Name: Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Impara a costruire una rete vascolare perfusibile in sferoidi utilizzando una piattaforma microfluidica. Questo metodo consente di simulare la somministrazione di farmaci in modelli di tessuto in vitro per la medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato supportato dalla cresta JST (concessione numero JPMJCR14W4), società per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI (codice di autorizzazione 25600060, 16K 16386), il centro di innovazione programma dal MEXT e JST, progetto incentrato su sviluppo di tecnologia chiave valutazione da Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo, AMED, Mizuho Fondazione per la promozione delle scienze. Microfabbricazione è stata sostenuta da Kyoto University Nano tecnologia Hub.

1. fabbricazione della muffa dispositivo microfluidico
<ol><li>Progettare il modello del dispositivo microfluidico utilizzando il software disponibile in commercio (Clewin5 o AutoCAD 2016, ecc.). Per la funzione della Clewin5, vedere il manuale dell'utente (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual). Nota: Il file di disegno è disponibile in 1 File supplementari.</li>
	<li>Trasferire il file di disegno in un generatore di pattern micro e caricare lo strumento con una maschera di cromo rivestita con il photoresist positivo.</li>
	<li>Esporre il photoresist positivo nell'area di modello utilizzando un generatore di micro fantasia.</li>
	<li>Sviluppare il photoresist positivo utilizzando lo sviluppatore (Tabella materiali) e sciacquare la maschera con acqua deionizzata (DI).</li>
	<li>Utilizzando il mordenzante di cromo (Tabella materiali), etch il cromo sulla superficie esposta, dove è stato rimosso il photoresist positivo. Sciacquare la maschera con dell'acqua distillata.</li>
	<li>Rimuovere il restante photoresist sulla maschera utilizzando acetone. Nota: La maschera di trasparenza può essere un'alternativa per la maschera di Cr.</li>
	<li>Preparare un wafer di silicio pulito (4 pollici, P(100)) e spin cappotto esametildisilazano (HMDS) a 3.000 giri/min per 30 s.</li>
	<li>Softbake HMDS per 5 min a 120 ° C e raffreddare la cialda per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Spincoat il photoresist negativo (tabella materiali) a 500 giri/min per 10 s e 1.200 rpm per 30 s. Nota: La condizione di rivestimento di rotazione deve cedere gli strati di photoresist con uno spessore di circa 100 µm sui wafer dopo fotolitografia.</li>
	<li>Prebake il photoresist negativo per 45 min a 95 ° C e raffreddare la cialda per 60 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Controllare l'intensità della luce UV in ogni esperimento e calcolare il tempo di esposizione per una dose di energia di esposizione totale a 250 mW/cm2. Posizionare il photomask (passo 1.1-1.6) sul wafer ed esporli alla luce UV.</li>
	<li>Postbake il photoresist negativo per 1 min a 65 ° C e 5 min a 95 ° C. Consentire la cialda raffreddare per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sviluppare lo strato di photoresist negativo per 15 minuti nel primo bagno sviluppatore (Tabella materiali) e a 2 min nel secondo bagno. Sciacquare la cialda nel primo bagno di isopropanolo (IPA) per 10 s e nel secondo bagno IPA per 10 s.</li>
	<li>Hardbake il photoresist negativo per 30 min a 200 ° C e raffreddare la cialda per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Misurare lo spessore dello strato di photoresist negativo utilizza un profiler di superficie.</li>
	<li>Posizionare la cialda in un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto e aggiungere 200 µ l di silano (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Accendere la pompa per 10 min, poi spegnerlo e mantenere la cialda nell'essiccatore per 4 h.</li>
