Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

L'obiettivo generale di questi metodi di colorazione è quantificare l'abbondanza lipidica intracellulare e valutare la distribuzione lipidica tra i diversi tessuti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel metabolismo dei lipidi, come ad esempio come sono regolati geneticamente e biochimicamente i lipidi e quali stati patologici regolano l'omeostasi lipidica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice ed economica da eseguire.

Per eseguire la colorazione dei lipidi del rosso del Nilo, i vermi a piastre su nematode growth medium o NGM hanno seminato con E.coli OP50 in ritardo e hanno fatto crescere i vermi a 20 gradi Celsius fino allo stadio L4 iniziale. Lavare le viti senza fine con un millimetro di soluzione PBST e trasferire la sospensione della vite senza fine in un tubo per microfughe da 1,5 millilitri. Centrifugare i vermi a 560 volte la gravità per un minuto.

Quindi rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio PBST fino a quando l'E.coli non viene eliminato dalla sospensione. Successivamente, al pellet di verme, aggiungere 100 microlitri di isopropanolo al 40% o al 60% per la colorazione ORO e incubare il campione a temperatura ambiente per tre minuti. L'aggiunta di isopropanolo è fondamentale per una corretta permeabilizzazione dei vermi prima della colorazione.

Centrifugare i vermi a 560 volte la gravità per un minuto e rimuovere il surnatante senza rompere il pellet del verme. È importante ridurre al minimo l'esposizione alla luce durante le fasi di centrifugazione. Ora, mentre si è al buio, aggiungere 600 microlitri di soluzione di lavoro NR precedentemente preparata a ciascun campione.

Capovolgere le provette tre volte e mescolare completamente le viti senza fine e la soluzione. Quindi incubare il campione al buio a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, centrifugare i vermi e rimuovere il surnatante.

Quindi aggiungere 600 microlitri di PBST e incubare i campioni al buio per 30 minuti per rimuovere la colorazione NR in eccesso. Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni come prima, rimuovere tutti i microlitri di surnatante tranne circa 50 e risospendere il pellet di verme nella soluzione rimanente. Per preparare i vetrini per l'imaging, pipettare cinque microlitri di sospensione di vermi su un vetrino da microscopio e applicare con cura un vetrino coprioggetti per evitare di intrappolare bolle d'aria.

Utilizzando il canale FITC GFP per l'imaging di vermi colorati con NR e provando diversi tempi di esposizione, è possibile acquisire immagini di vermi con un ingrandimento di cinque volte per catturare diversi animali per campo visivo. Quindi passa all'ingrandimento di 10 volte per una migliore quantificazione dei singoli vermi. Per quantificare le immagini, caricare le micrografie su ImageJ.

Nel menu a discesa dell'immagine, regolare la luminosità, il contrasto del gruppo di immagini e propagare le modifiche a tutte le immagini facendo clic su Applica. Utilizzare lo strumento di selezione dei poligoni per delineare ogni verme ripreso e, nel menu a discesa dell'analisi, utilizzare la funzione di misurazione per qualificare l'intensità della fluorescenza emessa da NR. Per ogni immagine, misurare cinque posizioni dello sfondo e calcolare l'intensità media della fluorescenza dello sfondo. Aggiungere 600 microlitri di soluzione di lavoro Oil Red O o ORO a ciascun campione e capovolgere la provetta tre volte per mescolare bene i vermi e l'ORO.

Ruotare i campioni a 30 RPM e RT per due ore. Centrifugare i campioni a 560 volte la gravità per un minuto e aspirare tutto il surnatante ad eccezione di 100 microlitri. Quindi utilizzare 600 microlitri di PBST per risospendere i campioni e ruotare le provette a 30 giri/min per 30 minuti per rimuovere l'eccesso di colorazione ORO.

Per distinguere meglio la posizione della linea germinale degli animali nelle cellule intestinali, colorare i nuclei aggiungendo un microlitro di DAPI per ogni millilitro di soluzione di lavoro ORO. Quindi, per preparare i vetrini per l'imaging, risospendere i vermi e il surnatante rimanente e mescolare bene la soluzione. Mettere cinque microlitri di sospensione di vermi su un vetrino da microscopio e applicare con cura un vetrino coprioggetti assicurandosi che non si formino bolle d'aria.

Per visualizzare i vermi colorati con ORO, utilizzare una fotocamera a colori con ingrandimento cinque volte per acquisire immagini di diversi vermi in un campo visivo. Quindi passa all'ingrandimento di 10 volte per un migliore esame dei singoli vermi. Infine, dopo aver caricato le immagini su ImageJ e aver creato un mazzo di immagini secondo il protocollo di testo, classificare le immagini in base all'accumulo di lipidi in tutto il corpo dell'animale o in tessuti specifici.

SKN-1 condivide l'omologia con Nrf2 nei mammiferi e ha dimostrato di mediare l'ossidazione degli acidi grassi. Questa figura mostra gli animali attivati SKN-1 esposti a condizioni che portano ad un aumento dei livelli lipidici. Come si vede in queste immagini, la fluorescenza NR catturata utilizzando il canale GFP FITC è prominente lungo l'intestino, ma è più debole nella testa, nella coda e nel lume intestinale.

Mentre è facile classificare i vermi in base alla presenza o all'assenza di deplezione somatica di grasso dipendente dall'età o ASDF, può essere difficile identificare gli animali con perdita di grasso intermedia. Rispetto agli animali non ASDF, che mostrano una colorazione rosso vivo in tutto il corpo con poche aree traslucide, i vermi ASDF mostrano una notevole deplezione di grasso nelle cellule intestinali. Gli animali in procinto di sviluppare l'ASDF mostrano spesso macchie traslucide dove si verifica la maggior parte della perdita di grasso.

Inoltre, i vermi ASDF possono ancora presentare una colorazione rosso vivo nelle regioni della testa e della coda perché il fenotipo non è definito dalla completa perdita di grasso somatico, ma da un'estesa deplezione di grasso rispetto agli animali non anziani. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore più il tempo di imaging se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavare e permeabilizzare i vermi non più di 30 minuti prima della colorazione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia CARS, per confrontare il tipo di specie lipidiche identificate da ciascuna tecnologia e per determinare quale metodo è più adatto per tipi specifici di domande. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare i lipidi e valutare la distribuzione dei lipidi nei vermi utilizzando la colorazione Nile Red e Oil Red O, seguita dall'analisi micrografica ImageJ.