Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare una piattaforma microfluidica per costruire una rete vascolare perfusibile in un aggregato multicellulare, o sferoide. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella forma alternativa dei campi della medicina rigenerativa, come ad esempio l'importanza di una rete vascolare in vivo e nei modelli di tessuto in vitro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la via di somministrazione del farmaco e dell'integratore può essere simulata in vitro attraverso la somministrazione di regioni di interesse direttamente negli sferoidi.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della difficoltà di introdurre le cellule nell'area target nel dispositivo microfluidico. Dopo aver colato il prepolimero PDMS, degassare il materiale in una camera a vuoto per due ore, seguita da un indurimento notturno a 80 gradi Celsius in un forno ventilato. La mattina successiva, staccare il PDMS dal wafer di silicone e utilizzare un perforatore di due millimetri di diametro per creare fori nel materiale nelle posizioni indicate.

Utilizzare un punzone di un millimetro di diametro per creare il pozzetto sferoidale e utilizzare del nastro adesivo per pulire la lastra PDMS e un vetrino di vetro da 24 x 24 millimetri. Trattare la lastra pulita con plasma ad aria per 40 secondi e incollare la lastra PDMS sul vetrino coprioggetti. Quindi, polimerizzare il PDMS a 80 gradi Celsius per almeno 12 ore.

Due o tre giorni prima di seminare il dispositivo microfluidico, aggiungere tre volte 10 al quinto hLF, RFP-HUVEC e GFP-HUVEC appena scongelati a 10 millilitri di terreno endoteliale fresco in un piatto da 10 millimetri. Quando gli hLF e gli RFP-HUVEC raggiungono la sub-confluenza, sospendere gli hLF e gli RFP-HUVEC nel mezzo endoteliale alle concentrazioni finali rispettivamente a 1,0 volte 10 alla quinta e 2,5 volte 10 alla quarta cellula per millimetro. Dopo due giorni di coltura in sospensione, in una cappa di biosicurezza, aggiungere una goccia da 99 microlitri di soluzione master mix appena preparata al centro di una capsula di Petri da 35 millimetri su ghiaccio.

Per caricare il dispositivo microfluidico, utilizzare una punta per micropipetta modificata da 100 microlitri per trasferire uno sferoide e 100 microlitri di terreno in una seconda piastra di Petri a temperatura ambiente. Quindi, aspirare lo sferoide in una quantità minima di terreno e capovolgere la pipetta in posizione verticale in modo che lo sferoide si sposti verso il fondo della punta della pipetta per gravità. Toccare la punta della pipetta con il menisco della gocciolina della miscela master per espellere lo sferoide nella soluzione senza premere lo stantuffo della pipetta.

Quindi, aggiungi rapidamente un microlitro di trombina appena preparata alla gocciolina e mescola delicatamente la trombina nella soluzione. Con la pipetta impostata a sette microlitri, trasferire lentamente lo sferoide nel pozzetto sferoidale della lastra PDMS. La fase più critica della procedura consiste nell'iniettare nello sferoide una quantità di gel sufficiente a consentire allo sferoide di depositarsi nella parte inferiore del dispositivo.

Dopo il caricamento, rimuovere delicatamente il puntale della pipetta per evitare perdite tra i microperni. Incubare lo sferoide a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quando la fibrina si è solidificata, iniettare lentamente da 20 a 30 microlitri di terreno endoteliale nei fori uno A e tre A per caricare rispettivamente i canali uno e tre.

Quindi, trasferire il dispositivo su una salvietta da laboratorio bagnata in un piatto da 100 millimetri e incubare il dispositivo a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24 ore per facilitare la rimozione di eventuali bolle all'interfaccia tra il mezzo e la fibrina. Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% alle GFP-HUVEC sub-confluenti e interrompere la reazione della tripsina con quattro millilitri di terreno completo quando le cellule si sono completamente staccate. Raccogliere le cellule endoteliali mediante centrifugazione e risospendere il pellet in terreno endoteliale fresco a una concentrazione di cinque volte 10 a una sesta cellula per millilitro.

Quindi, iniettare 20 microlitri di HUVEC nel foro uno B per caricare il canale uno e posizionare il dispositivo a 37 gradi Celsius per 30 minuti, inclinato di un angolo di 90 gradi per garantire che gli HUVEC aderiscano alla fibrina nel canale due. Dopo aver caricato il canale tre allo stesso modo, posizionare il dispositivo in un nuovo piatto da 100 millimetri contenente una salvietta da laboratorio umida nell'incubatore per colture cellulari per sette-14 giorni, sostituendo metà del terreno nei canali uno e tre ogni giorno. Queste immagini rappresentative, scattate il giorno zero del caricamento di HUVEC, mostrano il gel di fibrina caricato solo nel canale due, senza alcuna perdita nei canali uno o tre e con gli HUVEC attaccati con successo alla parete laterale del gel di fibrina.

Si può anche osservare che lo sferoide si trova correttamente nella parte inferiore del dispositivo. I germogli angiogenici sono osservati a partire dal primo giorno, con il germoglio più lungo che raggiunge lo sferoide il terzo giorno in questo esperimento, e con la maggior parte dei germogli angiogenici che raggiungono lo sferoide entro il settimo giorno. In modo ottimale, dopo quattro giorni nel dispositivo, il flusso può essere osservato attraverso i lumi vascolari con l'angolo vascolare definito come la direzione della punta vascolare e il centro dello sferoide dalla radice vascolare.

Gli angoli vascolari diminuiscono in modo dipendente dal tempo, indicando la migrazione dei germogli angiogenici verso lo sferoide. RFP e GFP-HUVEC possono formare in modo coordinato un singolo lume vascolare, indicando chiaramente come l'angiogenico germogli dai canali uno e tre anastomosi a RFP-HUVEC nello sferoide per formare una rete vascolare continua. Inoltre, il FITC-destrano iniettato nel canale uno fluisce nella rete vascolare costruita e all'interno dello sferoide, raggiungendo infine il canale tre, il che implica che la rete vascolare integrata potrebbe fornire nutrienti e rimuovere i prodotti di scarto dallo sferoide.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'elettricità organica per esplorare l'efficacia di farmaci o integratori di interesse in modelli di tessuto in vitro.