</ol>2. fabbricazione passaggi e l'assemblaggio di strati PDMS
<ol><li>Eseguire il cast il polidimetilsilossano (PDMS) pre-polimero (PDMS base: agente indurente = 10:1 (w/w)) e degassare in una camera a vuoto per 2 h.</li>
	<li>Cura PDMS a 80° C in un forno di sfiato aria durante la notte.</li>
	<li>Staccare il PDMS da wafer di silicio.</li>
	<li>Perforare i fori 1A - 3B (Figura 1) e la cultura di sferoide bene. Utilizzare un punzone di diametro di 2 mm per fori 1A - 3B e un diametro di 1 mm di perforazione per la sferoide bene.</li>
	<li>Pulire la lastra PDMS e un vetro vetrino coprioggetti (24 × 24 mm) con nastro adesivo, ripetutamente attaccando e staccando il nastro. Trattare quindi la lastra PDMS con plasma ad aria per 40 s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>Legare la lastra PDMS sul vetro vetrini coprioggetto di espellere eventuali bolle d'aria dalla superficie tra la lastra PDMS e il coprioggetto e la cura a 80 ° C per almeno 12 ore.</li>
</ol>3. sferoide preparazione
Nota: Nello studio, proteina fluorescente rossa esprimendo ombelicale umano vena cellule endoteliali (RFP-HUVECs) e che esprimono la proteina fluorescente verde HUVECs (GFP-HUVECs) vengono utilizzati nel sferoide e microcanali, rispettivamente, per distinguere l'origine di HUVECs dopo la costruzione di una rete vascolare perfusable. Se l'origine di HUVECs non è necessario, senza etichetta HUVECs sono sufficienti per l'esperimento.
<ol><li>Scongelare la RFP-HUVECs (3,0 × 105 cellule/flaconcino) e dei fibroblasti di polmone umano (hLF) (1,0 × 106 cellule/flaconcino) e aggiungerli in 10 mL di medium per le cellule endoteliali e fibroblasti, rispettivamente (Tabella materiali). Cultura li in un piatto di 100 mm a 37 ° C e 5% CO2 per 2-3 giorni per sub-confluente RFP-HUVECs e hLFs. Questa preparazione resa ~ 200 sferoidi.</li>
	<li>Staccare la RFP-HUVECs e hLFs dai piatti con 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% e interrompere la reazione di tripsina con 4 mL di DMEM contenente 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS) e 1% (v/v) penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Dopo centrifugazione a 220 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e risospendere il RFP-HUVECs e hLFs nel medio endoteliale e le concentrazioni di cella finale a 2,5 × 104 e 1,0 × 105 cellule/mL, rispettivamente.</li>
	<li>Delicatamente aggiungere 200 µ l della sospensione delle cellule (5.000 cellule per RFP-HUVECs) e 20.000 cellule per hLFs per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con superficie obbligatoria ultra-bassa.</li>
	<li>Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C e 5% CO2 per un periodo di 2-4 giorni. Nota: Poiché il diametro della sferoide dipende il periodo di coltura e il numero iniziale delle cellule della piastra a 96 pozzetti, può essere controllato da questi due parametri.</li>
</ol>4. semina nel dispositivo microfluidico cellulare
Nota: La convenzione di denominazione per i fori, canali e la sferoide bene sono illustrati nella Figura 1. Definiamo il giorno quando è terminata la raccolta delle cellule nel dispositivo microfluidico giorno 0. Schema di sequenze temporali sperimentale è illustrato nella Figura 2.
<ol><li>Caricamento della sferoide − 1 giorno) Nota: Il passaggio seguente deve essere eseguito sul ghiaccio per evitare la gelificazione del collagene e della fibrina.<ol>
<li>Sciogliere il fibrinogeno in tampone fosfato salino (PBS) per una concentrazione finale di 2,80 mg/mL.</li>
		<li>Preparare collagene neutralizzato (3,0 mg/mL in PBS) secondo il protocollo del produttore.</li>
