Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

L'obiettivo generale di questo test di accoppiamento è valutare gli effetti delle mutazioni all'interno del gene di trasferimento coniugativo sulla sua capacità di influenzare il trasferimento plasmidico nel contesto di un complesso funzionale di secrezione di tipo quattro. Questo metodo consente di porre domande specifiche sulle proteine, come l'identificazione delle regioni delle interazioni proteina-proteina che si verificano tra le proteine di trasferimento mentre assemblano un sistema di secrezione funzionale di tipo quattro nella coniugazione batterica. In questa tecnica, i geni su grandi plasmidi coniugativi vengono eliminati dalla ricombinazione omologa.

La funzione genica viene valutata fornendo il gene bersaglio ai knock-out su un plasmide più piccolo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'organizzazione e l'impostazione sono fondamentali per condurre con successo questa procedura. Un'adeguata preparazione sperimentale è necessaria per ottenere risultati interpretabili.

Iniziare questo protocollo con la preparazione del plasmide pBAD33 digerito come descritto nel protocollo di testo. Esegui ogni digest su un gel di agarosio. Utilizzando una cabina UV e un rasoio sterile, tagliare dal gel la banda base da 2,8 kg che corrisponde alla sequenza di cateterismo.

Lavora rapidamente per ridurre al minimo l'esposizione ai raggi UV del DNA. Estrarre il DNA dalla fetta di gel ritagliata utilizzando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore. Per amplificare la cassetta di gatto estratta mediante reazione a catena della polimerasi o PCR.

Preparare la miscela di reazione in una provetta sterile per PCR. Utilizzare primer che contengano sporgenze omologhe alla sequenza genica bersaglio per la ricombinazione omologa. Impostare un controllo negativo che riporti gli stessi componenti, tranne sostituire il DNA stampo con acqua distillata doppia.

Inoltre, impostare un controllo positivo utilizzando DNA stampo e primer che hanno dimostrato di funzionare in una reazione PCR. Miscelare delicatamente tutto il contenuto della reazione mediante pipettaggio. Quindi, amplificare la cassetta del gatto estratta utilizzando i parametri PCR elencati nel protocollo di testo.

Utilizzare solo cinque microlitri di ciascuna reazione per confermare la corretta dimensione dell'amplificazione tramite elettroforesi su gel di agarosio. Purificare l'amplicone PCR utilizzando un kit di purificazione PCR con il protocollo del produttore. Aggiungere 300 nanogrammi di cassetta per gatti amplificata in 50 microlitri di cellule DY330R elettrocompetenti, che ospitano il plasmide pOX38-Tc su ghiaccio.

Pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Ripetere questo passaggio utilizzando il plasmide pBAD33 non modificato come controllo positivo. Quindi, trasferire le celle in una cuvetta di elettroporazione da un millimetro pre-raffreddata.

Elettroporare le celle a 1,8 kilovolt con una costante di tempo di 5,5 millisecondi utilizzando un elettroporatore. Immediatamente, dopo aver applicato l'impulso, diluire le cellule con un millilitro di terreno SOC e trasferirle in una nuova provetta per microfuge. Incubare le cellule a 32 gradi Celsius per due ore.

Successivamente, aliquotare 100 microlitri di ciascun campione in piastre di agar contenenti 10 microgrammi per millilitro di tetraciclina e 20 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo. Stendere l'aliquota sulla piastra utilizzando uno spandiconcime sterile. Incubare la piastra capovolta a 32 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, selezionare i ricombinanti riusciti. La cassetta per gatti introdotta nella cellula subirà una ricombinazione omologa con il gene di interesse e creerà il clone knock-out di cloramfenicolo pOX38-Tc. Separare i 300 nanogrammi dell'elettroporato del gene pK184 o del plasmide mutante del gene pK184 in 50 microlitri di cellule elettrocompotenti DY330R che ospitano il plasmide knock-out del cloramfenicolo pOX38-Tc come prima.

Per generare le cellule donatrici XK1200, eseguire l'accoppiamento coniugativo seguito da elettroporazione per generare cellule XK1200, arponendo sia il knock-out per il cloramfenicolo che il plasmide PK184, come descritto nel protocollo di testo. Preparazione della coltura notturna di queste cellule donatrici XK1200 in 20 millilitri di LB sterile con cloramfenicolo e kanamicina. Preparare anche le cellule riceventi MC4100 in 50 millilitri di LB con 50 microgrammi per millilitro di streptomicina utilizzando cellule di uno stock di glicerolo o di una singola colonia su piastra di agar ang.

