Name: Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri come misurare la stabilità proteica in vivo negli embrioni di Danio rerio utilizzando la tecnica FDAP. Questo metodo consente di determinare le emivite intracellulari ed extracellulari con imaging fluorescente.

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Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey Farrell, James Gagnon, e Jennifer Bergmann per i commenti sul manoscritto. KWR è stato sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program durante lo sviluppo del test FDAP. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH di AFS e da finanziamenti della Fondazione tedesca per la ricerca (Emmy Noether Program), il Max Planck Society, e il Programma Umana Frontier Science (Career Development Award) per PM.

1. Creazione di un fotoconvertibile Fusion Costruire e Iniettare dechorionated embrioni di zebrafish <ol><li> Generare un costrutto funzionale contenente la proteina di interesse fusa ad una proteina fotoconvertibile verde a rosso (vedi Discussione), quindi utilizzare la trascrizione in vitro per generare capped mRNA codificante la proteina di fusione come nel Müller et al., 2012 19. </li><li> Utilizzare pronasi per rimuovere le chorions da circa 30 embrioni di zebrafish allo stadio unicellulare. In alternativa, dechorionate manualmente embrioni usando pinze 28. Nota: Gli embrioni devono essere dechorionated per l&#39;imaging successiva. Se lo si desidera, gli embrioni possono essere iniettati attraverso il corion e dechorionated più tardi, appena prima di imaging. <ol><li> Fare un / soluzione madre ml 5 mg di pronasi da Streptomyces griseus nello standard medio embrione zebrafish 19. Rock the soluzione lentamente a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la proteasi a sciogliere. Aliquota 2 ml in microprovette e congelare a -20 ° C. </li><li> Trasferimento stadio unicellulare embrioni ad un vetro del diametro di 5 cm di plastica scatola di Petri agarosio rivestite contenente ~ 8 ml di mezzo embrione. Aggiungere 2 ml di soluzione di scongelata pronasi magazzino al piatto e incubare a RT per 5 a 10 min. </li><li> Evitare di esporre embrioni all&#39;aria o di plastica, come il contatto sia con causerà embrioni dechorionated rottura. Riempire un bicchiere di vetro da 200 ml con media embrione. Trasferire gli embrioni al becher inclinando la piastra di Petri mentre immergendo nel mezzo. </li><li> Dopo gli embrioni sono depositata sul fondo del bicchiere, versare la maggior parte del mezzo dell&#39;embrione, quindi versare mezzo embrione fresco nel bicchiere. Il vorticoso delicato del mezzo versare nel bicchiere fa embrioni perdono le loro chorions indeboliti. </li><li> Ripetere il punto 1.2.4. </li></ol></li><li> Trasferire gli embrioni dechorionated ad un&#39;iniezione piatto agarosio rivestite 29 con un bicchiere pipetta Pasteur con una punta fiammata. Fiammeggianteil puntale impedisce bordi frastagliati da embrioni feriti. </li><li> Co-iniettare il mRNA e 3 kDa Alexa488-destrano coniugato 29,30 (Figura 1B, vedere Consigli per suggerito mRNA e quantità Alexa488-destrano). Iniettare direttamente al centro della cella (non il tuorlo) per assicurare una distribuzione uniforme del mRNA e colorante fluorescente volta clivaggio inizio. Nota: Il segnale Alexa488 verrà utilizzato durante l&#39;analisi dei dati per generare maschere compartimentali per distinguere tra intracellulare e fluorescenza extracellulare. </li><li> Trasferimento embrioni iniettati ad un agarosio rivestite bene di un piatto a sei ben plastica pieno di media embrione 1-2%. Incubare al buio a 28 ° C fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase sfera tardi 31 (circa 5 ore dopo la fecondazione). Controllare embrioni ognuno di 2 ore allo stereomicroscopio e rimuovere eventuali detriti generati da embrioni che sono morti. </li></ol> 2. Montaggio embrioni di zebrafish per Photoconversion e imaging su un invertito confocale microscopio <ol><li> Utilizzare uno stereomicroscopio per identificare 1-5 embrioni sani, e utilizzare una pipetta Pasteur di vetro con una punta fiammata per rimuoverli dal piatto. </li><li> Espellere delicatamente gli embrioni in una provetta contenente ~ 1 ml di fuso 