Name: Uso pratico di interferenza del RNA: consegna orale del RNA Double-stranded in elementi portanti di liposomi per scarafaggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri l'interferenza del RNA orale con liposomi per silenziare geni nel tratto digestivo dello scarafaggio tedesco. Questo metodo innovativo offre nuove strategie per il controllo dei parassiti.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Taiwan (Ministero della scienza e della tecnologia, più 100-2923-B-002-002-MY3 e 106-2313-B-002-011-MY3 a H.J.L.), Repubblica Ceca (concedere Università Agenzia della Boemia meridionale, GAJU concedere 065/2017/P a Y.H.L) e Spagna ( Ministero spagnolo dell'economia e della competitività, concede CGL2012-36251 e CGL2015-64727-P a X.B. e il governo catalano, concedere 2014 SGR 619 a X.B.); ha inoltre ricevuto il sostegno finanziario del Fondo europeo economica e lo sviluppo regionale (fondi FEDER a X.B.).

1. sintesi e preparazione di dsRNA
<ol><li>Identificare i siti di destinazione di dsRNA nella regione 3' non tradotta dei geni bersaglio. La dsTub è utilizzato per il targeting il gene α-tubulina (tub) (numero di accessione GenBank: KX228233), e dsEGFP come un controllo negativo dsRNA è progettato dalla sequenza di intensificare la proteina fluorescenza verde (EGFP; Numero di accessione GenBank: LC311024).</li>
	<li>Eseguire l'amplificazione di PCR standard per sintetizzare i modelli di dsRNA con gli iniettori di gene-specific contenente la sequenza del promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). Le condizioni di amplificazione di PCR e informazioni sul primer utilizzati sono quelli segnalati da Lin et al. (2017) 12 (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Procedere con la preparazione di dsRNA utilizzando una trascrizione di T7 Kit (Vedi Tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore. Nota: Resa elevata quantità dsRNA, mescolare due reazioni in un tubo (in totale 40 µ l) e incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di dnasi (Vedi Tabella materiali) in campioni di dsRNA per 15 min a 37 ° C per modelli del DNA del digest.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione (Vedi Tabella materiali) e cloroformio 40 µ l, poi vortice.</li>
	<li>Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi raccogliere il surnatante (150 µ l) in un nuovo tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Precipitare dsRNA aggiungendo 150 µ l isopropanolo e incubare per 15 minuti in ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare per 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di etanolo 70% per lavare dsRNA pellet. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere l'etanolo e ripetere le fasi di lavaggio di etanolo.</li>
	<li>Rimuovere l'etanolo e asciutto dsRNA pellet da concentratori centrifughi vuoto per 3 min, quindi risospendere dsRNA con acqua RNAsi-libera.</li>
	<li>Determinare la quantità del dsRNA purificato utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore e regolare fino alla concentrazione desiderata (ad es., 0,25 µ g / µ l per la preparazione di dsRNA lipoplessi).</li>
	<li>Conservare i campioni di dsRNA a-20 ° C fino a 3 mesi.</li>
</ol>2. preparazione del dsRNA lipoplessi
<ol><li>Diluire 4 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) aggiungendo 4 µ l di soluzione glucosata al 5%. Diluire 4 µ l di dsRNA (1 µ g) aggiungendo 4 µ l di soluzione glucosata al 5%.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di reagente liposoma diluito immediatamente nella soluzione diluita dsRNA tutti in una volta. Vortice brevemente per mescolarli, quindi incubare per 15 minuti a 25 ° C. Nota: Non mescolare le soluzioni nell'ordine inverso.</li>
	<li>I dsRNA lipoplessi sono pronti all'uso. Usare entro 1 ora di preparazione e scartare dopo 1 ora. Nota: Secondo le istruzioni del produttore, il lipoplessi dovrebbero essere usato appena possibile.</li>
</ol>3. raccolta di enzimi extracellulari dall'emolinfa e succo del Midgut
<ol><li>
Insetto buffer saline (stock x 10)
