Name: Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri come caratterizzare il microbioma radicale analizzando suolo, rizosfera ed endosfera mediante profilazione della comunità batterica del gene 16S rRNA. Questo protocollo standardizzato consente di studiare la diversità microbica associata alle piante.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS è supportato dal NSF Graduate Research Fellowship Program.

1. raccolta e separazione della radice Endosphere, rizosfera e campioni di terreno
<ol><li>Prima di entrare il campo, autoclave acqua ultrapura (almeno 90 mL di acqua per esempio) per sterilizzare. Preparare epifita rimozione tampone (almeno 25 mL per campione) aggiungendo 6,75 g di KH2PO4, 8,75 g di K2HPO4e 1 mL di Triton X-100, 1 L di acqua sterile. Sterilizzare il buffer utilizzando un filtro a depressione con pori di 0,2 µm.<ol>
<li>Per la procedura 1.2 a 1.5, indossare guanti puliti sterilizzati con etanolo a tutte le volte e sostituire i guanti tra ogni campione per evitare la contaminazione. Tutte le apparecchiature con etanolo al 70% di sterilizzare e pulire tutte le attrezzature tra campioni. Prima del campionamento, determinare la profondità di campionamento ottimale per il tuo esperimento ed essere coerente con tutte le collezioni del suolo e radice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per raccogliere campioni di suolo bulk, utilizzare un collezionista di nucleo di terreno sterilizzato di etanolo per ottenere del suolo che è privo di radici delle piante attraverso la raccolta di un nucleo circa 23 a 30 cm dalla base della pianta.</li>
	<li>Trasferire il terreno a un sacchetto di plastica, omogeneizzare il terreno mediante agitazione delicata e trasferire un'aliquota del campione di terreno (circa 600 mg) per riempire una provetta da 2 mL. Posizionare immediatamente la provetta da 2 mL su ghiaccio secco o flash congelare il tubo liquido N2 fino al momento di procedere con l'estrazione del DNA (passaggio 2).<ol>
<li>In alcuni ambienti, il terreno circostante può contenere materiale vegetale. In questo caso, utilizzare un setaccio sterilizzato 2 mm per separare i detriti vegetali dal suolo prima dell'immissione nel sacchetto di plastica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per raccogliere la radice e la rizosfera, utilizzare una pala da etanolo-sterilizzato per scavare la pianta, avendo cura di ottenere tanto della radice come possibile. Profondità dipende dalla pianta. Mentre piccole piante come il grano possono essere rimosso da parecchi centimetri di scavo, piante più grandi come il sorgo possono richiedere 30 cm o più. Agitare delicatamente fuori suolo in eccesso dalle radici fino a quando c'è di circa 2 mm di terreno aderendo alla superficie della radice. Nota: fare attenzione quando si lavora con le piccole piante, con radici fragili, o in terreni contenuti secco, alta-argilla. Idealmente, dovrebbe esserci solo un sottile strato di suolo restanti sulle radici dopo l'agitazione. Se rimangono grandi aggregati del suolo, un martello di gomma utilizzabile per sloggiare il terreno premendo delicatamente la base delle riprese. Se la quantità di terreno rimanente dopo questo processo superiore o inferiore a 2 mm, lo spessore approssimativo dovrebbe essere notato.</li>
	<li>Per impianti di grandi dimensioni, utilizzare forbici sterili e/o cesoie per tagliare una sottosezione rappresentativa delle radici e inserire un minimo di 500 mg di tessuto di radice in un flaconcino di coniche da 50 mL. Per piccole erbe, posizionare l'intero sistema della radice nel flaconcino. Aggiungere sufficiente buffer di rimozione epifite per coprire le radici, quindi immediatamente mettere il campione sul ghiaccio secco o flash congelare il campione a liquido N2. Nota: fare attenzione per non riempire eccessivamente il flaconcino da 50 mL conica, come si fanno lavare un passo difficile. Dovrebbe esserci abbastanza spazio vuoto tale che il buffer di epifite è in grado di fluire verso il basso, circondano le radici in tutto il flaconcino e coprire la parte superiore. Perché alcune erbe hanno più biomassa di radice che si adattano in un flaconcino di coniche da 50 mL, una sottosezione delle radici dovrebbe essere raccolti. Tuttavia, dovrebbe essere notato che le radici di taglio potrebbe portare ad batteri endofiti essere lavati fuori nella frazione rizosfera, rompendo così le radici dovrebbe essere minimizzato. Se i campioni non vengono elaborati immediatamente dopo il ritorno al laboratorio, essi possono essere conservati a-80 ° C.</li>
