Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare le prestazioni della presunta neovascolarizzazione dell'emangioblastoma utilizzando il saggio di germinazione degli sferoidi in vitro. Il metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo angiogenico, come l'angiogenesi tumorale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il prodotto di una procedura completa per valutare in vitro dove l'angiogenesi tumorale classica esiste nell'emangioblastoma e cresce nell'emangioblastoma.

L'implicazione di questa tecnica si estende alla terapia dell'emangioblasto e della vascolarizzazione perché il risultato evidenzia la complessità dell'emangioblasto neovascolarizzazione e ciò suggerisce che questa forma comune di angiogenesi è solo un meccanismo complementare. Quindi questo metodo può fornire informazioni sullo studio dell'emangioblasto o della neovascolarizzazione. Può anche essere applicato ai tumori, all'angiogenesi e all'applicazione correlata alla vasculogenesi in alcuni tumori solidi, come il mimetismo vasculogenico tumorale nel tumore vetro.

La dimostrazione reale di questo metodo è fondamentale in quanto la generazione di questi passaggi sferoidi delle cellule endoteliali manipolate è difficile da imparare. Perché le condizioni adeguate sono importanti. In primo luogo, coltivare le cellule endoteliali HUVEC in terreno di coltura DMEM integrato con il dieci percento di siero fetale bovino, penicillina e streptomicina.

Quindi, mantenere la coltura nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica. Successivamente, per sintetizzare il frammento di shRNA, digerire il plasmide con gli enzimi di restrizione ApaI ed EcoRI. Quindi, al plasmide digerito, aggiungere sia l'oligo diretto che quello inverso, il tampone NEB 10x e l'acqua distillata doppia fino a un volume finale di 50 microlitri.

Dopo aver aggiunto tutti i reagenti, scaldare la miscela a 98 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi, raffreddare gradualmente a temperatura ambiente nell'arco di poche ore. Utilizzare la ligasi T4 per legare gli oligo ricotti e il plasmide.

Incubare la provetta a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, aggiungere cinque microlitri di miscela di legatura a 25 microlitri di cellule competenti DH5alfa. In 500 microlitri di terreno DMEM, aggiungere il vettore lentivirale o il vettore criptato, insieme ad altri plasmidi da imballaggio.

Quindi, incubare la miscela lentivirale per 25 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere 7 millilitri di terreno DMEM alla soluzione mista strapazzata o lentivirale. Coltura delle cellule 293FT in terreno DMEM senza siero fetale bovino in un piatto di coltura di 10 centimetri.

Aggiungere un millilitro di soluzione lentivirale o strapazzata alle cellule 293FT nel piatto di coltura. Dopo sei ore, aspirare il vecchio terreno dal piatto di coltura. Quindi, sostituire il vecchio terreno con un terreno DMEM fresco contenente il 10% di siero fetale bovino.

Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo. Trasferire le cellule endoteliali HUVEC nel terreno lentivirale e mantenerle per 72 ore. Quindi, aggiungere due microgrammi per millilitro di puromicina al terreno di coltura cellulare HUVAC.

Infine, incubare la coltura per altre 24 ore. Il giorno successivo, aggiungere un millilitro di tripsina EDTA per tripsinizzare le cellule HUVEC. Quindi risospendere la sospensione cellulare tripsinizzata in terreno DMEM con il 10% di siero fetale bovino.

Conta il numero di celle utilizzando un contatore di celle. Dopo il conteggio, seminare le cellule in una piastra 3D a fondo rotondo a 96 pozzetti. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica per 72 ore ininterrottamente.

Dopo 36 ore, sostituire metà del terreno di coltura con terreno fresco. Per prima cosa, scongelare la soluzione di gel a quattro gradi Celsius, quindi diluirla in un rapporto da uno a cinque con il mezzo di siero ridotto. Aspirare gli sferoidi dal mezzo DMEM utilizzando una micropipetta.

Quindi, lavare gli sferoidi con cinque millilitri di siero ridotto. Trasferire con cura gli sferoidi sospesi e il gel diluito. In una piastra da 15 pozzetti, incorporare 300 microlitter del liquido misto di sferoidi e gel diluito.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere 400 microlitri di terreno sierico ridotto in un singolo pozzetto. Per evitare l'evaporazione, riempire l'ambiente circostante il pozzo con acqua sterile.

Quindi, coltiva le cellule a 37 gradi Celsius, al cinque percento di anidride carbonica e al 100 percento di umidità per un'ora. Dopo l'incubazione, aspirare il vecchio terreno e aggiungere 600 microlitri di siero ridotto con l'uno per cento di integratore per la crescita delle cellule endoteliali al pozzetto e incubare per un giorno. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a luce invertita.

Qui, la germinazione sferoidale delle cellule viene catturata utilizzando il microscopio ottico invertito per studiare l'effetto del silenziamento del gene VHL sul potenziale angiogenico delle cellule endoteliali. Si vede che uno sferoide germoglia 12 ore dopo il trattamento lentivirale sia nelle cellule endoteliali di controllo che in quelle silenziate VHL. Successivamente, viene eseguita l'analisi statistica per quantificare la lunghezza dei germogli generati dagli sferoidi silenziati del gene VHL.

La lunghezza media dei germogli sembra essere di circa 125 micrometri nei gruppi silenziati VHL, mentre è solo di circa 65 micrometri nel gruppo di controllo. La lunghezza media cumulativa dei germogli del gruppo silenziato VHL è di circa 1250 micrometri, mentre quella del gruppo di controllo è di 680 micrometri. Questi risultati indicano un aumento di due volte della lunghezza dei germogli nei gruppi silenziati VHL.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura e un metodo come il test di formazione capillare è possibile eseguire il test per rispondere a ulteriori domande. Come esplorare la capacità angiogenica delle cellule endoteliali vascolari.

Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'angiogenesi per esplorare la vascolarizzazione interna del tumore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di quali geni perdono una funzione nelle cellule endoteliali manipolate utilizzate per il saggio esplosivo.