	<ol>
<li>Mescolare 900 mL acqua distillata doppia con 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl2e 8,3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>Aggiustare il pH a 6,8 e riempire fino a 1.000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collezione di emolinfa
	<ol>
<li>Anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio fino a quando non si muovono per 3 min.</li>
		<li>Tenere lo scarafaggio con due dita (pollice e indice) e alzare il lato ventrale del scarafaggio.</li>
		<li>Utilizzare le forbici per dissezione per tagliare fuori la punta di una coxa di una gamba posteriore. Nota: Tagliare l'intersezione collegato tra la coxa e il trocantere. L'asportazione della parte del coxa era meno efficiente per raccogliere l'emolinfa.</li>
		<li>Spremere l'addome delicatamente con il dito medio e raccogliere l'emolinfa sanguinamento dall'incisione con una micropipetta 10 µ l.</li>
		<li>Piscina l'emolinfa da scarafaggi (5 persone) in un tubo del microcentrifuge. Nota: Mantenere le provette microcentrifuga sul ghiaccio per prevenire melanizzazione. Il volume medio di emolinfa ottenuto da uno scarafaggio maschio è 2-3 µ l.</li>
		<li>Rotazione verso il basso l'emolinfa brevemente con una centrifuga da banco per 10 s.</li>
		<li>Trasferire il volume desiderato di emolinfa (vale a dire, 10 µ l) e mescolare con 50 µ l di tampone salino insetto 1x.</li>
		<li>Centrifugare per 10 minuti a 1.000 x g a 4 ° C a girare giù emociti. Trasferire il surnatante in una provetta pulita microcentrifuga.</li>
		<li>Quantificare la concentrazione di proteine totali utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume misurando A28015.</li>
		<li>Regolare ogni campione per avere la stessa concentrazione di proteina (6 mg / µ l di proteina totale).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta di succo del midgut
	<ol>
<li>Anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio. Sistemare gli scarafaggi lato ventrale sulla piastra di dissezione con freddo 1x insetto Salina buffer mediante spilli entomologici.</li>
		<li>Sezionare l'addome con una pinzetta bene. Rimuovere l'intestino intero (compreso l'intestino anteriore, media e posteriore) per un piatto fresco con 1 x insetto tampone salino.</li>
		<li>Rimuovere l'intestino anteriore e posteriore e di trasferire velocemente midgut ad un tubo del microcentrifuge che contiene 100 µ l di tampone salino dell'insetto.</li>
		<li>Piscina l'intestino da sei scarafaggi nel tubo stesso e vortexare per 10 s.</li>
		<li>Centrifugare per 10 minuti a 1.000 x g a 4 ° C per rallentare gli emociti e tessuti di intestino. Trasferire il surnatante in una provetta pulita microcentrifuga.</li>
		<li>Quantificare la concentrazione di proteine totali utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis di micro-volume misurando A28015.</li>
		<li>Regolare ogni campione per avere la stessa concentrazione di proteina (6 mg / µ l di proteina totale).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA degradazione Assay
<ol><li>Appena preparare 4 µ l del dsRNA nudo o lipoplessi dsRNA (1 µ g).</li>
	<li>Mescolare il succo di dsRNA enzimi di soluzioni con 10 µ l di tampone salino dell'insetto (controllo), estratti dall'emolinfa, o del midgut.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di EGTA (20 mM) o acqua RNAsi-libera per separare campioni come controlli per inibizione delle attività enzimatiche.</li>
	<li>Incubare per 1 ora o più a lungo (6, 12 o 24 ore) a 25 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione e cloroformio 40 µ l, poi vortice.</li>
	<li>Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi raccogliere il surnatante (150 µ l) in un nuovo tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Precipitare dsRNA aggiungendo 150 µ l isopropanolo e incubare per 15 minuti in ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare per 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di etanolo 70% per lavare dsRNA pellet. Centrifugare per 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere l'etanolo e ripetere le fasi di lavaggio di etanolo.</li>