	<li>Per separare la rizosfera dalle radici, scongelare il campione di radice sul ghiaccio, quindi sottoporre ad ultrasuoni i campioni di radice a 4 ° C per 10 min con impulsi di 160 W per 30 s, separati da 30 s. trasferimento le radici in un freddo (4 ° C), pulire il tubo da 50 mL utilizzando pinze sterili. Non gettare il tubo originale con buffer e terreno, che è la frazione di rizosfera (Figura 1).</li>
	<li>Centrifugare la provetta contenente tampone e rizosfera per 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantare il supernatante, flash nella provetta contenente la frazione di rizosfera nel liquido N2di congelare e conservare la frazione di rizosfera a-80 ° C fino al momento di procedere con il DNA estrazione (passaggio 2).</li>
	<li>Per lavare le radici, aggiungere circa 20 mL di acqua sterile freddo (4 ° C) per la frazione di radice. Lavare la radice agitando vigorosamente (a mano o mixer, per 15-30 s) e poi scolare l'acqua.</li>
	<li>Ripetere questo passaggio almeno due volte, fino a quando nessun terreno rimane sulla superficie della radice. Se l'estrazione del DNA (passaggio 2) non viene eseguita immediatamente, avvolgere le radici in un foglio di alluminio sterile, flash congelare le radici in liquido N2e archivio i campioni a-80 ° C fino al pronto a procedere con l'estrazione del DNA.</li>
</ol>2. DNA estrazione
Nota: In tutto i passaggi 2 e 3, guanti puliti, sterilizzati con l'etanolo devono essere indossati in ogni momento e tutti i lavori devono essere eseguiti su una superficie sterilizzata con etanolo.
<ol><li>Estrazione del DNA dai campioni del suolo e della rizosfera.<ol>
<li>Utilizzare una spatola sterile trasferire velocemente 250 mg del suolo e della rizosfera da passaggi 1.3 e 1.7 nelle provette di raccolta differenziata fornita in un kit di isolamento del DNA commerciale progettato per estrazione dal terreno, quindi procedere con isolamento del DNA utilizzando il kit Fornitore protocollo.</li>
		<li>Dopo l'eluizione del DNA nel buffer di eluizione in dotazione con il kit di isolamento del DNA, è possibile conservare il DNA a-20 ° C fino al momento di procedere con il passaggio 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrazione del DNA dai campioni di radice.<ol>
<li>Raffreddare un sterilizzato mortaio e pestello usando liquido N2. Misurare 600 a 700 mg di tessuto di radice e posizionare il tessuto nel mortaio. Aggiungere con cautela, abbastanza liquido N2 per coprire le radici.</li>
		<li>Macinare le radici in piccoli pezzi. Continuare il processo di aggiunta di liquido N2 e rettifica (almeno due volte, essere coerenti tra campioni), fino a quando le radici sono una polvere fine. Assicurarsi che il tessuto di radice non scongelare durante questo passaggio. Attenzione: Utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (camice, occhiali protettivi e Guanti criogenici) quando lavorano con liquido N2. Nota: Per un'estrazione di DNA di bassa qualità, può essere utile macinare le radici in eccesso in polvere e conservare la polvere a-80 ° C.</li>
		<li>Rapidamente, prima della radice polvere inizia a scongelare, utilizzare una spatola sterile per trasferire la polvere di radice nelle provette da 1,5 mL pre-pesati sul ghiaccio. Registrare il peso del tubo e la polvere. In genere, 300-400 mg di polvere viene trasferito.</li>
