Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare tre compartimenti del microbioma radicale, del suolo, della rizosfera e dell'endosfera radicolare, utilizzando il profilo di comunità del gene dell'RNA ribosomiale 16S. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ecologia microbica, come i fattori biotici e abiotici che sono i fattori significativi della struttura del microbioma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che standardizza ogni fase, dalla separazione della radice e della rizosfera all'estrazione del DNA fino alla preparazione di una libreria di sequenziamento.

A dimostrare questa procedura sarà Tuesday Simmons, uno studente laureato presso il Coleman-Derr Laboratory. Per iniziare il protocollo, raccogliere campioni di terreno sfusi con un collettore di carote sterilizzato con etanolo per ottenere un terreno privo di radici vegetali. Raccogli un torsolo a circa 23-30 centimetri dalla base della pianta.

Quindi, trasferisci il terreno in un sacchetto di plastica, omogeneizza il terreno agitando delicatamente il sacchetto, trasferisci un'aliquota di 600 milligrammi del campione di terreno in una provetta da due millilitri e posiziona immediatamente la provetta da due millilitri sul ghiaccio secco fino all'estrazione del DNA. Per raccogliere la radice e la rizosfera, utilizzare una pala sterilizzata con etanolo per scavare la pianta, avendo cura di ottenere la maggior parte possibile della radice. Scuotere delicatamente il terreno in eccesso dalle radici fino a quando non ci sono circa due millimetri di terreno che aderiscono alla superficie delle radici.

Per le piante di grandi dimensioni, utilizzare forbici sterili per tagliare una sottosezione rappresentativa delle radici e posizionare un minimo di 500 milligrammi di tessuto radicale in una fiala conica da 50 millilitri. Aggiungere una quantità sufficiente di tampone per la rimozione delle epifite per coprire le radici, quindi posizionare immediatamente il campione su ghiaccio secco. Per separare la rizosfera dalle radici, scongelare il campione di radice su ghiaccio, quindi sonicare i campioni di radice.

Trasferisci le radici in una provetta da 50 millilitri raffreddata e pulita usando una pinza sterile. Non smaltire il tubo originale con tampone e terra. Questo contiene la frazione della rizosfera.

Quindi, centrifugare la provetta contenente il tampone e la rizosfera. Decantare il surnatante e mettere la frazione della rizosfera in ghiaccio secco. Per lavare le radici, aggiungere circa 20 millilitri di acqua sterile a quattro gradi Celsius alla frazione radicale.

Lavare la radice agitando energicamente per 15-30 secondi, quindi scolare l'acqua. Utilizzare una spatola sterile per trasferire rapidamente 250 milligrammi di terreno e rizosfera in provette di raccolta separate fornite in un kit di isolamento del DNA commerciale per l'estrazione del suolo, quindi procedere utilizzando il protocollo del fornitore del kit. Dopo l'eluizione, conservare il DNA a meno 20 gradi Celsius fino al momento di procedere alla preparazione della libreria di ampliconi, quindi estrarre il DNA dai campioni di radice.

Raffreddare un mortaio sterilizzato e un pestello usando azoto liquido. Misurare da 600 a 700 milligrammi di tessuto radicale, posizionare il tessuto nella malta e aggiungere con cura abbastanza azoto liquido per coprire le radici. Macina le radici in piccoli pezzi.

Continuare il processo di aggiunta di azoto liquido e macinazione almeno due volte, mantenendo la coerenza tra i campioni, fino a quando le radici non saranno una polvere fine. Rapidamente, prima che la polvere di radice inizi a scongelarsi, utilizzare una spatola sterile per trasferire la polvere di radice in provette pre-pesate da 1,5 millilitri su ghiaccio. Registrare il peso del tubo e della polvere.

Utilizzare una spatola sterile per trasferire rapidamente 150 milligrammi di polvere di radice nella provetta di raccolta fornita nel kit di isolamento del DNA commerciale progettato per l'estrazione dal suolo, quindi procedere con l'isolamento del DNA utilizzando il protocollo del fornitore del kit. Preparare una quantità sufficiente di master mix PCR per amplificare ogni campione di DNA in triplice copia. Versare la miscela master in un serbatoio sterile per pipette multicanale da 25 millilitri e distribuire 66 microlitri di miscela master in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti.