	<li>Rimuovere l'etanolo e asciutto dsRNA pellet da concentratori centrifughi vuoto per 3 min. Risospendere dsRNA con acqua RNAsi-libera di 10 µ l.</li>
	<li>Verificare l'integrità del dsRNA Trattato tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%.</li>
</ol>5. la somministrazione orale di dsRNA
<ol><li>Mantenere gli scarafaggi su una dieta ad libitum di cibo secco (chow cane). Privare l'approvvigionamento idrico dagli scarafaggi un giorno prima gli esperimenti di ingestione di dsRNA.</li>
	<li>Tenere uno scarafaggio afferrando le ali con le pinze flessibili (Figura 1, punto 5). Nota: Non afferrare le parti del corpo di scarafaggi.</li>
	<li>Preparare il dsRNA lipoplessi, come pure di dsRNA nuda, per l'alimentazione, come descritto nella sezione 2. Nota: Il dsRNA lipoplessi devono essere preparata fresca prima della poppata.</li>
	<li>Alimentazione 4 µ l di dsRNA lipoplessi o nudo dsRNA (250 ng) con una micropipetta.</li>
	<li>Lentamente dispensare la goccia della soluzione dsRNA vicino all'apparato boccale di scarafaggi e lasciare che gli scarafaggi ingerire la goccia completamente.</li>
	<li>Eseguire gli esperimenti di ingestione due volte al giorno (1 h dopo luci su e 1 h prima luci spente) per 8 giorni o 16 giorni di continuo. Nota: Tutte le blatte acquisito acqua solo tramite alimentazione manuale con reagenti soluzione o controllo di dsRNA (ad es., acqua gratuita nucleasi, soluzione di glucosio e reagente liposoma) durante gli esperimenti di ingestione.</li>
	<li>Fornire bottiglie d'acqua per gli scarafaggi dopo 16 giorni di ingestione di dsRNA esperimenti.</li>
</ol>6. valutare atterramento
<ol><li>Al momento scelto punti (2, 9 e 17 giorni dopo il test di ingestione di dsRNA), raccogliere gli insetti dsEGFP - e dsTub-trattati e sezionare i tessuti selezionati (per esempio, del midgut).</li>
	<li>Eseguire PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Le condizioni di amplificazione qRT-PCR e informazioni sul primer come riportato da Lin et al. (2017) 12.</li>
	<li>Valutare il controllo e il dsRNA-Trattato insetti ogni giorno per controllare la mortalità e rimuovere gli scarafaggi che sono più in movimento.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo presenta un metodo per RNAi efficace attraverso la consegna orale di dsRNA lipoplessi, che comprende la protezione contro la digestione di ribonucleasi nel succo del midgut il tedesco scarafaggio. Come dimostrato in altri studi in varie specie di insetti, l'effetto di RNAi povero attraverso la consegna orale di dsRNA è rappresentato principalmente dalla degradazione di dsRNA8,9,10. Questo protocollo produce lip...

RNAi è stato dimostrato come un metodo efficace per l'espressione genica atterramento attraverso un meccanismo di silenziamento post-trascrizionale via innescato da molecole di dsRNA in molti eucarioti1. Nell'ultimo decennio di studi, RNAi è diventata uno strumento utile per studiare le funzioni dei geni dallo sviluppo di comportamento che riducono l'espressione di specifici geni tramite iniezione e/o alimentazione di dsRNA in vari taxa di insetti2,3. A causa della specificità e robustezza dell'effetto di svuotamento, l'applicazione di RNAi è attualmente considerato come una strategia potenziale per pest control gestione4,5. Tuttavia, l'efficienza di RNAi varia ampiamente tra specie di insetti, a seconda di diversi geni presi di mira e i metodi di consegna. Un corpo crescente di prova suggerisce che l'instabilità del dsRNA, che è stato degradato dalla ribonucleasi, è un fattore critico per la limitata efficacia della RNAi5,6. Per esempio, la bassa sensibilità di RNAi in Manduca sexta è stata spiegata dal fatto che il dsRNA mescolato con l'emolinfa è stato rapidamente degradato entro 1 ora7. Allo stesso modo, la presenza di nucleasi alcaline in midgut, che degradano in modo efficiente dsRNA ingerito, è fortemente correlata con bassa efficienza di RNAi in diversi ordini di insetti8,9,10.
