ombelicale umana</td><td>Fudan IBS Cell Center</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco' s aquila modificata' s medio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puro vector</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>plasmide di imballaggio psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>plasmide a busta pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>Piastre 3D a fondo tondo a 96 pozzetti</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>siero ridotto</td></tr><tr><td>piastra a 15 pozzetti</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>Le bolle d'aria nel gel possono essere ridotte equilibrando il &mu; &ndash; Angiogenesi a vetrino prima dell'uso all'interno dell'incubatore durante la notte</td></tr> integratori <tr><td>per la crescita delle cellule endoteliali</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 10 cm</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>tipo-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizzato di conteggio delle cellule &nbsp;</td><td>Software</td> di analisi delle immagini BioTech<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Winmasis</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

una procedura completa per valutare le prestazioni in vitro del hemangioblastoma neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

L'inattivazione del gene soppressore del tumore del von Hippel-Lindau (VHL) svolge un ruolo cruciale nello sviluppo dei hemangioblastomas (HBs) entro l'umano sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, sia l'origine citologica e il processo evolutivo di HBs (tra cui neovascolarizzazione) rimangono discutibili, e anti-angiogenesi per VHL-HBs, basato sul classico HB angiogenesi, hanno prodotto risultati deludenti in studi clinici. Uno dei principali ostacoli per il successo clinico di trattamento anti-vascolare è la mancanza di una conoscenza approfondita della neovascolarizzazione in questo tumore vascolare. In questo articolo, presentiamo una procedura completa per valutare in vitro se l'angiogenesi del tumore classico esiste in HBs, come pure il suo ruolo in HBs. Con questa procedura, i ricercatori possono accuratamente comprendere la complessità del neovascularization HB e identificare la funzione di questa forma comune dell'angiogenesi in HBs. Questi protocolli possono essere utilizzati per valutare la terapia anti-vascolare più promettente per i tumori, che ha alto potenziale traslazionale per trattamento di tumori o per aiutare nell'ottimizzazione del trattamento anti-angiogenico per HBs in futuro traduzioni. I risultati evidenziare la complessità della neovascolarizzazione HB e suggeriscono che questa comune forma l'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB neovascolarizzazione.

Immagini originali vengono prese dal microscopio ottico invertito. Le immagini tipiche del gruppo di controllo e del gruppo VHL sono mostrate nella Figura 2-A1 e Figura 2-A2. La lunghezza di germogliatura del gruppo di controllo è inferiore a quella del gruppo di VHL.
Dopo aver caricato le immagini, la piattaforma online fornisce dirett...

Questa carta presenta una procedura completa per valutare in vitro in esistenza l'angiogenesi del tumore classico nel hemangioblastomas (HBs) e del suo ruolo in HBs. I risultati evidenziare la complessità della HB-neovascolarizzazione e suggeriscono che questa forma comune dell'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB-neovascolarizzazione.

Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare le prestazioni della presunta neovascolarizzazione dell'emangioblastoma utilizzando il saggio di germinazione degli sferoidi in vitro. Il metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo angiogenico, come l'angiogenesi tumorale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il prodotto di una procedura completa per valutare in vitro dove l'angiogenesi tumorale classica esiste nell'emangioblastoma e cresce nell'emangioblastoma.L'implicazione di questa tecnica si estende alla terapia dell'emangioblasto e della vascolarizzazione perché il risultato evidenzia la complessità dell'emangioblasto neovascolarizzazione e ciò suggerisce che questa forma comune di angiogenesi è solo un meccanismo complementare. Quindi questo metodo può fornire informazioni sullo studio dell'emangioblasto o della neovascolarizzazione. Può anche essere applicato ai tumori, all'angiogenesi e all'applicazione correlata alla vasculogenesi in alcuni tumori solidi, come il mimetismo vasculogenico tumorale nel tumore vetro.La dimostrazione reale di questo metodo è fondamentale in quanto la generazione di questi passaggi sferoidi delle cellule endoteliali manipolate è difficile da imparare. Perché le condizioni adeguate sono importanti. In primo luogo, coltivare le cellule endoteliali HUVEC in terreno di coltura DMEM integrato con il dieci percento di siero fetale bovino, penicillina e streptomicina.Quindi, mantenere la coltura nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica. Successivamente, per sintetizzare il frammento di shRNA, digerire il plasmide con gli enzimi di restrizione ApaI ed EcoRI. Quindi, al plasmide digerito, aggiungere sia l'oligo diretto che quello inverso, il tampone NEB 10x e l'acqua distillata doppia fino a un volume finale di 50 microlitri.Dopo aver aggiunto tutti i reagenti, scaldare la miscela a 98 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi, raffreddare gradualmente a temperatura ambiente nell'arco di poche ore. Utilizzare la ligasi T4 per legare gli oligo ricotti e il plasmide.Incubare la provetta a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, aggiungere cinque microlitri di miscela di legatura a 25 microlitri di cellule competenti DH5alfa. In 500 microlitri di terreno DMEM, aggiungere il vettore lentivirale o il vettore criptato, insieme ad altri plasmidi da imballaggio.Quindi, incubare la miscela lentivirale per 25 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere 7 millilitri di terreno DMEM alla soluzione mista strapazzata o lentivirale. Coltura delle cellule 293FT in terreno DMEM senza siero fetale bovino in un piatto di coltura di 10 centimetri.Aggiungere un millilitro di soluzione lentivirale o strapazzata alle cellule 293FT nel piatto di coltura. Dopo sei ore, aspirare il vecchio terreno dal piatto di coltura. Quindi, sostituire il vecchio terreno con un terreno DMEM fresco contenente il 10% di siero fetale bovino.Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo. Trasferire le cellule endoteliali HUVEC nel terreno lentivirale e mantenerle per 72 ore. Quindi, aggiungere due microgrammi per millilitro di puromicina al terreno di coltura cellulare HUVAC.Infine, incubare la coltura per altre 24 ore. Il giorno successivo, aggiungere un millilitro di tripsina EDTA per tripsinizzare le cellule HUVEC. Quindi risospendere la sospensione cellulare tripsinizzata in terreno DMEM con il 10% di siero fetale bovino.Conta il numero di celle utilizzando un contatore di celle. Dopo il conteggio, seminare le cellule in una piastra 3D a fondo rotondo a 96 pozzetti. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica per 72 ore ininterrottamente.Dopo 36 ore, sostituire metà del terreno di coltura con terreno fresco. Per prima cosa, scongelare la soluzione di gel a quattro gradi Celsius, quindi diluirla in un rapporto da uno a cinque con il mezzo di siero ridotto. Aspirare gli sferoidi dal mezzo DMEM utilizzando una micropipetta.Quindi, lavare gli sferoidi con cinque millilitri di siero ridotto. Trasferire con cura gli sferoidi sospesi e il gel diluito. In una piastra da 15 pozzetti, incorporare 300 microlitter del liquido misto di sferoidi e gel diluito.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere 400 microlitri di terreno sierico ridotto in un singolo pozzetto. Per evitare l'evaporazione, riempire l'ambiente circostante il pozzo con acqua sterile.Quindi, coltiva le cellule a 37 gradi Celsius, al cinque percento di anidride carbonica e al 100 percento di umidità per un'ora. Dopo l'incubazione, aspirare il vecchio terreno e aggiungere 600 microlitri di siero ridotto con l'uno per cento di integratore per la crescita delle cellule endoteliali al pozzetto e incubare per un giorno. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a luce invertita.Qui, la germinazione sferoidale delle cellule viene catturata utilizzando il microscopio ottico invertito per studiare l'effetto del silenziamento del gene VHL sul potenziale angiogenico delle cellule endoteliali. Si vede che uno sferoide germoglia 12 ore dopo il trattamento lentivirale sia nelle cellule endoteliali di controllo che in quelle silenziate VHL. Successivamente, viene eseguita l'analisi statistica per quantificare la lunghezza dei germogli generati dagli sferoidi silenziati del gene VHL.La lunghezza media dei germogli sembra essere di circa 125 micrometri nei gruppi silenziati VHL, mentre è solo di circa 65 micrometri nel gruppo di controllo. La lunghezza media cumulativa dei germogli del gruppo silenziato VHL è di circa 1250 micrometri, mentre quella del gruppo di controllo è di 680 micrometri. Questi risultati indicano un aumento di due volte della lunghezza dei germogli nei gruppi silenziati VHL.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura e un metodo come il test di formazione capillare è possibile eseguire il test per rispondere a ulteriori domande. Come esplorare la capacità angiogenica delle cellule endoteliali vascolari.Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'angiogenesi per esplorare la vascolarizzazione interna del tumore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di quali geni perdono una funzione nelle cellule endoteliali manipolate utilizzate per il saggio esplosivo.

