Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come ad esempio come cambia la struttura del DNA durante il ciclo cellulare dei batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile visualizzare l'ultrastruttura di intere cellule batteriche vicine allo stato di vita in momenti appropriati senza ulteriori trattamenti. A dimostrare la procedura saranno Chihong Song, un postdoc del mio laboratorio, e Mako Hayashi, uno studente laureato del laboratorio del Dr.Kaneko.

Inizia con la crescita dei cianobatteri su piastre BG-11 sterilizzate di nove centimetri contenenti l'1,5% di agar e lo 0,3% di tiosolfato di sodio. Incubare le piastre a 23 gradi Celsius con un ciclo di luce 12-12 con 50 micro-E di luce per metro quadrato al secondo. Per mantenere le cellule, trasferirle settimanalmente su piastre di agar BG-11 fresche.

Entro una settimana, le colture appaiono come bande verdi. Trasferire i grumi verdi di cellule utilizzando un anello sterilizzato a fiamma e strisciarli sulla nuova piastra. Per osservare la compattazione del DNA, raccogliere le cellule coltivate per sei giorni al termine del periodo di luce.

Per rilasciare le cellule dalla piastra, aggiungere un millilitro di saccarosio 0,2 molari. Quindi, raccogliere la sospensione cellulare e ripetere l'aggiunta e la rimozione del saccarosio fino a quando la soluzione diventa verde. Il cambiamento di colore indica che la maggior parte delle celle è stata rilasciata.

Ora, trasferire 500 microlitri di soluzione di cellule sospese in una provetta Microfuge e aggiungere il colorante Hoechst per una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Quindi, lasciare incubare le cellule al buio per 10 minuti. Quindi, centrifugare le cellule, scartare il surnatante e risospenderle in 10 microlitri di saccarosio 0,2 molari.

Quindi, trasferire un microlitro di sospensione su un vetrino, applicare un vetrino coprioggetti e osservare le cellule al microscopio a fluorescenza dotato di filtro UV. Utilizzando un obiettivo a immersione in olio 100 volte, cerca prove di compattazione del DNA, che dovrebbero essere osservabili nella maggior parte delle cellule. Per prima cosa, preparare il dispositivo di congelamento a tuffo.

Quindi, allestire il contenitore dell'azoto liquido inserendo il contenitore dell'etano e l'attacco dell'asta di raffreddamento. Quindi, riempi il contenitore con azoto liquido e raffreddalo alla temperatura dell'azoto liquido. Successivamente, caricare il gas etano nel contenitore.

Assicurati di indossare occhiali di sicurezza, poiché l'etano liquido è esplosivo. Infine, rimuovere l'attacco dell'asta di raffreddamento e coprire il contenitore con un coperchio di plastica per evitare che si attacchi alla brina. Per procedere, scarica il bagliore sul lato del carbonio di una griglia EM rivestita di carbonio per 30 secondi a 50 milliampere utilizzando una barriera ionica al plasma.

Quindi, preparare il Vitrobot secondo il protocollo di test. Usa le pinzette per impostare la griglia EM pretrattata sulla camera. Prima di applicare il campione, trattare la griglia EM con un tracciante d'oro BSA da 15 nanometri da microlitri che funge da marcatore fiduciale.

Ora, aliquotare 2,5 microlitri di sospensione cellulare sulla griglia. Asciugare la soluzione in eccesso con carta da filtro e congelare immediatamente la griglia in etano liquido. Conservare la griglia congelata in azoto liquido fino a quando non può essere esaminata.

Quindi, avviare l'HVEM e impostarlo su un'alta tensione di un megavolt. Quindi, raffreddare il supporto della griglia del campione a meno 150 gradi Celsius utilizzando azoto liquido. Una volta raffreddata, montare la griglia congelata nel supporto crio-campione raffreddato e caricarla nell'HVEM.

Fare attenzione a non contaminare l'impianto con il ghiaccio. A questo punto, selezionare un'area di imaging con un basso ingrandimento di 1.000 volte. Quindi, regolare l'altezza dell'asse z eucentrico e inclinare il tavolino del campione a meno 60 gradi.

Quindi, rimuovere il gioco della rotazione di inclinazione. Ora, metti a fuoco vicino alla posizione del bersaglio con un ingrandimento di 10.000 volte. Impostare una messa a fuoco inferiore da 6 a 10 micron deviando dall'immagine messa a fuoco.