La somministrazione orale di dsRNA è particolarmente interessante per l'applicazione del RNAi in una strategia di controllo dei parassiti, ma un metodo per ritardare la degradazione di dsRNA di nucleasi a midgut non è ancora stato sviluppato, che avrebbe il potenziale per garantire un efficace RNAi attraverso l'alimentazione. Tuttavia, il problema del blocco di RNAi per consegna orale di dsRNA è stato segnalato dalla grande quantità di dsRNA, ad es. 50 µ g in Bombyx mori, o alimentazione alimentazione continuamente per 8 giorni (8 µ g dsRNA in totale) nelle specie di locusta. Il tedesco scarafaggio, germinica di Blattella, è altamente sensibile alla RNAi tramite l'iniezione del dsRNA11,12,13,14, ma non è rispondente a dsRNA attraverso l'alimentazione. Recentemente, Lin et al. (2017) hanno dimostrato che il dsRNA incapsulato con risultati di vettori liposomi in successo RNAi per atterramento l'espressione genica α-tubulina nella mortalità significativa del midgut e trigger del tedesco scarafaggio15. Come la degradazione di dsRNA in midgut è il fattore limitante per RNAi orale, i vettori di liposomi servono come veicolo di proteggere dsRNA dalla degradazione, che è facilmente applicabile in altri insetti con le attività della nucleasi forte nell'intestino. Della nota, la ragione per la scelta del reagente di transfezione particolare (Vedi Tabella materiali) abbiamo usato come vettore di liposomi nel protocollo attuale è che è stato testato per la transfezione di cellule di insetto linea con meno tossicità, secondo la istruzioni del produttore. Secondo il confronto dei sistemi di transfezione diversi liposoma Gharavi et al. (2013) 16, l'efficienza di trasfezione Short interfering RNA (siRNA) è circa la stessa tra questo e altri sistemi disponibili in commercio che sono stati utilizzati per sistemi di dsRNA in altri insetti17,18 . Inoltre, il nostro metodo di alimentazione sia abbastanza attento a garantire la corretta quantità di dsRNA è ingerita da ogni scarafaggio, e che i risultati siano robusti e confermato. In sintesi, il presente protocollo e i risultati dimostrano che utilizzando dsRNA lipoplessi migliora la stabilità di dsRNA e apre la porta alla progettazione della consegna orale strategia di RNAi, che è un approccio promettente per controllo dei parassiti in futuro.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Reagente di trasfezione</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>per la preparazione di lipoplessi</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>per PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI</td><td>4385612</td><td>per qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>per identificazione UTR 3'&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>per la sintesi di dsRNA</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>rimuove il modello di DNA dal dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018 per l'estrazione</td><td>di dsRNA o RNA</td></tr><tr><td>totale RQ1 Dnase Promega M6101 senza RNasi</td><td></td><td></td><td>rimuove il modello di DNA dall'RNA totale&nbsp;</td></tr><tr><td>cloroformio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>per l'estrazione di dsRNA o RNA totale</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>per l'estrazione di dsRNA o RNA totale</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>per l'estrazione di dsRNA o RNA totale</td></tr><tr><td>Dietil pirocarbonato, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>per la preparazione di acqua senza RNasi</td></tr><tr><td>soluzione di glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>per la preparazione di lipoplex</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>formula del tampone salino per insetti</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>formula del tampone salino per insetti</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>formula</td></tr> <tr><td>del tampone salino per insettiCloruro di magnesio esaidrato, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>soluzione salina per insetti formula</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Inibitore dell'enzima</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td></tr><tr><td>forbice da dissezione</td><td>F.S.T.</td><td></td> pinzetta <td>per dissezione di scarafaggi</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T.</td><td></td> pinzetta flessibile <td>per dissezione di scarafaggi</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T.</td><td></td><td>possesso di scarafaggi&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td></td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga</td> per preparazione dei campioni <td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td> punta per pipetta <td>per preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>preparazione campioni</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>preparazione campioni</td></tr><tr><td>Minispin centrifuga</td><td>The Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>per spin down di liquidi&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>pHmetro per preparazione campioni</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td> per spettrofotometro a micro-volume <td>per la regolazione del pH</td></tr><tr><td></td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>PCR quantitativa dell'acido nucleico</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>per PCR stampo o&nbsp; incubazione della sintesi di dsRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR quantitativa in tempo reale</td><td>ABI&nbsp;</td><td>StepOne plus</td> concentratori <td>centrifughi sottovuoto quantitativi di espressione</td></tr><tr><td>genica</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>per estrazione di dsRNA o RNA totale</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>per il caricamento di campioni PCR in tempo reale&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarosio I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>per elettroforesi dell'acido nucleico</td></tr><tr><td>tub gene specfifc forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub gene specfifc reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub template forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub modello primer inverso</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP modello preimer forward</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP template reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td></tr><tr><td>tub qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>tub qPCR reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR primer diretto</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

uso pratico di interferenza del rna: consegna orale del rna double-stranded in elementi portanti di liposomi per scarafaggi

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Interferenza del RNA (RNAi) è stato ampiamente applicato per scoprire le funzioni biologiche di numerosi geni ed è stata prevista come un parassita controllo strumento operativo tramite rottura di espressione genica essenziale. Sebbene diversi metodi, come l'iniezione, alimentazione e ammollo, sono stati segnalati per il recapito corretto del RNA double-stranded (dsRNA), l'efficienza di RNAi attraverso la consegna orale di dsRNA è altamente variabile tra i diversi gruppi degli insetti. Il tedesco scarafaggio, Blattella germanica, è altamente sensibile all'iniezione del dsRNA, come dimostrato da numerosi studi pubblicati in precedenza. Il presente studio descrive un metodo per dimostrare che il dsRNA incapsulato con vettori liposoma è sufficiente per ritardare la degradazione di dsRNA dal succo del midgut. In particolare, l'alimentazione in continuo di dsRNA incapsulato da liposomi significativamente riduce l'espressione di tubulina in midgut e ha portato alla morte di scarafaggi. In conclusione, la formulazione e l'utilizzo di dsRNA lipoplessi, che proteggono il dsRNA contro nucleasi, potrebbe essere in futuro un uso pratico di RNAi per controllo dei parassiti dell'insetto.