1% a basso punto di fusione agarosio in mezzo embrione di 1x Danieau (vedi Materiali List) (Figura 2A). Nota: agarosio deve avere una temperatura compresa tra 40 e 42 ° C; temperature più elevate potrebbero danneggiare gli embrioni. </li><li> Disegnare gli embrioni di nuovo nella pipetta insieme ad alcuni agarosio. Estrarre delicatamente l&#39;agarosio ed embrioni sul vetro di copertura di un piatto fondo di vetro (Figura 2B). Assicurarsi che lo spessore del vetro di copertura è compatibile con l&#39;obiettivo del microscopio confocale. <ol><li> Riutilizzare la pipetta di vetro se lo si desidera. Per pulire l&#39;agarosio residua dalla pipetta e prevenire l&#39;intasamento, rapidamente medio embrione pipetta su e giù.Inserire un tubo 15 ml riempito con ~ 5 ml di terreno dell&#39;embrione accanto alla stereomicroscopio a questo scopo. </li></ol></li><li> Utilizzare una sonda di metallo per posizionare gli embrioni in modo che il polo animale (blastoderma) rivolto verso il vetro di copertura. Lavorare velocemente dal momento che l&#39;agarosio si solidifica in 20-30 sec. Utilizzare lo stereomicroscopio di monitorare le posizioni degli embrioni e regolare, se necessario, fino a quando l&#39;agarosio si indurisce. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,4 fino è stato montato il numero desiderato di embrioni. Nota: In un tipico esperimento, quattro gocce di agarosio contenente quattro o cinque embrioni ciascuno si adatta facilmente sul vetro di copertura. Circa 16 gli embrioni possono essere esposte in un singolo esperimento ideale (Figura 2C). </li><li> Quando l&#39;agarosio si è solidificato, riempire il piatto di vetro-basso con media embrione di 1x Danieau. </li></ol> 3. Photoconverting e misurando la diminuzione del segnale Photoconverted Un obiettivo 25X o 40X acqua is appropriato per la dimensione e l&#39;indice di rifrazione di embrioni di zebrafish. È meglio usare olio per immersione con lo stesso indice di rifrazione acqua piuttosto che acqua reale, poiché l&#39;acqua evapora durante il corso dell&#39;esperimento cinque ore. Assicurarsi che l&#39;olio di immersione è stato progettato per essere utilizzato con un acqua (non olio) obiettivo. <ol><li> Mettere un grande goccia di olio per immersione sull&#39;obiettivo di garantire che il film d&#39;olio tra l&#39;obiettivo e il vetro di copertura non si romperà come stadio si sposta diverse posizioni dell&#39;embrione durante l&#39;imaging. Saldamente posizionare il piatto fondo di vetro sul palco in modo che il piatto non si sposterà quando il palco si muove. Se possibile, utilizzare una fase riscaldata a 28 ° C, la temperatura ottimale per lo sviluppo zebrafish. </li><li> Definire la posizione di ogni embrione nel pacchetto software del microscopio confocale. Regolare la z approfondito per ogni embrione, e tentare di indirizzare o meno sullo stesso piano in ogni embrione. Nota: A proposito di 30 micron dal polo animale è un andareod profondità poiché a questa profondità dello strato avvolgente dell&#39;embrione può essere evitato, area di esposizione è massimizzata, e diffusione della luce è minima. Una singola fetta ottico con uno spessore di ~ 3,3 micron fornisce dati sufficienti; non vi è alcuna necessità di acquisire una z-stack (vedi sezione 5). </li><li> Raccogliere due segnali durante l&#39;esperimento: il segnale &quot;verde&quot; dal Alexa488-destrano coniugato-che verrà utilizzata durante l&#39;analisi dei dati per isolare extracellulare e intracellulare fluorescenza e il segnale &quot;rosso&quot; dalla proteina di fusione dopo che è photoconverted. <ol><li> Excite Alexa488 utilizzando un laser 488 nm, e raccogliere la fluorescenza emessa tra ~ 500 e 540 nm. Nota: Dopo la fotoconversione, molti verde a rosso proteine ​​fotoconvertibile (ad esempio, Dendra2) può essere eccitato con un laser 543 nm ed emettono fluorescenza tra ~ 550 e 650 nm. Regolare, se necessario, sulla base di proteina fotoconvertibile utilizzato. </li></ol></li><li> Acquisire &quot;pre-fotoconversione&quot;Le immagini, e configurare il software del microscopio confocale a immagine ciascuna delle posizioni definite in precedenza (dal punto 3.2) con le condizioni di imaging appropriate ogni 10 o 20 minuti per un