		<li>Combinare 107,2 µ l di soluzione di fibrinogeno (2,80 mg/mL), 8.0 µ l di collagene neutralizzato (3,0 mg/mL) e 3,6 µ l di aprotinina (5 U/mL) per reazione in un tubo. Questa soluzione è etichettata "master mix soluzione" (MS). Nota: Il volume è sufficiente per il caricamento di uno sferoide. Se non c'è più di uno sferoide, moltiplicare ogni volume per il numero di sferoidi.</li>
		<li>Sciogliere la trombina in PBS per una concentrazione finale di 50 U/mL. Nota: Le aliquote di trombina di 50 U/mL (20 µ l/tubo) sono conservate a − 30 ° C e vengono scongelate prima di ogni esperimento.</li>
		<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti contenenti sferoidi all'interno della cappa di biosicurezza.</li>
		<li>Preparare due piastre di Petri di 35 mm all'interno della cappa di biosicurezza, con un piatto sul ghiaccio (piatto 1) e l'altro piatto sul banco (piatto 2). Dispensare 99 µ l di MS al centro del piatto 1 (Figura 3a) per formare una goccia.</li>
		<li>Tagliare le punte delle 2 gialli (10-100 µ l) e 3 trasparente puntali per pipette (1-100 µ l) per la raccolta di sferoidi dalla piastra 96 pozzetti, miscelazione di trombina con MS, precisa raccolta di sferoidi, iniettando sferoidi nel dispositivo e iniettare il dispositivo multimediale , rispettivamente. Il formato del poro della punta dovrebbe essere leggermente più grande rispetto al diametro dei fori 1A - 3B dei canali 1 e 3, o in forma sferoide bene nel canale 2 per un'aderenza perfetta. Nota: D'ora in avanti, se non specificato diversamente, utilizzare i puntali per tagliare in questo passaggio. La fotografia del tagliati suggerimenti è disponibile nella Figura 4.</li>
		<li>Raccogliere uno sferoide con 100 µ l di terreno dalla piastra a 96 pozzetti e aggiungerlo al piatto 2 (Figura 3a).</li>
		<li>Ritirare la sferoide con un volume minimo di media da piatto 2. Tenendo la pipetta in posizione verticale, la sferoide dovrebbe spostare verso il basso della punta della pipetta per gravità. Espellere la sferoide toccando il puntale sul menisco della goccia MS in piatto 1 (Figura 3a). Nota: La procedura seguente 4.1.10 & 4.1.11 dovrebbe essere eseguita rapidamente.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l della trombina (50 U/mL) e mescolare delicatamente con la punta della pipetta giallo.</li>
		<li>Con la pipetta impostata a 7 µ l, pick up lo sferoide e lentamente posizionarlo nel pozzo della sferoide (Figura 3b).</li>
		<li>Incubare per 15 min a 37 ° C per la gelificazione di fibrina.</li>
		<li>Iniettare lentamente il mezzo endoteliale da canali 1A e 3A e riempimento di fori 1 e 3 con i media (20 ~ 30 µ l/canale).</li>
		<li>Collocare il dispositivo in un piatto di 100 mm con un Kimwipe umido per evitare l'evaporazione dei media dal dispositivo (Figura 3C).</li>
		<li>Posizionare il dispositivo a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h rimuovere le bolle all'interfaccia tra i media e la fibrina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 0) HUVECs caricamento<ol>
<li>Scongelare la GFP-HUVECs (3.0 x 105 cellule/flacone) e aggiungerli a 10 mL di terreno endoteliale. Della loro coltura in un piatto di 100 mm a 37 ° C e 5% di CO2 per 2-3 giorni raggiungere confluency di sub. Un piatto di Sub-confluenti GFP-HUVECs è sufficiente per la preparazione di 8-10 dispositivi.</li>
		<li>Staccare la GFP-HUVECs dai piatti con 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% e interrompere la reazione di tripsina con 4 mL di DMEM contenente 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS) e 1% (v/v) penicillina/streptomicina.</li>
