Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la stabilità delle proteine intracellulari ed extracellulari in embrioni di pesce zebra vivi. Ciò si ottiene etichettando una proteina di interesse con una proteina fluorescente fotoconvertibile e iniettando mRNA, codificando la fusione e un colorante fluorescente in embrioni di zebrafish. Successivamente, la proteina di fusione fotoconvertibile viene fotoconvertita, che etichetta la proteina a impulsi.

In questo esempio, la proteina di fusione viene secreta, quindi il decadimento dell'intensità di fluorescenza fotoconvertita intra ed extracellulare viene monitorato nel tempo e dotato di una funzione esponenzialmente decrescente al fine di determinare l'emivita intracellulare ed extracellulare della proteina di fusione. I risultati mostrano la stabilità in vivo delle proteine di fusione fotoconvertibili in base al decadimento del segnale fluorescente nel tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e dello sviluppo.

Ad esempio, come la stabilità influenza la distribuzione e la disponibilità delle proteine. Utilizziamo il nostro software EP per l'analisi dei dati FD DP. EP è disponibile gratuitamente sulla nostra pagina web Dopo aver generato l'mRNA con cappuccio nella codifica di una proteina di fusione fotoconvertibile da verde a rossa di interesse, trasferire circa 31 embrioni di zebrafish in uno stadio cellulare di vetro o in una capsula di Petri rivestita di rosa di vetro o agar contenente circa otto millilitri di terreno embrionale.

Aggiungere due millilitri di soluzione brodo pro nay precedentemente preparata e scongelata al piatto e incubare a temperatura ambiente per cinque-10 minuti. Riempi un altoparlante di vetro con il terreno per embrioni e, evitando di esporre gli embrioni all'aria o alla plastica, trasferisci gli embrioni nel becher inclinando la capsula di Petri mentre la immergi nel terreno. Dopo che gli embrioni si sono depositati sul fondo del becher, versare la maggior parte del terreno e utilizzare un terreno fresco per sostituirlo con cura.

Il leggero vortice del terreno fresco farà perdere agli embrioni il loro corion indebolito. Dopo aver ripetuto il lavaggio, utilizzare una pipetta in PE di vetro con punta fiammata per trasferire gli embrioni rivestiti in una piastra per iniezione rivestita di agarosio. Quindi co-iniettare l'mRNA e un filamento di Alexa 4 88 DExT coniugato da tre kilodalton direttamente al centro della cellula per garantire una distribuzione uniforme dell'mRNA e del colorante.

Una volta iniziata la scissione, trasferire gli embrioni iniettati in un pozzetto rivestito di agarosio dall'uno al 2% di un piatto di plastica a sei pozzetti riempito con embrione, terreno e incubare al buio a 28 gradi Celsius fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio avanzato della sfera con uno stereomicroscopio, identificare da uno a cinque embrioni sani e utilizzare una pipetta di vetro PE con una punta fiammata per rimuoverli dal piatto. Espellere delicatamente gli embrioni in una provetta da microcentrifuga contenente circa un millilitro di aros fuso all'1% a basso punto di fusione in un mezzo embrionale x danios. Quindi, aspira nuovamente gli embrioni nella pipetta insieme ad alcuni aros.

Quindi espellere delicatamente gli aros e gli embrioni sul coperchio. Bicchiere di un piatto con fondo in vetro. Per riutilizzare la pipetta di vetro, pulire gli aros residui per evitare l'intasamento pipettando rapidamente il terreno embrionale su e giù, lavorando rapidamente prima che gli aros si solidifichino.

Utilizzare una sonda metallica per posizionare gli embrioni in modo che l'asta dell'animale sia rivolta verso il vetro di copertura sotto lo stereomicroscopio. Monitorare le posizioni degli embrioni e regolarle se necessario fino a quando l'agarro non si indurisce. Quando l'agarro si è solidificato, utilizzare un mezzo per embrioni di danios per riempire il piatto con fondo in vetro.