corso di tempo di cinque ore (vedi sezione 5 e Discussione). </li><li> Per photoconvert la proteina di fusione, passare a un obiettivo 10X ed esporre gruppi di embrioni a luce UV da una lampada a vapori di mercurio con un filtro ~ 300-400 nm di eccitazione in uscita 100% per 2 min. Spostare l&#39;attenzione lungo l&#39;asse z per promuovere fotoconversione uniforme (vedi sezione 5). Assicurarsi che l&#39;olio di immersione non cola sulla obiettivo 10x durante fotoconversione. Nota: Lo spostamento di fuoco durante fotoconversione può essere automatizzato per evitare variabilità tra sperimentatori. </li><li> Tornare alla dell&#39;obiettivo 25X o 40X immediatamente dopo fotoconversione. Assicurarsi che le posizioni precedentemente definite dal punto 3.2 sono ancora accurate. Se il piatto spostato durante photoconversion, ri-definire le posizioni degli embrioni. <ol><li> Avviare il programma creato nel passaggio 3.4 e permette l&#39;imaging proseguire per 5 ore. Nota il tempo trascorso tra fotoconversione e l&#39;inizio delle immagini per ogni embrione. </li></ol></li><li> Controllare di tanto in tanto l&#39;esperimento. Monitorare il livello di supporto di Danieau e aggiungere più se necessario. Riavviare il software se è in fase di stallo. </li><li> Per determinare i valori di fluorescenza di fondo che verranno utilizzati durante l&#39;analisi dei dati per stimare il asintoto di un modello esponenziale decrescente, includere alcuni embrioni che sono stati iniettati con Alexa488-destrano ma non mRNA nell&#39;esperimento. Per determinare il rumore strumento, che verrà utilizzata anche durante la successiva analisi dei dati, acquisire un&#39;immagine in assenza di un campione. </li></ol> 4. Analizzare i dati utilizzando PyFDAP <ol><li> Ispezionare visivamente il tempo record di dati naturalmente da ogni embrione. Eliminare set di dati da embrioni morti durante imagING, che ha spostato in modo significativo, che hanno livelli molto bassi di segnale photoconverted, o che contengono regioni di cellule che sembrano insoliti e hanno smesso di muoversi e dividendo (tipico di embrioni feriti o ammalati). Nota: Di tanto in tanto, bolle nell&#39;olio immersione o altri artefatti appariranno in una o due immagini in un set di dati altrimenti utilizzabili. Prendere nota di eventuali immagini che contengono artefatti; saranno scartati dopo, e le restanti punti di tempo di tale insieme di dati possono ancora essere analizzati. </li><li> Utilizzare la sede a Python pacchetto software PyFDAP per analizzare i dati FDAP. PyFDAP calcola emivite determinando l&#39;intensità media intracellulare ed extracellulare fluorescenza rossa in ogni immagine ed il montaggio dei dati con un esponenziale decrescente funzione 56 (Figura 3). <ol><li> Scarica PyFDAP (vedi Elenco dei materiali). </li><li> Utilizzare PyFDAP per separare intracellulare ed extracellulare segnale photoconverted (Figura 3A, B). Noivia e il segnale Alexa488, che è strettamente intracellulare, per creare una maschera intracellulare. Applicare questa maschera per l&#39;immagine del canale rosso corrispondente per evitare pixel intracellulari da essere considerato per il calcolo dell&#39;intensità media extracellulare. Per misurare l&#39;intensità media intracellulare, invertire la maschera. </li><li> In PyFDAP, visualizzare le immagini mascherate generate nel passaggio 4.2.2. Controllare visivamente queste immagini ed eliminare set di dati in cui le maschere non distinguono accuratamente intracellulare dallo spazio extracellulare (questo dovrebbe essere raro, di notare che le membrane cellulari sono inclusi nelle immagini in cui lo spazio extracellulare è stato mascherato, ma potrebbero essere rimossi alterando la soglia algoritmo o introducendo una maschera membrana (ad esempio, utilizzando membrane-PCP)). Eliminare anche eventuali immagini singole contenenti manufatti (ad esempio, bolle nell&#39;olio immersione) identificati nella fase 4.1. </li><li> Utilizzare PyFDAP per calcolare la media intensità di fluorescenza extracellulari e intracellulari per each immagine. PyFDAP calcola queste medie sommando le intensità dei pixel che cadono al di fuori della maschera e la divisione per il numero totale di pixel sommati. </li><li> Inserire