Uno schema semplificato del protocollo per la somministrazione orale di dsRNA è presentato nella Figura 1, dove sono mostrati i passaggi chiave per la preparazione di dsRNA lipoplessi.
Al fine di indagare la protezione fornita dai vettori liposomi al degrado di dsRNA nel succo del midgut di b. germanica, un'analisi ex vivo in cui si svolse la dsTub lipoplessi sono state incubate co...

Questo manoscritto viene illustrato lo svuotamento dell'espressione genica in midgut il tedesco scarafaggio attraverso ingestione orale di RNA double-stranded incapsulato in liposomi.

Uso pratico di interferenza del RNA: consegna orale del RNA Double-stranded in elementi portanti di liposomi per scarafaggi

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di esaurire l'espressione genica nell'intestino degli scarafaggi utilizzando l'interferenza dell'RNA attraverso l'ingestione orale di RNA a doppio filamento incapsulato in trasportatori di liposomi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo di nuovi metodi di controllo dei parassiti, come ad esempio l'abbattimento di geni essenziali in campo aperto può uccidere i parassiti? Il vantaggio principale di questa tecnica è che il liposoma protegge l'RNA a doppio filamento specifico del gene per garantirne la consegna alla cellula bersaglio.A dimostrare la procedura saranno Jia-Hsin Huang, un postdoc, e Yun Liu, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, anestetizza gli scarafaggi sul ghiaccio fino a quando non si muovono per tre minuti. Quindi, raccogli un insetto usando il pollice e l'indice per accedere al suo lato ventrale.Quindi, usa le forbici da dissezione per tagliare la punta di una coxa di una zampa posteriore tra la coxa e il trocantere. Il taglio in altre parti della coxa è meno efficiente per le raccolte di emolinfa. Ora, posiziona una micropipetta da 10 microlitri sull'incisione e stringi delicatamente l'addome mentre estrai l'emolinfa sanguinante.Ripetere questo processo fino a quando l'emolinfa di cinque scarafaggi è stata raccolta in un'unica provetta da microcentrifuga. Quindi, far girare brevemente l'emolinfa accumulata per 10 secondi. Quindi, combina 10 microlitri di emolinfa con 50 microlitri di tampone salino per insetti 1x.Ora, centrifugare l'emolinfa diluita per 10 minuti per estrarre gli emociti dalla soluzione. Quindi, trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Infine, quantificare la concentrazione totale di proteine utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume e regolare la concentrazione di ciascun campione a sei milligrammi di proteine per microlitro.Per raccogliere il succo dell'intestino medio, per prima cosa, anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio. Quindi, trasferiscine uno su una piastra di dissezione caricata con 1x tampone salino per insetti freddo e usa i perni per insetti per fissarlo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Ora, seziona l'addome usando una pinzetta sottile.Quindi, rimuovi l'intero intestino e trasferiscilo in un piatto fresco con 1x tampone salino per insetti. Quindi, isolare l'intestino medio, che è la regione tra la coltura e i tubuli Malpighiani. Per fare ciò, rimuovere la parte anteriore dell'animale e rimuovere l'intestino posteriore.Quindi, trasferisci rapidamente l'intestino medio in una provetta da microcentrifuga con 100 microlitri di tampone salino per insetti. Raccogli le budella medie di sei scarafaggi nello stesso tubo. Quindi, agitare il tubo per 10 secondi.Quindi, centrifugare la miscela per 10 minuti per separare gli emociti e i tessuti intestinali. Quindi, trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulita e regolare la concentrazione a sei milligrammi di proteine per microlitro. I lipoplessi di RNA a doppio filamento devono essere utilizzati entro un'ora dalla preparazione.Durante la loro preparazione, assicurarsi di combinare contemporaneamente tutto il reagente diluito con l'RNA a doppio filamento diluito. Quindi, agitare rapidamente e incubare