		<li>Utilizzare una spatola sterile per trasferire velocemente 150 mg di polvere di radice verso il tubo di raccolta fornito in un kit di isolamento del DNA commerciale progettato per estrazione dal terreno, quindi procedere con isolamento del DNA usando protocollo del fornitore kit. Nota: Per alcuni campioni di radice, ci può essere un'alta concentrazione di sostanze organiche restanti nel pellet di DNA, che impedisce l'amplificazione del DNA durante la PCR, soprattutto quando un diverso protocollo di estrazione del DNA (ad es., estrazione CTAB) viene utilizzato. Se necessario, pulire il DNA seguendo le istruzioni fornite nel kit di pulizia ambientale di DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare la concentrazione di tutti i campioni di DNA usando un fluorometro benchtop ad alta sensibilità.<ol>
<li>Aggiungere 1-20 µ l di ciascun campione di DNA eluite in tubi forniti nel kit di test ad alta sensibilità di dsDNA. Aggiungere la soluzione di lavoro del fluorimetro (tintura: buffer di 1: 200) fino a 200 µ l.</li>
		<li>Preparare due altre provette contenenti 10 µ l di DNA campione 1 (0 ng / µ l DNA) o 10 µ l di campione 2 (100 ng / µ l) e aggiungere 190 µ l di soluzione di lavoro del fluorimetro ad ogni livello.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di norme e di ogni campione. Se non viene fatto automaticamente, è possibile calcolare la concentrazione di DNA dall'output di assorbanza di una regressione lineare tra le due norme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. presentazione e preparazione amplicone biblioteca
<ol><li>Impostare i materiali per la reazione di amplificazione.<ol>
<li>Scongelare i campioni di DNA a 4 ° C e tenerli sul ghiaccio durante il passaggio 3. Randomizzare l'ordine dei campioni di DNA per minimizzare la distorsione a causa della posizione sulla piastra PCR (tabella 2).</li>
		<li>In una piastra PCR a 96 pozzetti, diluire DNA da ogni campione in acqua grado molecolare a 5 ng / µ l in un volume totale di 20 µ l. aggiungere 20 µ l acqua di grado molecolare dei pozzetti di quattro angolo come controllo negativo per l'amplificazione (vuote) (tabella 2).</li>
		<li>Organizzare gli iniettori con codice a barre (10 µM) in provette per PCR striscia o una piastra a 96 pozzetti, tale che possono essere aggiunti con una pipetta multicanale (Figura 2).</li>
		<li>Preparare il mix master sufficiente di PCR per amplificare ogni campione di DNA in triplice copia. Preparare 1,5 µ l di BSA (20 mg/mL), 37,5 µ l di pre-fatte 2 x mix master (composta da tampone di PCR, MgCl2, dNTPs e Taq DNA polimerasi), 0,57 µ l del cloroplasto PNA (100 µM), 0,57 µ l di PNA mitocondriale (100 µM) e 25.86 µ l di acqua di grado molecolare.</li>
		<li>Versare il mix master in una sterile 25 mL di serbatoio pipetta multicanale e distribuire 66 µ l di master mix in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Nota: Quando calcolo di volumi di reagente per il mix master, assicurarsi di includere anche 4 pozzetti del bianco per piastra.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 6 µ l di DNA (dalla piastra di DNA normalizzato) alla piastra di mix master di 5 ng / µ l. Quindi aggiungere il master piatto 1,5 µ l di primer in avanti di 10 µM tale che ogni colonna ha un diverso codice a barre in avanti e 1,5 µ l di 10 µM reverse primer in modo tale che ogni riga ha un codice a barre inverso diverso (Figura 2). Nota: Prima di aggiungere gli iniettori, le piastre randomizzati e mix master possono essere utilizzati per amplificare i geni fungini ITS o ITS2 se sono stati aggiunti diversi primer. Se questo è il caso, un simile disegno dell'iniettore può essere utilizzato.</li>
		<li>Selezione verso il basso la piastra brevemente a 3.000 x g. utilizzare una pipetta multicanale per mescolare delicatamente, quindi dividere in tre piastre con 25 µ l di miscela di reazione. Nota: Anche se tre replicati non sono strettamente necessarie, si riduce l'impatto della variabilità tecnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificare il DNA in ogni piastra utilizzando un termociclatore impostare le seguenti condizioni: 180 s a 98 ° C, 30 cicli di: 98 ° C per 45 s (denaturazione), 78 ° C per 10 s (PNA ricottura), 55 ° C per 60 s (ricottura di primer) e 72 ° C per 90 s (estensione) , quindi 600 s a 72 ° C, seguita da una 4 ° C tenere il passo. Dopo l'amplificazione, piscina le tre lastre di replicare in una singola piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Quantificare il DNA utilizzando reagenti fluorometro di alto-sensibilità in un lettore di piastra a 96 pozzetti.<ol>