i dati di fluorescenza (Figura 3C) con la seguente funzione esponenziale: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> dove t è il tempo post-fotoconversione, c (t) è l&#39;intensità ad un dato valore di t, c 0 è l&#39;intensità a t = 0, k è la costante di velocità di clearance, e y 0 è l&#39;asintoto che la funzione avvicina come fluorescenza diminuisce (Figura 1D). y 0 può essere limitato in base alle misure in fase 3.8 19. </li><li> Utilizzare PyFDAP per calcolare le proteine ​​extracellulari e intracellulari emivita (τ) dalle costanti di velocità di liquidazione (k) con la seguente relazione: <img fo:content-width = src &quot;1in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52.266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Gli esperimenti di controllo per valutare Photobleaching, involontario Fotoconversione, e Fotoconversione Uniformità <ol><li> Valutare photobleaching Nota: Photobleaching potrebbe causare una riduzione di artefatti di intensità di fluorescenza che riflette le proprietà sbiancanti della proteina fluorescente in aggiunta alla clearance della proteina di interesse. <ol><li> Per valutare possibili photobleaching, eseguire una serie di esperimenti FDAP con 10 min intervalli tra immagini e una seconda serie con 20 min intervalli tra immagini (Figura 4). Analizzare i dati provenienti da due serie di esperimenti utilizzando PyFDAP come descritto nella Sezione 4. </li><li> Confrontare l&#39;emivita dei 10 e 20 intervalli min esperimenti. Emivita più lunga da 20 min esperimenti indicano intervallo significativo photobleaching. Se l&#39;emivita di entrambi gli esperimenti sono identici, photobleaching non è un problema significativo. </li><li> In alternativa, valutare photobleaching acquisendo una serie di ~ 30 immagini immediatamente dopo fotoconversione. Una diminuzione significativa fluorescenza indica significativo photobleaching. </li><li> Se viene rilevato photobleaching, usare il potere del laser più basso, diminuire il tempo di imaging, o utilizzare un più fotostabili proteine ​​fotoconvertibile 32. </li></ol></li><li> Valutare fotoconversione involontaria. Nota: Dendra2 può essere photoconverted con illuminazione 488 nm 27. Quando eccitante Alexa488 con il laser 488 nm come descritto al punto 3.3.1, fotoconversione involontaria e quindi un aumento di artefatti nella emivita apparente della proteina di interesse è possibile. Tuttavia, abbiamo altri 33 abbiamo trovato che 488 nm illuminazione è un metodo inefficiente di fotoconversione in embrioni di zebrafish. <ol><li> Utilizzare l&#39;esperimento di controllo descritto al punto 5.1.1 per rilevare fotoconversione involontaria. Confrontare l&#39;emivita dei 10 e 20 intervalli min esperimenti. Brevi tempi di dimezzamento di 20 min esperimenti indicano intervallo significativo fotoconversione involontario. Se l&#39;emivita di entrambi gli esperimenti sono identici, fotoconversione involontario non è un problema significativo. </li><li> Se viene rilevato fotoconversione involontario, utilizzare una potenza laser 488 nm inferiori e tempi di imaging più brevi per evitare inavvertitamente photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Valutare uniformità fotoconversione. Nota: Se fotoconversione è polarizzato verso il polo animale dell&#39;embrione, la diminuzione della fluorescenza sarà influenzato dalla diffusione proteine ​​o movimento cellulare in piani più profondi (Figura 5A). <ol><li> Per determinare se fotoconversione è uniforme, esprimere una proteina secreta fotoconvertibile (per esperimenti con proteine ​​di fusione extracellulari) o una proteina citoplasmatica fotoconvertibile (per esperimenti con proteine ​​di fusione intracellulari). Photoconvert come al solito, tgallina acquisiscono una z-stack che comprende la maggior parte del blastoderma ogni 20 min per 80 min. </li><li> Se fotoconversione è polarizzato verso il polo animale, l&#39;intensità di fluorescenza in piani profondi aumenterà nel tempo a causa della diffusione o movimento cellulare (Figura 5B). Se viene rilevato non uniforme fotoconversione, concentrarsi più in profondità gli embrioni durante fotoconversione. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di rivelare.