Per l'imaging, impostare la dose su due elettroni per angstrom quadrato al secondo o meno. Tieni d'occhio la dose di elettroni, che viene riflessa dalla densità di corrente, e scatta un'immagine con una fotocamera digitale o su una pellicola elettronica. Quindi, raccogli le immagini di inclinazione da 60 gradi negativi a 60 gradi positivi con incrementi da due a quattro gradi.

Se possibile, utilizzare le funzioni automatizzate del microscopio. Aprire il pacchetto software commerciale e caricare le immagini di inclinazione per la ricostruzione tomografica. Quindi, crea un file di stack di immagini dalle singole immagini utilizzando il comando tif2mrc o newstack.

Quindi, avvia il software GUI eTomo e inserisci i parametri dell'immagine per la dimensione dei pixel, il diametro del fiduciale, la rotazione dell'immagine e così via. Quindi, crea lo script di modifica. Ora, utilizzare il software suggerito per creare una serie di inclinazione, allineata utilizzando i marcatori fiduciali, con un errore residuo medio inferiore a 0,5.

Infine, ricostruisci un tomogramma 3D utilizzando l'algoritmo SIRT. A questo punto, estrarre una regione di interesse dal tomogramma e applicare un filtro di denoising, ad esempio un filtro di diffusione anisotropa, un filtro bilaterale o un filtro morfologico matematico. Eseguire il filtraggio utilizzando parametri che migliorano il contrasto dell'immagine.

Quindi, segmenta una funzionalità di interesse. Utilizzare la funzione di affettatura per aprire il tomogramma. Quindi, vai alla finestra Editor di segmentazione e seleziona un nuovo campo etichetta per creare un file di segmentazione.

Quindi, traccia manualmente il bordo della feature di interesse nella prima sezione e quindi in ciascuna delle altre sezioni. Ulteriori funzionalità di interesse possono essere aggiunte utilizzando le stesse operazioni. A questo punto, per generare un rendering di superficie utilizzando le opzioni del menu SurfaceGen per visualizzare il volume segmentato, selezionare il menu SurfaceView.

Per spostare, ruotare e ingrandire il volume 3D, utilizzare gli strumenti nella finestra del visualizzatore 3D. La segmentazione automatica può essere eseguita utilizzando lo strumento Bacchetta magica. Fare clic su un oggetto e regolare i dispositivi di scorrimento in Visualizzazione e Mascheratura in modo che le funzioni dell'oggetto siano completamente selezionate.

In una precisa coltura sincrona, il DNA marcato con Hoechst mostra una distribuzione uniforme normale in condizioni di buio e poi si compatta progressivamente all'interno della cellula durante il periodo di luce, assumendo una struttura ondulata simile a un bastoncino entro la fine del periodo di luce. Infine, l'asta si divide al centro e le sue due parti sono distribuite nelle cellule figlie. Dopo la divisione cellulare, il DNA compattato scompare immediatamente e il DNA ritorna a una distribuzione normale e uniforme.

Quando le cellule nella fase finale della compattazione del DNA sono state congelate e osservate utilizzando la microscopia elettronica ad alta tensione, molte hanno mostrato una compattazione del DNA distinta che era facilmente distinguibile dalle cellule normali. Alcuni hanno mostrato una costrizione al centro delle cellule, come previsto prima della divisione cellulare. Dai tomogrammi 3D, il DNA compatto è visibilmente separato nel citoplasma ed è circondato da un materiale a bassa densità.

Gli strati della membrana tilacoide sono distorti lungo l'asta ondulata del DNA compattato. È interessante notare che molti piccoli corpi fosfato aderiscono al DNA compattato e di solito appaiono in coppia. Questi corpi polifosfato possono essere i fornitori di fosfato per la sintesi del DNA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare l'ultrastruttura di intere cellule batteriche vicine allo stato vivente al momento appropriato mediante microscopia elettronica crio-ad alta tensione senza alcun trattamento aggiuntivo come la colorazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che lo stato di compattazione del DNA cambia ogni minuto alla fine del ciclo di luce. Assicurati di non perdere il momento migliore per congelare il campione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la CLEM per rispondere a ulteriori domande sulla localizzazione di specifiche proteine o nucleotidi nel DNA compattato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica dovrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la divisione cellulare, la segregazione del DNA e l'infezione virale nei batteri o nei piccoli eucarioti.