<li>Aggiungere 2 µ l di ciascun prodotto PCR di una micropiastra a 96 pozzetti, insieme a 98 µ l di soluzione di lavoro del fluorimetro (tintura: buffer di 1: 200). Sono 4 pozzi come standard: 5 µ l di DNA campione 1 (0 ng / µ l DNA), 1 µ l di campione 2 (10 ng / µ l), 2 µ l di campione 2 (20 ng / µ l) e 5 µ l di campione 2 (50 ng / µ l). Quindi aggiungere la soluzione di lavoro del fluorimetro per un volume finale di 100 µ l. Nota: Ogni campione può essere misurata usando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3, se un lettore non è disponibile.</li>
		<li>Calcolare la concentrazione di DNA dall'output di assorbanza di una regressione lineare dei quattro standard.</li>
		<li>Per il codice a barre con successo amplificato prodotti (quelli che hanno una concentrazione maggiore di 15 ng / µ l), piscina di 100 ng di ciascun campione in una provetta di singolo 1,5 mL (tabella 2).</li>
		<li>Calcolare il volume medio dei campioni aggiunto al pool utilizzando la funzione =AVERAGE() in un programma di foglio di calcolo. Aggiungere il volume dei prodotti di PCR "in bianco" per il pool di campioni. Nota: Poiché i "vuoti" prodotti di PCR hanno loro proprie combinazioni di codice a barre univoco, può essere sequenziate per verificare eventuali contaminanti di laboratorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare la concentrazione del prodotto pool utilizzando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3 e prendere 600 ng di DNA e diluire in acqua di grado molecolare ad un volume finale di 100 µ l in una provetta da 1,5 mL. Conservare il prodotto rimanente in pool a-20 ° C.</li>
	<li>Lavare il 600 ng DNA aliquota seguendo il processo di purificazione di PCR stabilito con i branelli di purificazione paramagnetica in un formato a 96 pozzetti con poche eccezioni.<ol>
<li>Fare un fresco 600 µ l aliquota di etanolo al 70%. Agitare il flacone di biglie magnetiche per risospendere perline che si depositano sul fondo.</li>
		<li>Aggiungere volume x 1 (100 µ l) di soluzione di perlina a parte aliquota 600 ng di DNA. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Collocare la provetta sul supporto magnetico per 2 minuti (o fino a quando la soluzione è limpida) per separare le perle dalla soluzione. Mentre il filmato è ancora nel supporto magnetico, aspirare il supernatante chiaro con attenzione senza toccare i branelli magnetici e scartare il supernatante chiaro. Nota: A questo punto, i prodotti di ampliconi sono tenuti a biglie magnetiche. Tutti i branelli che sono disturbato o perso durante l'aspirazione si tradurrà in una perdita di DNA.</li>
		<li>Lasciare il tubo nel supporto magnetico e aggiungere 300 µ l di etanolo al 70% per il tubo; Incubare a temperatura ambiente per 30 s. aspirato fuori l'etanolo e scartare. Ripetere questo processo ed eliminare l'etanolo tutti dopo il secondo lavaggio. Togliere il tubo dal supporto magnetico e aria secca per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 30 µ l di acqua grado molecolare ai talloni secchi e Miscelare pipettando 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 2 min ritorno il tubo per il supporto magnetico per 1 min per separare le perle dalla soluzione. Trasferire l'eluato ad un nuovo tubo. Nota: Biglie magnetiche non influenzerà le reazioni a valle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare la concentrazione finale di puliti, pool DNA usando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3. Diluire una parte aliquota di 10 nM in un volume finale di 30 µ l, o alla concentrazione e volume preferito da parte dell'impianto di sequenziamento.</li>
	<li>Utilizzare i servizi di una struttura di sequenziamento per sequenziare il DNA su una piattaforma NGS, 2 x 300 sequenziamento accoppiato-fine di bp.</li>
</ol>