		<li>Dopo centrifugazione a 220 x g per 3 min, Risospendere la GFP-HUVECs nel medium endoteliale a 5,0 x 106 cellule/mL.</li>
		<li>Iniettare la sospensione cellulare HUVECs nel canale 1 attraverso il foro 1B (20 µ l/canale).</li>
		<li>Inclinare il dispositivo microfluidico 90°, posizionarlo sul lato e incubare a 37 ° C per 30 min garantire che il HUVECs aderiscono alla fibrina nel canale 2.<ol>
<li>Confermare l'attacco di HUVECs sulla fibrina. Quando il numero di HUVECs associata all'interfaccia fra il gel e il mezzo non è sufficiente, il sistema vascolare può essere disconnesso alla radice vascolare dopo pochi giorni della cultura dispositivo (Figura 5). Nel protocollo, il tasso di successo della perfusione è > 50%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ripetere i passaggi 4.2.4 e 4.2.5 per il canale 3.</li>
		<li>Cellule di cultura in un piatto di 100 mm con un Kimwipe umido a 37 ° C e 5% di CO2 per 7-14 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 1 ~) scambio di supporti<ol>
<li>Cambio di metà dei mezzi di comunicazione nei canali 1 e 3 ogni giorno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. nuclei colorazione
<ol><li>Preparare 4% paraformaldeide (PFA) in PBS.</li>
	<li>Rimuovere il supporto dai canali 1 e 3 e aggiungere 20 µ l del 4% PFA per canale. Per sostituire la soluzione in 4% PFA, ripetere la soluzione di rimozione dal dispositivo e l'aggiunta di 4% PFA tre volte.</li>
	<li>Incubare il dispositivo a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere i 4% PFA dal dispositivo e lavare i canali tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di 10 µ g/mL il colorante fluorescente (Tabella materiali) per canale a macchiare i nuclei cellulari. Per scambiare la soluzione nel dispositivo, ripetere la soluzione la rimozione dal dispositivo e l'aggiunta di 10 µ g/mL il colorante fluorescente tre volte.</li>
	<li>Conservare il dispositivo a 4 ° C per 24 h.</li>
</ol>6. liquido perfusione di uno sferoide
<ol><li>Preparare la sferoide dopo la coltura per più di 7 giorni nel dispositivo a 37 ° C e 5% CO2 per il completamento di un continuo percorso vascolare.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo da fori 1A, 1B, 3A e 3B.</li>
	<li>Introdurre 10 µ l di soluzione di 10 µM di isotiocianato di fluorescina (FITC)-destrano in PBS in fori 1A e 1B.</li>
	<li>Monitorare il flusso di microsfere o FITC colorante sotto un microscopio invertito.</li>
</ol>7. quantificazione della lunghezza del germoglio
Nota: ImageJ ver. 1,49 software viene utilizzato per tutte le analisi dell'immagine in questo studio.
<ol><li>Si sovrappongono le immagini di GFP-HUVECs giorni 0, 1, 3, 5 e 7.</li>
	<li>Sottrarre la posizione della punta del sistema vascolare del giorno 0 dalla stessa posizione alle immagini scattate nei giorni 1, 3, 5 e 7.</li>
	<li>Determinare la crescita della punta vascolare dalla posizione di radice (Figura 6). La distanza tra la punta vascolare e la radice è stata definita come la lunghezza del germoglio in questo studio (Figura 7b).</li>
</ol>8. quantificazione degli angoli vascolari
Nota: Angolo vascolare è stato definito come l'angolo consisteva di angolo vascolare, radice e il centro della sferoide (Figura 7C).
<ol><li>Binarize le immagini fluorescenti della sferoide coculture contenente RFP-HUVECs e misurare la posizione di "baricentro" dalla funzione di analisi in ImageJ. In questo studio, la posizione misurata "baricentro" è definita come il centro della sferoide (Figura 6).</li>
	<li>Determinare la posizione delle punte vascolare e radici nel stesso modo nel passaggio 7.</li>
	<li>Misurare gli angoli vascolari utilizzando la funzione di analisi software ImageJ.</li>
</ol>