Il successo di un esperimento FDAP si basa sulla generazione di una proteina di fusione fotoconvertibile funzionale. Tagging una proteina può compromettere la sua attività biologica e / o proprietà biofisiche, tra cui la sua localizzazione, solubilità, stabilità e 36-41. Siate pronti a testare l&#39;attività di diversi costrutti di fusione diversi al fine di trovare uno che è attiva. Abbiamo trovato che la modifica della posizione della proteina fotoconvertibile relativa alla proteina di interesse o utilizzan...

I livelli di proteine ​​nelle cellule ed organismi sono determinati dalla loro tassi di produzione e passaggio. Protein dimezzamento possono variare da minuti a giorni 1-4. In molti sistemi biologici, la stabilizzazione o liquidazione di proteine ​​chiave ha effetti importanti sulla attività cellulare. È necessaria modulazione di stabilità proteina intracellulare per la progressione del ciclo cellulare 5,6, segnalazione di sviluppo 7-9, apoptosi 10, e la funzione normale e la manutenzione dei neuroni 11,12. Stabilità della proteina extracellulare influenza la distribuzione e la disponibilità di proteine ​​secrete, come morphogens 13,14, all&#39;interno di un tessuto. Negli ultimi decenni, la stabilità della proteina è stata valutata principalmente in coltura cellulare utilizzando radioattivo pulse-etichettatura o esperimenti chase cicloesimide 15. In tali esperimenti pulse-chase, le cellule sono o transitoriamente esposti ad un &quot;impulso&quot; di amino radioattiviprecursori di acidi che sono incorporati in proteine ​​di nuova sintesi, o sono esposti a cicloesimide, che inibisce la sintesi proteica. Cellule coltivate vengono poi raccolti in diversi momenti, e sia immunoprecipitazione seguita da autoradiografia (in radioattive esperimenti pulse-chase) o occidentale assorbente (in esperimenti cicloesimide) viene utilizzato per quantificare il gioco di proteine ​​nel corso del tempo. Test di stabilità proteica convenzionali hanno diverse lacune. Innanzitutto, proteine ​​in questi saggi sono spesso non espressi in loro ambienti endogeni, ma piuttosto in coltura tissutale e talvolta in cellule di specie diverse. Per proteine ​​la cui stabilità è dipendente dal contesto, questo approccio è problematico. In secondo luogo, non è possibile seguire la clearance proteine ​​in singole cellule o organismi nel tempo, ed i dati da questi saggi riflette una media delle diverse popolazioni di cellule a tempi diversi. Poiché le cellule individuali possono avere iniziatocon diverse quantità di proteine, potrebbe aver preso l&#39;etichetta o cicloesimmide radioattivo in tempi diversi, o può avere diverse cinetiche di liquidazione, tali dati aggregati potrebbero essere fuorvianti. Infine, nel caso di esperimenti chase cicloeximide, aggiunta del inibitore della sintesi proteica può avere effetti fisiologici indesiderati che potrebbero alterare artificialmente stabilità proteica 16-18. Queste carenze possono essere evitati utilizzando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), una tecnica che utilizza le proteine ​​fotoconvertibile per misurare il gioco di proteine ​​in modo dinamico in organismi viventi 19-25 (vedi la discussione per le limitazioni della tecnica FDAP). Proteine ​​fotoconvertibile sono proteine ​​fluorescenti la cui eccitazione e di emissione di proprietà cambiare dopo l&#39;esposizione a specifiche lunghezze d&#39;onda della luce 26. Una variante comunemente usata è Dendra2, una proteina fotoconvertibile &quot;green-to-rossa&quot;, che ha inizialmente excitazioni ed emissione proprietà simili alle proteine ​​fluorescenti verdi, ma dopo l&#39;esposizione a &quot;fotoconversione&quot; UV light- -il eccitazione / proprietà di emissione diventano simili a quelle delle proteine ​​fluorescenti rosse 23,27. È importante sottolineare che, nuova proteina prodotta dopo fotoconversione non avrà le stesse proprietà di eccitazione / emissione come la proteina photoconverted, permettendo disaccoppiamento della produzione e la clearance su fotoconversione e l&#39;osservazione di solo un pool di proteine ​​photoconverted. Tagging proteine ​​di interesse con le proteine ​​fotoconvertibile fornisce quindi un modo conveniente per impulsi-label proteine ​​intatte, organismi viventi otticamente accessibili. In saggi FDAP (Figura 1A), una proteina di interesse è etichettato con una proteina fotoconvertibile ed espressa in un organismo vivente (Figura 1B). La proteina di fusione è photoconverted, e la diminuzione del segnale photoconverted nel tempo è monitorato da fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). I dati vengono poi dotato di un modello appropriato per determinare l&#39;emivita della proteina di fusione (Figura 1D). Il test FDAP qui descritto è stato progettato per determinare l&#39;emivita extracellulari di proteine ​​di segnalazione secrete in embrioni di zebrafish durante la prima embriogenesi 19. Tuttavia, questo approccio può essere adattato a qualsiasi organismo modello trasparente che tollera imaging dal vivo, e potrebbe essere usato per monitorare il passaggio di qualsiasi proteina intracellulare o extracellulare oggetto di tag. Variazioni della tecnica qui descritta sono stati effettuati in cellule in coltura 20,23 e 22 Drosophila e topo di 21 embrioni.