Quindi, aggiungi sei microlitri di DNA da cinque nanogrammi per microlitro dalla piastra di DNA normalizzata alla piastra di miscelazione master. Quindi, aggiungere alla piastra master 1,5 microlitri di primer in avanti da 10 micromolari, in modo tale che ogni colonna abbia un diverso codice a barre in avanti, e 1,5 microlitri di primer inverso da 10 micromolari, in modo tale che ogni riga abbia un diverso codice a barre inverso. Coprire la piastra con pellicola e girare brevemente la piastra a 3.000 RCF.

Utilizzare una pipetta multicanale per mescolare delicatamente il contenuto, quindi dividerli in tre piastre con 25 microlitri di miscela di reazione e coprire le piastre con pellicola PCR. Amplificare il DNA in ogni piastra utilizzando un termociclatore. Dopo l'amplificazione, raggruppare le tre piastre replicate in un'unica piastra a 96 pozzetti.

Utilizzando un foglio di calcolo informatico, calcola il volume di 100 nanogrammi di ciascun campione, nonché il volume medio per tutti i campioni. Per ogni prodotto di PCR in bianco, aggiungere il volume medio calcolato in una singola provetta da 1,5 millilitri. Per i campioni amplificati con successo, raggruppare 100 nanogrammi di ciascun campione nella stessa provetta, quindi misurare la concentrazione del prodotto aggregato utilizzando un fluorimetro da banco ed eluire 600 nanogrammi di DNA in acqua di grado molecolare fino a un volume finale di 100 microlitri in una provetta da 1,5 millilitri.

Conservare il prodotto in pool rimanente a meno 20 gradi Celsius. Prima di purificare l'aliquota di DNA da 600 nanogrammi, preparare 600 microlitri di etanolo fresco al 70%. Seguire il processo di purificazione PCR stabilito utilizzando perle paramagnetiche.

Agitare il tubo di perline magnetiche per risospendere le perline che si depositano sul fondo. Aggiungere 1x volume, 100 microlitri, di soluzione di perline all'aliquota di 600 nanogrammi di DNA. Mescolare accuratamente la soluzione e le perle pipettando 10 volte.

Dopo un'accurata miscelazione, incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare il tubo sul supporto magnetico per due minuti o fino a quando la soluzione non è limpida per separare le perle dalla soluzione. Tenere il tubo nel supporto, aspirare con cura il surnatante trasparente senza toccare le perle magnetiche e gettarlo.

Lasciare la provetta nel supporto, aggiungere 300 microlitri di etanolo al 70% alla provetta e incubare le perle a temperatura ambiente per 30 secondi. Aspirare l'etanolo e gettarlo. Ripeti questo processo e rimuovi tutto l'etanolo dopo il secondo lavaggio.

Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e asciugare il contenuto all'aria per cinque minuti. Aggiungere 30 microlitri di acqua di grado molecolare alle perle essiccate e mescolare pipettando 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per due minuti.

Rimettere il tubo sul supporto magnetico per un minuto per separare le perle dalla soluzione. Trasferire l'eluato in un nuovo tubo. Misurare la concentrazione finale del DNA pulito e aggregato utilizzando un fluorimetro da banco.

Diluire un'aliquota a 10 nanomolari in un volume finale di 30 microlitri o alla concentrazione e al volume preferiti dall'impianto di sequenziamento. Dopo la fase di amplificazione, è stato eseguito il sequenziamento per determinare la composizione della comunità batterica di ciascun campione. Un allineamento della sequenza PNA a ciascun cloroplasto e al gene dell'RNA ribosomiale mitocondriale 16S per la pianta ospite studiata non dovrebbe rivelare alcuna discrepanza.

Una singola mancata corrispondenza con la sequenza di PNA di 13 coppie di basi può ridurre drasticamente l'efficacia, come nel caso della sequenza di PNA del cloroplasto fornita e del gene dell'RNA ribosomiale del cloroplasto 16S della Lactuca sativa, o lattuga. Poiché per campione è stata raggruppata una quantità uguale di DNA amplificato, è stato ottenuto un numero pari di letture, che corrispondono ai taxa batterici, per campione dopo il sequenziamento, ordinate in base al loro indice con codice a barre. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita per otto piante in circa otto ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante essere coerenti tra gli esperimenti. Piccoli dettagli come i cambiamenti nel metodo di estrazione del DNA e nella master mix PCR possono introdurre distorsioni. Seguendo questa procedura, altri metodi come la metatrascrittomica possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali microbi sono attivi e quali geni esprimono?

Non dimenticare che lavorare con l'azoto liquido può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare DPI adeguati.