Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire le cellule endocardiche durante la formazione del canale atrioventricolare e della valvola cardiaca. Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo dello sviluppo cardiaco, come ad esempio capire come si comportano le cellule endocardiche in diversi tipi di mutanti. Il monitoraggio delle cellule durante l'AVC e la formazione delle valvole è impegnativo a causa del battito rapido del cuore.

Rende difficile seguire le cellule tramite la tradizionale microscopia time-lapse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aggira alcune di queste difficoltà. A dimostrare la procedura sarà Renee, un postdoc nel mio laboratorio.

Dopo aver creato uno stampo secondo il protocollo di testo, pipettare circa 1,5 millilitri di agarosio fuso all'1% in un piatto di montaggio in plastica da 35 millimetri. Quindi, posizionare lo stampo in plastica nell'agarosio liquido, facendo attenzione a non intrappolare l'aria tra lo stampo e l'agarosio. Posizionare il piatto a quattro gradi Celsius fino a quando l'agarosio non si indurisce.

Quindi, rimuovere lo stampo di plastica dall'agarosio. Quindi, aggiungere due millilitri di terreno di montaggio precedentemente preparato al piatto di montaggio e attendere da 15 a 30 minuti affinché la soluzione si diffonda nell'agarosio. Nel frattempo, sciogliere un'aliquota di un millilitro di agarosio allo 0,7% a basso punto di fusione, o LMP, posizionando il tubo in un blocco termico a 70 gradi Celsius per circa cinque minuti.

Pipettare l'agarosio LMP su e giù per raffreddarlo leggermente. Quindi, aggiungere 25 microlitri di tricaina da otto milligrammi per millilitro e 40 microlitri di soluzioni BDM da un molare al tubo. Miscelare pipettando su e giù.

Quindi, trasferire il tubo in un blocco termico a 38 gradi Celsius per mantenere l'agarosio LMP allo stato liquido. Trasferire gli embrioni in un piatto separato contenente due millilitri di terreno di montaggio. Quindi, quando i cuori hanno smesso di battere, trasferisci gli embrioni nel piatto di montaggio e usa una pinza per disporli nei pozzetti in modo che si trovino con un angolo di 25 gradi, le code rivolte verso la parte più profonda del pozzetto, con il tuorlo rivolto verso l'alto.

Quando gli embrioni sono approssimativamente a posto, rimuovere il terreno e incorporarli in circa 200 microlitri di agarosio LMP allo 0,7% contenente tricaina e BDM. Quindi, regolare nuovamente le posizioni dell'embrione, inclinandole a sinistra o a destra secondo necessità. Premere sulle pareti del quadrato denso per consentire all'agarosio in eccesso di traboccare nelle aree laterali del piatto di montaggio.

Attendere circa cinque minuti affinché l'agarosio LMP si solidifichi, quindi aggiungere il mezzo di montaggio al piatto. Gli embrioni sono ora pronti per essere fotoconvertiti. Per effettuare la fotoconversione, su un microscopio confocale verticale dotato di sorgenti laser a 405, 488 e 561 nanometri, utilizzare la luce bianca trasmessa e una lente obiettiva per localizzare il cuore dell'embrione.

Utilizzando il laser a 561 nanometri, verificare la fluorescenza rossa di Kaede. Quindi, utilizzare il laser a 488 nanometri per visualizzare l'endocardio. Successivamente, sul software di acquisizione del microscopio, accedere alla modalità FRAP.

Quindi, selezionare circa l'1% di potenza laser sia per i laser a 488 che a 561 nanometri. Mentre ti concentri sul piano di interesse, seleziona un'area di interesse o ROI. Quindi, utilizzando il laser a diodi a 405 nanometri al 25% di potenza laser, fotoconvertire le celle, scansionando il ROI tre volte.

Se il Kaede non dovesse essere fotoconvertito in modo insufficiente nel ROI, scansionare nuovamente il laser a 405 nanometri sull'area tre volte. Torna alla modalità TCS SP8 sul software e utilizza i laser a 561 e 488 nanometri in sequenza, in modalità bidirezionale, acquisisci uno Z-stack. Dopo la fotoconversione, utilizzare una pipetta di vetro per premere leggermente verso il basso appena sopra la testa dell'embrione per rompere l'agarosio LMP.

Quindi, aspirare delicatamente l'embrione. Per lavare via il terreno contenente BDM, espellere l'embrione dalla pipetta di vetro in una piastra di Petri da 85 millimetri contenente terreno embrionale con PTU. Trasferire l'embrione in un pozzetto in una piastra a sei pozzetti contenente terreno embrionale con PTU.

Durante questa fase, assicurati di prendere nota di quale embrione entra in quale pozzo, poiché questo è essenziale per correlare la posizione delle cellule fotoconvertite nelle fasi successive dello sviluppo. Ora che gli embrioni sono stati rimossi dal terreno contenente BDM, i loro cuori dovrebbero ricominciare a battere in circa cinque minuti. Riporta gli embrioni al buio a 28,5 gradi Celsius per consentire loro di continuare a svilupparsi normalmente.

Nella fase desiderata, fermare il cuore e reinserire gli embrioni, come dimostrato in precedenza in questo video, con l'importante differenza che gli embrioni devono essere trattati con BDM in piatti separati e contrassegnati per tenerne traccia. Per embrioni fino a 62 hpf, acquisire Z-stack dell'endocardio utilizzando 561 e 488 nanometri per segnali fluorescenti rossi e verdi, rispettivamente. Per gli embrioni di età superiore a 62 hpf, utilizzare un laser multifotone impostato a 940 nanometri per visualizzare il Kaede verde invece del laser a 488 nanometri.

Per gli embrioni di età inferiore a 48 hpf, è possibile proiettare l'AVC tridimensionale su un'immagine bidimensionale per l'analisi. Innanzitutto, soglie l'immagine. Quindi, cancella i punti che si trovano al di fuori del cuore.

Per eseguire la segmentazione manuale, orientare l'immagine a sinistra in modo che corrisponda all'immagine a destra. Segmenta il lato del cuore in cui passa il vettore arancione e aggiungi punti nella direzione del vettore blu. Quindi, interpola le sezioni trasversali e proietta l'intensità del colore sulla superficie.

Infine, regolare l'orientamento dell'AVC e proiettarlo su una superficie 2D. Un esempio di un cuore embrionale subito dopo la fotoconversione a 48 hpf è mostrato qui. La Kaede citoplasmatica in diverse cellule del lato superiore dell'AVC è stata convertita dal verde al rosso.

Nello stesso embrione a 80 hpf, è evidente che le cellule fotoconvertite sono proliferate e sono migrate verso il lato interno della valvola atrioventricolare superiore. Qui viene mostrato un esempio di un embrione da 36 hpf in cui le EdC nell'atrio e nel ventricolo sono state fotoconvertite. L'AVC viene quindi proiettato in due dimensioni per facilitare la visualizzazione e l'analisi e consente di quantificare la distanza tra le due regioni fotoconvertite.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ridurre al minimo il tempo di arresto del cuore per evitare di influire sul normale sviluppo. Con la pratica, la fotoconversione può essere completata in circa 30 minuti, a condizione che tutto sia preparato in anticipo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come tracciare le cellule endocardiche dopo la fotoconversione in embrioni vivi di zebrafish e analizzare i tuoi set di dati.