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP (scaricabile dal seguente sito web: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)Installare</td><td></td><td></td> <td>e utilizzare utilizzando le istruzioni fornite sul sito web di PyFDAP; PyFDAP è compatibile con i sistemi operativi Linux, Mac e Windows.</td></tr><tr><td>mMessage Kit di trascrizione mMachine Sp6</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Per generare mRNA incappucciato per iniezione negli embrioni</td></tr><tr><td>Alexa488-destrano coniugato, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>Co-iniettare con mRNA per creare maschere intracellulari ed extracellulari</td></tr> piatto <tr><td>di plastica a 6 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Incubare gli embrioni in pozzetti rivestiti di agarosio fino al momento del montaggio</td></tr><tr><td>Terreno embrionale</td><td></td><td></td><td>250 mg/L di sale istantaneo dell'oceano, 1&nbsp; mg/L di blu di metilene in acqua di osmosi inversa regolata a pH 7 con NaHCO3</td></tr><tr><td>Proteasi da Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Preparare un brodo da 5 mg/ml e utilizzare a 1&nbsp; mg/ml in embrioni di deteroionato allo stadio monocellulare</td></tr><tr>Piastra <td></td><td></td> di<td>Petri in vetro di 5 cm di diametro</td><td>Per la decorionazione degli embrioni</td></tr><tr>Bicchiere <td></td><td></td> di<td>vetro da 200 ml</td><td>Per la decorionazione degli embrioni Apparecchio</td></tr><tr><td></td><td></td> per<td>microiniezione</td><td>Per l'iniezione di mRNA e colorante negli embrioni allo stadio di una cellula</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td></td><td></td><td>Per l'iniezione e il montaggio di</td></tr> <tr><td>embrioni1x Media</td><td></td><td></td> di Danieau <td>Diluire l'agarosio a basso punto di fusione ed eseguire l'imaging in questo terreno; ricetta: soluzione filtrata 0,2 mm di 58 mM di NaCl, 0,7 mM di KCl, 0,4 mM di MgSO4, 0,3 mM di CaCl2, 5&nbsp; mM HEPES pH 7.2</td></tr><tr><td>UltraPure agarosio a basso punto di fusione</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Per il montaggio di embrioni; utilizzare ad una concentrazione dell'1% nel terreno di Danieau: aggiungere 200 mg a 20 ml di terreno di Danieau, microonde fino a dissoluzione, quindi aliquotare 1&nbsp; ml in provette per microcentrifuga; Le aliquote possono essere memorizzate a 4 gradi C, rifuso al 70&nbsp; &deg; C e raffreddato a 40&#8211; 42 gradi C quando è pronta per l'uso</td></tr><tr><td>Pipetta in vetro Pasteur</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>Per il montaggio di embrioni; fiammare la punta per evitare che i bordi frastagliati danneggino gli embrioni</td></tr><tr><td>Sonda</td><td></td><td></td> in metallo <td>Per posizionare gli embrioni durante il montaggio</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Utilizzare lo spessore del vetro di copertura appropriato per l'obiettivo; il numero di parte qui elencato si riferisce al vetro di copertura n. 1.5</td></tr><tr><td>Provetta da 15 ml riempita con ~5 ml di terreno embrionale</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Per il risciacquo dell'agarosio residuo dalla pipetta Pasteur</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> confocale a scansione laser invertito <td>Una lampada ad arco di mercurio, 488&nbsp; sono necessari laser nm, laser a 543 nm e i set di filtri appropriati</td></tr><tr><td>Fase</td><td></td><td></td> riscaldata <td>Per mantenere gli embrioni alla temperatura ottimale di 28 &deg; C durante l'esperimento</td></tr><tr><td>Software confocale in grado di eseguire l'imaging</td><td></td><td></td> time-lapse <td>Deve essere in grado di definire più posizioni e di visualizzarle automaticamente a intervalli definiti&nbsp;</td></tr><tr>Obiettivo <td></td><td></td><td>ad acqua 25X o 40X</td><td>Obiettivo per imaging</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td></td><td></td> ad aria 10X <td>Obiettivo per fotoconversione</td></tr><tr><td>Olio</td><td></td><td></td> da immersione <td>Olio da immersione con lo stesso indice di rifrazione dell'acqua</td></tr></tbody></table>