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</ol>

L'autore dichiara che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

I rapporti precedenti mostrano che hLFs secernono un cocktail di più fattori angiogenici, quali angiopoietina-1, angiogenina, fattore di crescita dell'epatocita, trasformando la crescita fattore-α, il fattore di necrosi tumorale e alcune proteine di matrice extracellulare29, 30. Questo test si basa sulla secrezione angiogenica da hLFs in uno sferoide coculture, che è la limitazione della tecnica. Pertanto, è fondamentale per una formazione vascolare stabile impo...

Passaggio da una cultura (bidimensionale) monostrato a una cultura tridimensionale è motivato dalla necessità di lavorare con modelli di cultura che imitano le funzioni cellulari di vivere tessuti1,2,3. Piatti e rigidi substrati plastici comunemente usati nella coltura delle cellule non assomigliano a maggior parte degli ambienti extracellulare nel corpo umano. Infatti, molti studi dimostrano che cultura tridimensionale ricrea tessuto-specifica architettura, meccanici e biochimici spunti e comunicazione cellula-cellula, che non sono state osservate in coltura convenzionale bidimensionale4, 5,6,7,8.
Un aggregato pluricellulare o sferoide, è una delle tecniche più promettenti per rendersi conto di questa cultura tridimensionale9,10. Le cellule secernono la matrice extracellulare (ECM) e possono interagire con altri utenti la sferoide. Anche se alcuni altri bioingegneria si avvicina13,12,11,14, come cellula di impilamento, replicare con successo la complessità spaziale del corpo umano, questi approcci hanno solo due o tre tipi di cellule per la facilità di analisi e concentrato sulla sola funzione di organi bersaglio. Al contrario, le cellule in sferoidi sono esposte agli ambienti di cultura diversa a seconda delle loro posizioni in sferoide dovuto il rifornimento eterogeneo di nutrienti, ossigeno e paracrini e autocrini segnalando le molecole nella sferoide. Questa caratteristica di sferoidi imita parzialmente in vivo condizione cultura e attiva le cellule in sferoidi a creare tessuti molto più complesso, organizzato struttura in vitro rispetto a quelle coltivate in sovrapposizione tessuto9, 15 , 16. si noti che se uno sferoide è costituito da un solo tipo di cellule, la funzione delle cellule nella sferoide non è uniforme a causa dell'ambiente eterogeneo nella sferoide. Negli ultimi anni, culture sferoide ammessi cellule staminali embrionali (ESC), ha indotte le cellule staminali pluripotenti (iPSCs) o cellule staminali tessuto-residente di imitare in vivo dello sviluppo sequenze e ricreare mini-organi come il cervello17, del fegato del rene e1819,20.
Nonostante i significativi progressi nelle tecniche di cultura sferoide, coltura sferoidi grande per lungo tempo è ancora problematica. In un tessuto tridimensionale, le cellule hanno bisogno di trovarsi all'interno di 150-200 µm di un vaso sanguigno a causa della quantità limitata di ossigeno e sostanze nutritive21. Reti vascolari all'interno della sferoide sono necessari per lo scambio di sostanze tra sangue e tessuti in vivodi ricapitolare. Per raggiungere questo obiettivo, altri gruppi hanno co-colture di cellule endoteliali con destinazione cellule22,23,24 o indotto la differenziazione delle cellule pluripotenti in CD31-positivo cellule20. Tuttavia, le strutture di vaso-come riferite non hanno le estremità aperte del lumina di fornire ossigeno e sostanze nutritive per il centro della sferoide. Per simulare il ruolo vascolare per nutrire le cellule nella cultura tridimensionale, a tempo indeterminato e perfusable rete vascolare deve essere sviluppato nella sferoide.
Durante gli ultimi anni, alcuni gruppi di ricerca nel campo Microtecnica riportati metodi per costruire una rete vascolare perfusable, formata spontaneamente in un dispositivo microfluidico utilizzando fattori angiogenici dalle cellule del fibroblasto cocultured25 ,26. Queste reti vascolari hanno una morfologia simile alle loro controparti in vivo e possono essere ristrutturate da fattori ambientali, che li rende adatti per mimare le funzioni vascolari in una cultura di sferoide. Lo scopo del presente protocollo è quello di costruire una rete vascolare perfusable in uno sferoide utilizzando una piattaforma di microfluidica27. Il dispositivo microfluidico è modificato dal dispositivo precedentemente segnalati25 in modo che può essere incorporato uno sferoide. Indirizzando la secrezione angiogenici dalle cellule del fibroblasto in uno sferoide alle cellule endoteliali a microcanali, angiogenico germogli da microcanali anastomizzato con la sferoide e formato una rete vascolare perfusable. Questo metodo permette una consegna diretta di una vasta gamma di sostanze, quali molecole fluorescenti e perline di micrometro-scala all'interno di uno sferoide, che fornisce il quadro per una coltura a lungo termine del tessuto con reti vascolari.