Uso pratico di interferenza del RNA: consegna orale del RNA Double-stranded in elementi portanti di liposomi per scarafaggi

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di esaurire l'espressione genica nell'intestino degli scarafaggi utilizzando l'interferenza dell'RNA attraverso l'ingestione orale di RNA a doppio filamento incapsulato in trasportatori di liposomi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo di nuovi metodi di controllo dei parassiti, come ad esempio l'abbattimento di geni essenziali in campo aperto può uccidere i parassiti? Il vantaggio principale di questa tecnica è che il liposoma protegge l'RNA a doppio filamento specifico del gene per garantirne la consegna alla cellula bersaglio.

A dimostrare la procedura saranno Jia-Hsin Huang, un postdoc, e Yun Liu, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, anestetizza gli scarafaggi sul ghiaccio fino a quando non si muovono per tre minuti. Quindi, raccogli un insetto usando il pollice e l'indice per accedere al suo lato ventrale.

Quindi, usa le forbici da dissezione per tagliare la punta di una coxa di una zampa posteriore tra la coxa e il trocantere. Il taglio in altre parti della coxa è meno efficiente per le raccolte di emolinfa. Ora, posiziona una micropipetta da 10 microlitri sull'incisione e stringi delicatamente l'addome mentre estrai l'emolinfa sanguinante.

Ripetere questo processo fino a quando l'emolinfa di cinque scarafaggi è stata raccolta in un'unica provetta da microcentrifuga. Quindi, far girare brevemente l'emolinfa accumulata per 10 secondi. Quindi, combina 10 microlitri di emolinfa con 50 microlitri di tampone salino per insetti 1x.

Ora, centrifugare l'emolinfa diluita per 10 minuti per estrarre gli emociti dalla soluzione. Quindi, trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Infine, quantificare la concentrazione totale di proteine utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume e regolare la concentrazione di ciascun campione a sei milligrammi di proteine per microlitro.

Per raccogliere il succo dell'intestino medio, per prima cosa, anestetizzare gli scarafaggi sul ghiaccio. Quindi, trasferiscine uno su una piastra di dissezione caricata con 1x tampone salino per insetti freddo e usa i perni per insetti per fissarlo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Ora, seziona l'addome usando una pinzetta sottile.

Quindi, rimuovi l'intero intestino e trasferiscilo in un piatto fresco con 1x tampone salino per insetti. Quindi, isolare l'intestino medio, che è la regione tra la coltura e i tubuli Malpighiani. Per fare ciò, rimuovere la parte anteriore dell'animale e rimuovere l'intestino posteriore.

Quindi, trasferisci rapidamente l'intestino medio in una provetta da microcentrifuga con 100 microlitri di tampone salino per insetti. Raccogli le budella medie di sei scarafaggi nello stesso tubo. Quindi, agitare il tubo per 10 secondi.

Quindi, centrifugare la miscela per 10 minuti per separare gli emociti e i tessuti intestinali. Quindi, trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulita e regolare la concentrazione a sei milligrammi di proteine per microlitro. I lipoplessi di RNA a doppio filamento devono essere utilizzati entro un'ora dalla preparazione.

Durante la loro preparazione, assicurarsi di combinare contemporaneamente tutto il reagente diluito con l'RNA a doppio filamento diluito. Quindi, agitare rapidamente e incubare la miscela. Una volta pronta, mescolare quattro microlitri della soluzione di RNA a doppio filamento con 10 microlitri di tampone salino per insetti come controllo, oppure mescolarla con 10 microlitri di enzimi estratti dall'emolinfa o dal succo dell'intestino medio.

Successivamente, effettuare un controllo inibito dall'enzima aggiungendo due microlitri di EGTA. In caso contrario, aggiungere due microlitri di acqua priva di RNasi. Quindi, incubare i campioni per un'ora o più a 25 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, aggiungere 200 microlitri di reagente di estrazione e 40 microlitri di cloroformio, quindi vortice. Quindi, centrifugare i campioni per 10 minuti. Quindi, trasferire 150 microlitri di ciascun surnatante in una nuova provetta e precipitare l'RNA a doppio filamento da ciascun campione aggiungendo 150 microlitri di isopropanolo e incubando i campioni su ghiaccio per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, centrifugare nuovamente i campioni ed eliminare il surnatante. Quindi, lavare due volte i pellet di RNA aggiungendo 200 microlitri di etanolo al 70% a ciascun pellet e centrifugando la provetta. Dopo il secondo lavaggio, asciugare i pellet di RNA a doppio filamento utilizzando un concentratore centrifugo sottovuoto per tre minuti.

Quindi, risospendere i pellet in 10 microlitri di acqua priva di RNasi. Infine, verificare l'integrità dell'RNA a doppio filamento trattato utilizzando un gel di agarosio all'1,5%. Dai da mangiare agli scarafaggi due volte al giorno, un'ora dopo l'accensione delle luci e un'ora prima che le luci si spengano.

Fallo per otto o 16 giorni senza interruzioni. Durante questo periodo, gli scarafaggi dovrebbero essere altrimenti affamati d'acqua. Per l'alimentazione, avere a disposizione lipoplessi di RNA a doppio filamento appena preparati e RNA nudo a doppio filamento.

Per il bolo, utilizzare con quattro microlitri di lipoplessi di RNA a doppio filamento o 250 nanogrammi di RNA nudo a doppio filamento. Per nutrire uno scarafaggio, per prima cosa, afferralo per le ali usando una pinza flessibile. Non afferrare le parti del corpo di uno scarafaggio.

Quindi, pipettare lentamente la gocciolina di soluzione vicino all'apparato boccale e osservare come lo scarafaggio ingerisce la gocciolina. Dopo l'ultima poppata, fornire bottiglie d'acqua agli scarafaggi. Durante il periodo di alimentazione, valuta gli insetti ogni giorno per verificare la mortalità e rimuovere eventuali scarafaggi che non si muovono più dall'esperimento.

La somministrazione orale continua di lipoplessi a vasca a doppio filamento è stata in grado di ridurre l'espressione della tubulina nell'intestino medio dal 40% al nono giorno al 60% al giorno 17. In confronto, l'RNA nudo a doppio filamento non ha avuto alcun effetto. Ciò è molto probabilmente dovuto alla scoperta che l'esposizione dell'RNA nudo a doppio filamento al succo dell'intestino medio ha provocato la degradazione entro un'ora, mentre l'RNA a doppio filamento coniugato con liposomi è rimasto stabile.

Non solo i livelli di RNA sono diminuiti, ma anche l'alimentazione continua dei lipoplessi di RNA a doppio filamento di tubulina ha portato a una significativa letalità. È improbabile che ciò sia dovuto al vettore, poiché i lipoplessi che trasportano l'RNA a doppio filamento all'EGFP non hanno portato a letalità. Durante il tentativo di questo sistema di somministrazione orale dell'interferenza dell'RNA, è importante eseguire un'alimentazione continua di RNA a doppio filamento per diversi giorni.

Una volta padroneggiata, la fase di alimentazione può essere eseguita in due minuti per insetto se eseguita correttamente. Se necessario, è possibile applicare diverse formulazioni di nanoparticelle di liposomi per migliorare la procedura di alimentazione e l'efficienza dell'RNAi. In definitiva, questa tecnica ha reso possibile per i ricercatori nel campo della gestione dei parassiti esplorare nuove strategie di controllo utilizzando l'RNAi.