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<li>Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+primer+choice+and+short+read+sequences+on+the+outcome+of+16S+rRNA+gene+based+diversity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies.</a> PLoS One. 8 (8), e71360(2013).</li>
<li>Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+nucleic+acid-mediated+PCR+clamping+as+a+useful+supplement+in+the+determination+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity.</a> Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).</li>
<li>Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+DNA+extraction+method%2C+16S+rRNA+targeted+hypervariable+regions%2C+and+sample+origin+on+microbial+diversity+detected+by+454+pyrosequencing+in+marine+chemosynthetic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems.</a> Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).</li>
<li>Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+correlation+of+hypervariable+regions+in+16S+rRNA+genes+in+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis.</a> BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo dimostra una pipeline stabilita per esplorare radice endosphere, rizosfera e composizioni di comunità microbica del suolo, dalla campionatura del campo di trattamento del campione e sequenziamento a valle. Studio associato radice microbiomi presenta sfide uniche, dovuto in parte per le difficoltà insite nel campionamento dal suolo. I terreni sono altamente variabile in termini di proprietà fisiche e chimiche, e condizioni del terreno possono essere separate da appena pochi millimetri28...

Microbiomi pianta-collegato è costituito da comunità microbiche dinamica e complessa, costituita da batteri, archaea, virus, funghi e altri microrganismi eucarioti. Oltre al loro ruolo ben studiata a causa di malattia delle piante, microbi pianta-collegato possono influenzare positivamente anche pianta salute migliorando la tolleranza agli stress biotici e abiotici, promuovendo la disponibilità di nutrienti, e migliorare la crescita delle piante attraverso la produzione di ormoni vegetali. Per questo motivo, particolare interesse esiste nel caratterizzare i taxa che associano con pianta radice endospheres, metodologie e il terreno circostante. Mentre alcuni microbi possono essere coltivate in isolamento il laboratorio multimediale generato, molti non possono, in parte perché essi possono si basano su relazioni simbiotiche con altri microbi, crescono molto lentamente, o richiedono condizioni che non possono essere replicate in un ambiente di laboratorio. Perché aggira la necessità per la coltivazione ed è relativamente poco costoso e ad alta velocità, analisi filogenetica basata su sequenza di campioni microbici ambientali e host-associato è diventata un metodo comodo per analizzante comunità microbica composizione.
La selezione delle tecnologie di sequenziamento appropriati forniti da vari prossima generazione sequenziamento (NGS) piattaforme1 dipende dalla necessità degli utenti, con importanti fattori tra cui: copertura desiderata, lunghezza amplicon, previsto comunità diversità, come pure sequenziamento tasso di errore, la lettura-lunghezza e il costo-per-Esegui/megabase. Un'altra variabile che deve essere considerato in esperimenti di sequenziamento degli ampliconi è quale gene sarà amplificati e verrà utilizzato quale primer. Quando si progetta o scegliendo gli iniettori, i ricercatori spesso sono costretti a fare compromessi tra l'universalità dell'amplificazione e la risoluzione tassonomica ottenibile dagli ampliconi risultanti. Per questo motivo, questi tipi di studi scelto spesso primer e marcatori che mirare selettivamente specifici sottoinsiemi del microbioma. Valutare la composizione delle comunità batteriche avviene comunemente ordinando uno o più delle regioni ipervariabili del batterici 16S rRNA gene2,3. In questo studio, descriviamo un amplicone basato sequenziamento protocollo sviluppato per una piattaforma NGS quella regione di bp V3-V4 obiettivi la 500 del gene del rRNA 16S batterica, che consente ampia amplificazione dei taxa batterici, fornendo inoltre una sufficiente variabilità a distinguere tra diversi taxa. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'uso con altri set di primer, come quelli targeting il marcatore ITS2 di funghi o la subunità di rRNA 18S degli eucarioti.
Mentre altri approcci come fucile metagenomica, metatranscriptomics e sequenziamento unicellulare, offrono altri vantaggi tra cui risolti genomi microbici e misura più diretta della funzione di comunità, queste tecniche sono in genere più costoso e computazionalmente intensivi rispetto del profilo filogenetico descritto qui4. Inoltre, eseguendo il fucile metagenomica e metatranscriptomics su campioni di radice produce una grande percentuale di letture appartenendo a genoma della pianta ospite e metodi per superare questa limitazione sono ancora in fase sviluppato5,6.
Come con qualsiasi piattaforma sperimentale, profiling basato su amplicone può introdurre un numero di potenziali pregiudizi che dovrebbe essere considerato durante l'analisi di dati di progettazione e sperimentale. Questi includono i metodi di raccolta dei campioni, DNA estrazione, selezione degli iniettori di PCR e come preparazione di libreria viene eseguita. Diversi metodi possono influenzare notevolmente la quantità di dati utilizzabili generati e possono anche ostacolare gli sforzi per confrontare i risultati tra gli studi. Ad esempio, il metodo di rimozione rizosfera batteri7 e l'uso di tecniche di estrazione diversa o scelta di DNA estrazione Kit8,9 sono stati indicati per avere un impatto significativo dell'analisi a valle, che conduce a conclusioni differenti per quanto riguarda cui i microbi sono presenti e loro abbondanza relativa. Poiché profiling basato su amplicone può essere personalizzato, fare paragoni tra gli studi può essere impegnativo. Il progetto microbioma terra ha suggerito che i ricercatori che studiano i sistemi complessi come il microbioma pianta-collegato trarrebbero beneficio dallo sviluppo di protocolli standardizzati come mezzo per ridurre al minimo la variabilità causata dall'applicazione di metodi differenti tra studi10,11. Qui, discutiamo molti degli argomenti di cui sopra e offrire suggerimenti per quanto riguarda le migliori pratiche dove opportuno.
Il protocollo viene illustrato il processo di raccolta del suolo, rizosfera ed esempi di radice da sorgo bicolore ed estrazione DNA usando una consolidata kit di isolamento del DNA11. Inoltre, il nostro protocollo include un flusso di lavoro sequenziamento degli ampliconi dettagliate, utilizzando una piattaforma NGS comunemente utilizzata, per determinare la struttura delle comunità batteriche12,13,14. Questo protocollo è stato convalidato per l'uso in una vasta gamma di ospiti della pianta in un recente studio pubblicato di radici, rizosfera e associati-terreni di 18 specie di monocot compreso Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Questo metodo è stato convalidato anche per l'utilizzo con altri geni marcatori, come dimostrato dalla sua riuscita applicazione allo studio del gene marcatore ITS2 fungo negli studi del agave microbiome16,17 e fragola microbiome 18.