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>Una maschera cromata rivestita con AZP 1350.</td><td>TECNOLOGIA DELLE SUPERFICI PULITE</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Micro generatore di pattern</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26</td><td>Sviluppatore Rohm e haas materiali</td> <td>elettronici-Sviluppatore</td> <td>nel protocollo 1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>Mordenzante al cromo nel protocollo 1.5</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Esametiltililazano (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem-Fotoresist</td><td></td> <td>negativo in protocollo 1.9</td></tr><tr><td>Esposizione UV</td><td>Tecnologia Nanometrica Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Sviluppatore</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Sviluppatore per il fotoresist negativo nel protocollo 1.13</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>Profilatore di superficie</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr> <tr><td>(tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch (1.0mm)&nbsp;</td><td>Punzone</td> per biopsia <td>Kai Industries BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>(2,0 mm)&nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>Sistema al plasma</td><td>Femto Science</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>Vetro</td><td>di copertura MATSUNAMI GLASS</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Piatti di coltura</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP Espressione della vena ombelicale umana Angio</td><td>proteomia</td> delle cellule endoteliali <td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti polmonari umani normali</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Kit di terreni di crescita dei fibroblasti</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0,05 w/v% Tripsina-0,53 mmol/l EDTA&bull; 4Na Soluzione con fenolo rosso</td><td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sali tamponati con fosfato)</td><td>Takara bio</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Sumitomo bachelite</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul&nbsp; Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP che esprime la vena ombelicale umana Angio proteomia a cellule endoteliali</td><td></td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno da plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina dal polmone bovino</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Collagene I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trombina dal plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Colorante fluorescente per colorare i nuclei nel protocollo 5.5</td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertito</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera CCD Degital</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio biologico a scansione laser confocale</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertita</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina-destrano</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Uno sferoide (un aggregato pluricellulare) è considerato come un buon modello di tessuti viventi nel corpo umano. Nonostante il progresso significativo nelle culture sferoide, una rete vascolare perfusable in sferoidi rimane una sfida critica per coltura a lungo termine necessario per mantenere e sviluppare le loro funzioni, come espressioni della proteina e la morfogenesi. Il protocollo presenta un nuovo metodo per integrare una rete vascolare perfusable all'interno della sferoide in un dispositivo microfluidico. Per indurre una rete vascolare perfusable nella sferoide, germogli angiogenici collegati a microcanali sono stati guidati per la sferoide utilizzando fattori angiogenici da fibroblasti polmonari umane coltivate nella sferoide. I germogli angiogenici raggiunto sferoide, che si fuse con le cellule endoteliali co-coltivate in sferoide e formano una rete vascolare continua. La rete vascolare potrebbe irrorare l'interno della sferoide senza alcuna perdita. La rete vascolare costruita può essere utilizzata ulteriormente come un itinerario per rifornimento delle sostanze nutrienti e la rimozione dei prodotti di scarto, che imita il sangue circolazione in vivo. Il metodo fornisce una nuova piattaforma nella cultura di sferoide verso migliore ricapitolazione dei tessuti viventi.