misurare protein stabilità in living embrioni di zebrafish usando fluorescenza decay dopo fotoconversione (fdap)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Stabilità della proteina influenza molti aspetti della biologia, e misurando la cinetica di clearance di proteine ​​in grado di fornire importanti informazioni nei sistemi biologici. In esperimenti FDAP, la clearance di proteine ​​negli organismi viventi può essere misurata. Una proteina di interesse è etichettato con una proteina fluorescente fotoconvertibile, espresso in vivo e photoconverted, e la diminuzione del segnale di photoconverted nel tempo è monitorato. I dati vengono poi dotata di un modello di clearance appropriato per determinare la proteina emivita. È importante sottolineare che la cinetica di clearance delle popolazioni di proteine ​​in diversi comparti dell&#39;organismo possono essere esaminati separatamente applicando maschere compartimentali. Questo approccio è stato utilizzato per determinare l&#39;emivita intra- ed extracellulari di proteine ​​di segnalazione secrete durante lo sviluppo zebrafish. Qui, descriviamo un protocollo per la sperimentazione FDAP in embrioni di zebrafish. Dovrebbe essere possibile utilizzare FDAP per determinare la cinetica di liquidazioneogni proteina oggetto di tag in ogni organismo otticamente accessibile.

FDAP è stata utilizzata per determinare l&#39;emivita di proteine ​​di segnalazione extracellulari in embrioni di zebrafish 19. Una di queste proteine, Squint, induce l&#39;espressione di geni mesendodermal durante l&#39;embriogenesi 34. Strabismo-Dendra2 attiva l&#39;espressione di geni mesendodermal a livelli simili a untagged Squint, come dimostrato da qRT-PCR e ibridazione in situ test 19. Gli embrioni sono stati co-iniettate con Alexa488 destrano e mRNA codifica Squint-Dend...