Per prepararsi alla conversione delle foto, impostare l'incubatrice a 28 gradi Celsius e posizionare una grande goccia di olio da immersione sull'obiettivo per assicurarsi che la pellicola d'olio tra l'obiettivo e il vetro di copertura non si rompa mentre il tavolino si sposta in diverse posizioni dell'embrione. Durante l'imaging in modo sicuro, posizionare la piastra con fondo in vetro sul tavolino in modo che non si sposti quando il tavolino si muove. Successivamente, nel pacchetto software del microscopio confocale, definisci la posizione di ciascun embrione.

Regola la profondità Z per ogni embrione e cerca di mirare all'incirca allo stesso piano in ogni embrione utilizzando entrambi i laser 4, 88 e 5, 43 nanometri. Acquisisci immagini di pre-conversione foto. Quindi configurare il software del microscopio confocale per visualizzare ciascuna delle posizioni precedentemente definite con le condizioni di imaging appropriate.

Ogni 10 o 20 minuti o un corso di cinque ore per fotoconvertire la proteina di fusione, passare a un obiettivo 10 x ed esporre gruppi di embrioni alla luce UV della lampada al mercurio con un filtro da 300 a 400 nanometri al 100% di uscita per due minuti. Sposta la messa a fuoco lungo l'asse Z per promuovere una conversione uniforme delle foto dopo la conversione delle foto. Torna immediatamente all'obiettivo 25 x o 40 x e conferma che le posizioni precedentemente definite siano ancora accurate.

Se la parabola si è spostata durante la conversione della foto, ridefinire le posizioni degli embrioni. Avviare il corso del tempo di imaging e lasciarlo funzionare per cinque ore. Prendere nota del tempo trascorso tra la fotoconversione e l'inizio dell'imaging per ogni embrione.

Di tanto in tanto controlla l'esperimento e monitora il livello del mezzo di Danielle, aggiungendone altro se necessario. Inizia ispezionando visivamente i set di dati dell'andamento temporale di ciascun embrione. Scartare i set di dati dagli embrioni morti durante l'imaging che si sono spostati in modo significativo, che hanno livelli molto bassi di segnale fotoconvertito o che contengono regioni di cellule che sembrano insolite e che hanno smesso di muoversi e dividersi.

Utilizzando il pacchetto software basato su Python, PI F DAP crea una maschera utilizzando il segnale Alexa 4 88, che è strettamente intracellulare. Per separare il segnale fotoconvertito intracellulare ed extracellulare, applicare la maschera all'immagine del canale rosso corrispondente per evitare che vengano presi in considerazione i pixel intracellulari. Quando si calcola l'intensità extracellulare media per misurare l'intensità intracellulare media, invertire la maschera, visualizzare le immagini mascherate generate e ispezionarle visivamente e scartare i set di dati in cui le maschere non distinguono accuratamente lo spazio intracellulare da quello extracellulare.

Utilizzare PI F DAP per calcolare le intensità medie di fluorescenza extracellulare e intracellulare per ciascuna immagine. Quindi inserire i dati di fluorescenza come mostrato qui secondo le linee guida nel protocollo di testo e calcolare la proteina extracellulare e intracellulare. Metà vive tau dal tasso di eliminazione.

Constance K squint è una proteina secreta che induce l'espressione dei geni endodermici mis durante l'embriogenesi del pesce zebra. In questo esperimento, gli embrioni sono stati co-iniettati con destrano Alexa 4 88 e mRNA che codifica per lo strabismo DENDRA due e sottoposti al test F DAP. Come mostrato qui, l'intensità del segnale convertito con foto extracellulare diminuisce nel tempo.

Utilizzando PI F dap, sono stati generati profili di intensità extracellulare da 23 embrioni e i dati sono stati adattati con un modello di clearance del primo ordine. I risultati indicano un'emivita media tau di 116 minuti. Profili di intensità e proteine simili.

Le emivite sono state ottenute quando gli intervalli tra l'imaging erano di 10 o 20 minuti. Suggerendo che lo sbiancamento delle foto o la conversione involontaria delle foto non hanno contribuito in modo significativo ai cambiamenti di intensità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il decadimento della fluorescenza dopo la conversione delle foto.

Da misurare in vivo. Emivita delle proteine di fusione fotoconvertibili in embrioni viventi di zebrafish.