<table><tbody><tr><td>0,1-10/20 &micro; L puntali per micropipette filtrati</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>10 &micro; L pipetta multicanale</td><td>Eppendorf</td><td>3122000027</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>10 &micro; L, 100 & micro; L, e 1000 &micro; L micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000909</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>100 &micro; L pipetta multicanale</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>1000 &micro; L puntali per micropipette filtrati</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Setaccio del suolo da 2 mm</td><td>Silvicoltura Fornitori</td><td>60141009</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>200 &micro; L puntali per micropipette filtrati</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Serbatoi da 25 mL VWR</td><td>International LLC</td><td>89094-664</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Fiale coniche da 50 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Filtri sottovuoto da 500 mL (0,2 & micro; VWR</td> <td>International LLC</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>micropiastre a 96 pozzetti</td><td>USA Scientific</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td><td>BioRad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP perline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9933872</td><td>Istruzioni per l'uso: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Boardwalk</td><td>7124</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Bilancia analitica con risoluzione di 0,001 g</td><td>Ohaus Pioneer</td><td>PA323</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Ultrasuonatore Bioruptor Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) 20 mg/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5811000908</td><td>Include adattatori per secchi per piastre da 50 ml e 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Guanti criogenici</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z183490</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Kit DNeasy PowerClean (opzionale)</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12877-50</td><td>In precedenza MoBio</td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil kit</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12888-100</td><td>Precedentemente MoBio</td></tr><tr><td>Ghiaccio secco</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>magnete Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Non sostituire</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR International LLC</td><td>89125-188</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Sacchetti per congelatore da galloni</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Lettori di micropiastre Gemini EM</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>EM</td><td>Può utilizzare un altro fluorimetro che legge le piastre a 96 pozzetti dall'alto.</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Camice da laboratorio</td><td>Workrite</td><td>J1367</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Liquido N2</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Liquido N2 dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4150-9000</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua ultrapura Milli-Q</td><td>Millipore Sigma</td><td>SYNS0R0WW</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4387937</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Mortai</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-150</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19167032B</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Asciugamani di carta</td><td>VWR International LLC</td><td>BWK6212</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Pellicola sigillante per piastre PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9684493</td><td></td></tr><tr><td>Provette per strisce PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>Pestelli</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-166</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Spatole in plastica</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000014</td><td></td></tr><tr><td>PNA - cloroplasti e PNA mitocondriali</td><td>Bio</td><td>NA</td><td>Assicurati di verificare la sequenza bioinformaticamente</td></tr><tr><td>Occhiali protettivi</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z759015</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Martello di gomma (opzionale)</td><td>Ace Hardware</td><td>2258622</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Cesoie o forbici</td><td>VWR International LLC</td><td>89259-936</td><td>Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Pala</td><td>Home Depot</td><td>2597400</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Raccoglitore di carote di terreno (diametro piccolo: < 1 pollice)</td><td>Ben Meadows</td><td>221700</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Flaconi spray</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-395278</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Primer standard desalinizzati con codice a barre (10 & micro; M) (Tabella 1)</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo con desalinizzazione standard. L'adattatore NGS e il primer di sequenziamento (Tabella 1) sono progettati per l'uso con Illumina MiSeq utilizzando la chimica v3.</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E950040015</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr><tr><td>Pesare le barche</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>B6001W</td><td>Può sostituire con equivalente di altri fornitori.</td></tr></tbody></table>

esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice endosphere

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

L'intima interazione tra pianta ospite e microrganismi associati è cruciale nel determinare la pianta fitness e può favorire una migliore tolleranza agli stress abiotici e malattie. Come il microbioma di pianta può essere molto complesso, a basso costo, metodi di high throughput come amplicon di sequenziamento del gene del rRNA 16S sono spesso preferiti per caratterizzare la composizione microbica e la diversità. Tuttavia, la selezione di una metodologia appropriata quando lo svolgimento di tali esperimenti è fondamentale per ridurre le distorsioni che possono rendere difficile analisi e confronti tra campioni e studi. Questo protocollo descrive in dettaglio una metodologia standardizzata per la raccolta e l'estrazione di DNA da terreno, rizosfera ed esempi di radice. Inoltre, evidenziamo una pipeline di sequenziamento consolidata 16S rRNA amplicone che consente per l'esplorazione della composizione delle comunità batteriche in questi campioni e può essere facilmente adattati per altri geni marcatori. Questa pipeline è stata convalidata per una varietà di specie vegetali, tra cui sorgo, mais, frumento, fragola e agave e può aiutare a superare i problemi associati alla contaminazione da organelli di pianta.

Eseguire il protocollo raccomandato dovrebbe comportare un dataset di indicizzata fine accoppiato letture che possono essere abbinati torna a ciascun campione e assegnate a entrambi un batterico unità tassonomica operative (OTU) o variante di sequenza esatta (ESV, noto anche come amplicone variante di sequenza (ASV) e sub-operational unità tassonomica (sOTU)), a seconda dell'analisi a valle. Al fine di ottenere dati di sequenza di alta qualità, si deve prestare attenzione ad ogni passo pe...

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare tre compartimenti del microbioma radicale, del suolo, della rizosfera e dell'endosfera radicolare, utilizzando il profilo di comunità del gene dell'RNA ribosomiale 16S. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ecologia microbica, come i fattori biotici e abiotici che sono i fattori significativi della struttura del microbioma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che standardizza ogni fase, dalla separazione della radice e della rizosfera all'estrazione del DNA fino alla preparazione di una libreria di sequenziamento.A dimostrare questa procedura sarà Tuesday Simmons, uno studente laureato presso il Coleman-Derr Laboratory. Per iniziare il protocollo, raccogliere campioni di terreno sfusi con un collettore di carote sterilizzato con etanolo per ottenere un terreno privo di radici vegetali. Raccogli un torsolo a circa 23-30 centimetri dalla base della pianta.Quindi, trasferisci il terreno in un sacchetto di plastica, omogeneizza il terreno agitando delicatamente il sacchetto, trasferisci un'aliquota di 600 milligrammi del campione di terreno in una provetta da due millilitri e posiziona

exploring-root-microbiome-extracting-bacterial-community-data-from

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

L'obiettivo del protocollo presentato qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato Bacillus mycoides di essudati di patata. Questo metodo facilita l'identificazione di importanti geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi ed è in linea di principio applicabile ad altri endofiti e piante, con piccoli aggiustamenti.