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L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Il protocollo descrive come progettare una rete vascolare perfusable in uno sferoide. Microambiente circostante di sferoide è inventato per indurre l'angiogenesi e collegare la sferoide a microcanali in un dispositivo microfluidico. Il metodo consente la perfusione della sferoide, che è una tecnica tanto atteso nelle culture tridimensionale.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

Questa presenta protocollo una perlina di romanzo in vitro test che più modelli in modo appropriato il processo di in vivo l'angiogenesi di germogliatura incorporando i periciti. Questa modifica consente il dosaggio di perlina di ricapitolare più fedelmente le interazioni cellulari eterotipiche tra cellule endoteliali e cellule murale che sono critiche per l'angiogenesi.

Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura

Questo metodo descrive la coltura delle cellule endoteliali derivate da iPSC come 40 micronavi 3D perfuse in una piattaforma microfluidica standardizzata. Questa piattaforma consente lo studio della germogliazione angiogenica basata su gradienti in 3D, tra cui l'anastomosis e la stabilizzazione dei germogli angiogenici in modo scalabile e ad alta produttività.

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide di co-cultura tridimensionale è progettato per imitare l'angiogenesi fisiologica. Gli sferoidi della co-coltura sono formati da due precursori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC, e incorporati nel gel di collagene. Il nuovo sistema è efficace per valutare i modulatori angiogenici e fornisce informazioni più rilevanti allo studio in vivo.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Questo protocollo presenta il saggio di germinazione coroide, un modello ex vivo di proliferazione microvascolare. Questo saggio può essere utilizzato per valutare le vie coinvolte nei micro vasi cororoidali proliferano e valutare i trattamenti farmacologici utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.

Un test di germinazione coroide ex vivo di angiogenesi microvascolare oculare

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Qui, presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta ed economica di sferoidi tumorali seguita dall'incapsulamento dell'idrogel. È ampiamente applicabile in quanto non richiede attrezzature specializzate. Sarebbe particolarmente utile per esplorare le interazioni sferoide-matrice e costruire modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro .

Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

Questo studio presenta il saggio bidimensionale (2D) di migrazione della ferita da graffio e il saggio tridimensionale (3D) di germinazione degli sferoidi, insieme ai rispettivi metodi di analisi a valle, tra cui l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica, come saggi adatti per studiare l'angiogenesi in vitro.

Indagine sull'angiogenesi a livello funzionale e molecolare sfruttando il saggio di migrazione della ferita da graffio e il saggio di germinazione sferoidale

Scopri la valutazione della neovascolarizzazione dell'emangioblastoma con l'assay di germogliamento di sferoidi in vitro. Questo metodo rivela il ruolo dell'angiogenesi classica nei tumori vascolari.

Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay (Video) | JoVE Journal

Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

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