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la stabilità delle proteine intracellulari ed extracellulari in embrioni di pesce zebra vivi. Ciò si ottiene etichettando una proteina di interesse con una proteina fluorescente fotoconvertibile e iniettando mRNA, codificando la fusione e un colorante fluorescente in embrioni di zebrafish. Successivamente, la proteina di fusione fotoconvertibile viene fotoconvertita, che etichetta la proteina a impulsi.In questo esempio, la proteina di fusione viene secreta, quindi il decadimento dell'intensità di fluorescenza fotoconvertita intra ed extracellulare viene monitorato nel tempo e dotato di una funzione esponenzialmente decrescente al fine di determinare l'emivita intracellulare ed extracellulare della proteina di fusione. I risultati mostrano la stabilità in vivo delle proteine di fusione fotoconvertibili in base al decadimento del segnale fluorescente nel tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e dello sviluppo.Ad esempio, come la stabilità influenza la distribuzione e la disponibilità delle proteine. Utilizziamo il nostro software EP per l'analisi dei dati FD DP. EP è d

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l'uso di questa tecnologia per l'etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

In questo studio, presentiamo un metodo per l'attivazione mediante luce di proteine fluorescenti fotoconvertibili (PCFPs) nell'embrione di pesce zebra vivente e il successivo tracciamento della proteina fotoconvertita in specifici punti temporali durante lo sviluppo. Questa metodologia consente il monitoraggio di eventi di biologia cellulare alla base di diversi processi di sviluppo in un organismo vertebrale vivente.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Somitogenesis è un processo di sviluppo ritmico che spazialmente modelli l'asse del corpo di embrioni dei vertebrati. In precedenza, abbiamo sviluppato linee di zebrafish transgenico che usano i giornalisti fluorescenti ad osservare i geni ciclici che guidano questo processo. Qui, la cultura dispersi cellule da queste linee e l'immagine dei loro oscillazioni nel corso del tempo in vitro.

Generazione di Dispersi Presomitic mesoderma colture cellulari, per Immagini del Zebrafish segmentazione Orologio in celle singole

Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test 1 che permette l'analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Questo protocollo descrive un metodo per determinare la proteina emivite in singole cellule aderenti, utilizzando impulsi etichettatura e time-lapse imaging di fluorescenza di proteine di fusione SNAP-tag.

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

Le manipolazioni embriologiche come l'estirpazione e il trapianto di cellule sono strumenti importanti per studiare lo sviluppo precoce. Questo protocollo descrive un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per eseguire queste manipolazioni in embrioni di zebrafish.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Le RASopatie sono sindromi genetiche multisistemiche causate dall'iperattivazione della via RAS-MAPK. Varianti potenzialmente patogene in attesa di convalida emergono continuamente, mentre le scarse evidenze precliniche limitano la terapia. Qui, descriviamo il nostro protocollo in vivo per testare e convalidare in modo incrociato i livelli di attivazione ERK associati alla RASopathy e la sua modulazione farmacologica durante l'embriogenesi mediante imaging FRET dal vivo in zebrafish...

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Scopri come misurare la stabilità proteica in vivo negli embrioni di Danio rerio utilizzando la tecnica FDAP. Questo metodo consente di determinare le emivite intracellulari ed extracellulari con imaging fluorescente.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

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