Interazioni piante-microrganismi: Risposta trascrizionale di Bacillus Mycoides di essudati di patate

Scavo delle radici delle piante dal campo e trattamento dei campioni in endosphere, rizosfera e suolo sono descritte in dettaglio, compresi i metodi di analisi di dati e di estrazione del DNA. Questa carta è progettata per consentire altri laboratori di utilizzare queste tecniche per lo studio del suolo, endosphere e rizosfera microbiomi.

Isolamento ed analisi di comunità microbiche nel suolo, rizosfera e radici negli esperimenti di erba perenne

Visualizzazione e misurazione radice crescita in situ è estremamente impegnativo. Presentiamo un metodo rhizobox personalizzabile per tracciare lo sviluppo delle radici e la proliferazione nel tempo in risposta all'arricchimento in nutrienti. Questo metodo viene utilizzato per analizzare le differenze genotipiche mais nella plasticità di radice in risposta a una fonte di azoto organico.

Un protocollo di Rhizobox ottimizzato per visualizzare la crescita delle radici e tempi di risposta alle sostanze nutrienti localizzate

Qui descriviamo un test di crescita delle piante idroponica per quantificare la presenza delle specie e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il loro trasferimento in diversi ambienti di crescita.

Monitoraggio della colonizzazione e della manutenzione batterica sull'Arabidopsis thaliana Radici in un sistema idroponico galleggiante

L'analisi della rete è stata applicata per valutare l'associazione di varie comunità microbiche ecologiche, come suolo, acqua e rizosfera. Qui è presentato un protocollo su come utilizzare l'algoritmo WGCNA per analizzare diverse reti di co-occorrenza che possono verificarsi nelle comunità microbiche a causa di diversi ambienti ecologici.

Divergenza del microbiota radicale in diversi habitat in base a reti di correlazione ponderate

I microcosmi di compost portano la diversità microbica presente in natura in laboratorio per facilitare la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans. Qui sono forniti protocolli per la creazione di esperimenti di microcosmo, con gli esperimenti che dimostrano la capacità di modulare la diversità microbica ambientale per esplorare le relazioni tra diversità microbica ambientale e composizione del microbioma intestinale del verme.

Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

Presentiamo un protocollo per un sistema sperimentale semiidroponico a base di vetro che supporta la crescita di una varietà di piante filogeneticamente distinte con o senza microbi. Il sistema è compatibile con diversi mezzi di crescita e consente il campionamento non distruttivo dell'essudato radicale per l'analisi a valle.

Un sistema versatile di barattoli di vetro per la profilatura semiidroponica dell'essudato radicale

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro affidabile ed efficiente dalla raccolta del campione all'analisi dei dati per la profilazione dei microbiomi batterici endofitici ed epifiti presenti nella corteccia di Populus trichocarpa.

Un flusso di lavoro per la valutazione quantitativa dei microbiomi batterici endofitici ed epifiti della corteccia di Populus trichocarpa

Qui viene presentata una procedura rapida e standardizzata per stabilire comunità di biofilm multispecie sinergiche da vari suoli della rizosfera. Si tratta di un protocollo unico progettato per sondare e simulare il complesso microbiota del suolo della rizosfera.

Un approccio alla costruzione di comunità di biofilm multispecie dal suolo della rizosfera

Qui, presentiamo un protocollo per eliminare un gene di interesse coinvolto nella coniugazione dei plasmidi e successivamente analizzare l'impatto della sua assenza utilizzando saggi di accoppiamento. La funzione del gene viene ulteriormente esplorata in una regione specifica della sua sequenza utilizzando mutazioni di delezione o puntiformi.

Coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

Scopri come caratterizzare il microbioma radicale analizzando suolo, rizosfera ed endosfera mediante profilazione della comunità batterica del gene 16S rRNA. Questo protocollo standardizzato consente di studiare la diversità microbica associata alle piante.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

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