la miscela. Una volta pronta, mescolare quattro microlitri della soluzione di RNA a doppio filamento con 10 microlitri di tampone salino per insetti come controllo, oppure mescolarla con 10 microlitri di enzimi estratti dall'emolinfa o dal succo dell'intestino medio.Successivamente, effettuare un controllo inibito dall'enzima aggiungendo due microlitri di EGTA. In caso contrario, aggiungere due microlitri di acqua priva di RNasi. Quindi, incubare i campioni per un'ora o più a 25 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, aggiungere 200 microlitri di reagente di estrazione e 40 microlitri di cloroformio, quindi vortice. Quindi, centrifugare i campioni per 10 minuti. Quindi, trasferire 150 microlitri di ciascun surnatante in una nuova provetta e precipitare l'RNA a doppio filamento da ciascun campione aggiungendo 150 microlitri di isopropanolo e incubando i campioni su ghiaccio per 15 minuti.Dopo l'incubazione, centrifugare nuovamente i campioni ed eliminare il surnatante. Quindi, lavare due volte i pellet di RNA aggiungendo 200 microlitri di etanolo al 70% a ciascun pellet e centrifugando la provetta. Dopo il secondo lavaggio, asciugare i pellet di RNA a doppio filamento utilizzando un concentratore centrifugo sottovuoto per tre minuti.Quindi, risospendere i pellet in 10 microlitri di acqua priva di RNasi. Infine, verificare l'integrità dell'RNA a doppio filamento trattato utilizzando un gel di agarosio all'1,5%. Dai da mangiare agli scarafaggi due volte al giorno, un'ora dopo l'accensione delle luci e un'ora prima che le luci si spengano.Fallo per otto o 16 giorni senza interruzioni. Durante questo periodo, gli scarafaggi dovrebbero essere altrimenti affamati d'acqua. Per l'alimentazione, avere a disposizione lipoplessi di RNA a doppio filamento appena preparati e RNA nudo a doppio filamento.Per il bolo, utilizzare con quattro microlitri di lipoplessi di RNA a doppio filamento o 250 nanogrammi di RNA nudo a doppio filamento. Per nutrire uno scarafaggio, per prima cosa, afferralo per le ali usando una pinza flessibile. Non afferrare le parti del corpo di uno scarafaggio.Quindi, pipettare lentamente la gocciolina di soluzione vicino all'apparato boccale e osservare come lo scarafaggio ingerisce la gocciolina. Dopo l'ultima poppata, fornire bottiglie d'acqua agli scarafaggi. Durante il periodo di alimentazione, valuta gli insetti ogni giorno per verificare la mortalità e rimuovere eventuali scarafaggi che non si muovono più dall'esperimento.La somministrazione orale continua di lipoplessi a vasca a doppio filamento è stata in grado di ridurre l'espressione della tubulina nell'intestino medio dal 40% al nono giorno al 60% al giorno 17. In confronto, l'RNA nudo a doppio filamento non ha avuto alcun effetto. Ciò è molto probabilmente dovuto alla scoperta che l'esposizione dell'RNA nudo a doppio filamento al succo dell'intestino medio ha provocato la degradazione entro un'ora, mentre l'RNA a doppio filamento coniugato con liposomi è rimasto stabile.Non solo i livelli di RNA sono diminuiti, ma anche l'alimentazione continua dei lipoplessi di RNA a doppio filamento di tubulina ha portato a una significativa letalità. È improbabile che ciò sia dovuto al vettore, poiché i lipoplessi che trasportano l'RNA a doppio filamento all'EGFP non hanno portato a letalità. Durante il tentativo di questo sistema di somministrazione orale dell'interferenza dell'RNA, è importante eseguire un'alimentazione continua di RNA a doppio filamento per diversi giorni.Una volta padroneggiata, la fase di alimentazione può essere eseguita in due minuti per insetto se eseguita correttamente. Se necessario, è possibile applicare diverse formulazioni di nanoparticelle di liposomi per migliorare la procedura di alimentazione e l'efficienza dell'RNAi. In definitiva, questa tecnica ha reso possibile per i ricercatori nel campo della gestione dei parassiti esplorare nuove strategie di controllo utilizzando l'RNAi.

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