La figura 1 Mostra un design e foto del dispositivo microfluidico. Ha tre canali paralleli, in quale canale 2 contiene la sferoide bene. Canali 1 e 3 sono utilizzati per la coltura HUVEC e canale 2 è per la sferoide. Ogni canale è separato da microposts trapezoidale progettato per modello PDMS. La microposts evitare infiltrazioni nei canali 1 e 3 dalla tensione superficiale di idrogel nel canale 2 e consentire lo scambio di sostanze tra la sferoide e HUVECs a...

Il protocollo descrive come progettare una rete vascolare perfusable in uno sferoide. Microambiente circostante di sferoide è inventato per indurre l'angiogenesi e collegare la sferoide a microcanali in un dispositivo microfluidico. Il metodo consente la perfusione della sferoide, che è una tecnica tanto atteso nelle culture tridimensionale.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare una piattaforma microfluidica per costruire una rete vascolare perfusibile in un aggregato multicellulare, o sferoide. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella forma alternativa dei campi della medicina rigenerativa, come ad esempio l'importanza di una rete vascolare in vivo e nei modelli di tessuto in vitro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la via di somministrazione del farmaco e dell'integratore può essere simulata in vitro attraverso la somministrazione di regioni di interesse direttamente negli sferoidi.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della difficoltà di introdurre le cellule nell'area target nel dispositivo microfluidico. Dopo aver colato il prepolimero PDMS, degassare il materiale in una camera a vuoto per due ore, seguita da un indurimento notturno a 80 gradi Celsius in un forno ventilato. La mattina successiva, staccare il PDMS dal wafer di silicone e utilizzare un perforatore di due millimetri di diametro per creare fori nel materiale nelle posizioni indicate.Utilizzare un punzone di un millimetro di diametro per creare

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

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Bioengineering

Bioingegneria

Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (&lt;30 micron) è descritta.

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate fino alla confluenza all'interno di un dispositivo di rete microfluidica. Sono state illustrate le distribuzioni della giunzione delle cellule endoteliali e della F-actina e sono stati quantificati in tempo reale a livello di singola cellula le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio e della produzione di ossido nitrico in risposta all'adenosina trifosfato (ATP).

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Questo protocollo delinea l'implementazione della degradazione dell'idrogel basata su laser guidata da immagini per fabbricare reti microfluidiche biomimetiche di derivazione vascolare incorporate in idrogel di poli(etilenglicole) diacrilato (PEGDA). Questi sistemi microfluidici biomimetici possono essere utili per applicazioni di ingegneria tissutale, generazione di modelli di malattie in vitro e fabbricazione di dispositivi avanzati "on-a-chip".

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

Forniamo un protocollo generalizzato basato su una strategia di multimateriali microfluidici per un letto vascolare di microfibrous, dove un tipo di cellula secondaria potrebbe essere ulteriormente seminato nello spazio interstiziale di questa struttura di microfibrous per generare organoids e tessuti vascolarizzati di ingegneria.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Modello microfluidico per imitare l&apos;evento iniziale di neovascolarizzazione

L'obiettivo di questo protocollo è spiegare e dimostrare lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale (3D) di tessuto cardiaco umano altamente allineato, composto da cardiomiociti derivati da cellule staminali co-coltivati con fibroblasti cardiaci (FF) all'interno di un idrogel biomimetico a base di collagene, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

In questo protocollo, un test microfluido biomimetico, in grado di riprodurre un ambiente microvascolare fisiologicamente rilevante e riprodurre l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria, viene impiegato per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale nella malattia infiammatoria.

Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione

Questo protocollo presenta un modello tumore-on-a-chip fisiologicamente rilevante per eseguire ricerche di base e traslazionali sul cancro umano ad alto rendimento, facendo progredire lo screening dei farmaci, la modellazione delle malattie e gli approcci di medicina personalizzata con una descrizione delle procedure di carico, manutenzione e valutazione.

Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

Presentiamo un protocollo per la produzione ad alta produttività di canali vascolari con dimensioni flessibili e modelli desiderati su una piastra standard a sei pozzetti utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D, denominata vessels-on-a-plate (VOP). Questa piattaforma ha il potenziale per far progredire lo sviluppo di terapie per i disturbi associati all'endotelio compromesso.

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

Qui presentiamo un protocollo per la costruzione di un sistema organ-on-chip (OOC) progettato per imitare la pneumonectomia. Questo sistema studia la potenziale correlazione tra compromissione del glicocalice e complicanze dopo la pneumectomia.

Modellazione del glicocalice endoteliale post-pneumonectomia in un chip fluidico 3D - Un approccio alla fabbricazione di un sistema organo-on-chip basato su vasi

Impara a costruire una rete vascolare perfusibile in sferoidi utilizzando una piattaforma microfluidica. Questo metodo consente di simulare la somministrazione di farmaci in modelli di tessuto in vitro per la medicina rigenerativa.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

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