Coltiva le colture a 37 gradi Celsius, agitando a 200 giri/min. Aggiungere glucosio a una concentrazione finale di 100 millimolari a tutte le cellule del donatore. Il giorno successivo, effettuare separatamente 1 diluizione su 70 da ciascuna coltura notturna in due millilitri di LB sterile con gli stessi antibiotici.

Far crescere le cellule fino alla fase di log medio a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min. Centrifugare la coltura cellulare per pellettare le cellule e scartare il surnatante. Quindi, lavare una volta il pellet cellulare con LB sterile freddo per rimuovere gli antibiotici.

Dopo la centrifugazione una seconda volta come prima, sospendiamo le cellule in due millilitri di LB.In sterile a freddo, aliquotiamo 100 microlitri di cellule donatrici e 100 microlitri di cellule riceventi in 800 microlitri di terreno LB sterile per un millilitro di volume totale. Lasciare che le cellule si accoppino a 37 gradi Celsius per un'ora senza agitare. Dopo un'ora, agitare le celle per 30 secondi per interrompere le coppie di accoppiamento.

Quindi, metti le celle sul ghiaccio per 10 minuti per evitare ulteriori accoppiamenti. Utilizzando le colture mid log e LB sterili fresche, preparare sei diluizioni seriali delle cellule del donatore e del ricevente da 1 e 100 a 1 e 10 milioni. Su ciascuna delle due metà di una piastra di agar contenente acido naladixico, cloramfenicolo e kanamicina, individuare aliquote da 10 microlitri di ciascuna diluizione di cellule donatrici XK1200.

Ripetere lo spotting per le diluizioni delle cellule MC4100 riceventi su piastre di agar contenenti streptomicina. Quindi, incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzando la miscela a vortice e LB sterile fresco, preparare sei diluizioni dei transconiugati.

Selezionare per le cellule MC4100 transconiuganti che ospitano il pOX38-Tc cloramfenicolo knock-out bu individuando aliquote di dieci microlitri di ciascuna diluizione su ciascuna metà delle piastre di agar contenenti streptomicina e cloramfenicolo. Ripetere per entrambe le miscele duplicate. Quindi, incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius.

Calcola l'efficienza dell'accoppiamento contando il numero di colonie dallo stesso spotting di diluizione per ogni cellula donatrice, ricevente e transconiugante sulle rispettive piastre. Inoltre, conta le colonie riceventi per verificare eventuali distorsioni derivanti da un numero maggiore di transconiuganti rispetto ai riceventi a quella data diluizione. Calcola l'efficienza di accoppiamento come il numero di colonie transconiuganti diviso per il numero di colonie donatrici, moltiplicato per 100 per ottenere il valore di efficienza per 100 cellule donatrici.

Quando il sistema di secrezione di tipo quattro gene-tra-F viene eliminato dal plasmide pOX38-Tc, si verifica una perdita del trasferimento coniugativo del plasmide pOX38-Tc traF chloramphenicol knock out dalle cellule donatrici a quelle riceventi. Tuttavia, quando il gene traF viene fornito in trans dal plasmide traF PK184 e dalle cellule donatrici, si osserva un recupero del trasferimento coniugativo del plasmide knock-out pOX38-Tc traF cloramfenicolo. Quando vengono forniti mutanti di diluizione di traF e del plasmide PK184 nelle cellule donatrici, si può osservare la perdita del trasferimento coniugativo del plasmide knock-out pOX38-Tc traF cloramfenicolo.

La perdita del trasferimento coniugativo indica la regione della proteina importante per le interazioni proteina-proteina all'interno del sistema di secrezione coniugale di tipo quattro. Questa regione può quindi essere sondata in modo più dettagliato mediante mutazioni puntiformi che influenzano l'efficienza del trasferimento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una sola giornata lavorativa con i tempi di crescita previsti.

Questo protocollo può essere eseguito su cellule diverse da quelle qui dimostrate. L'aspetto critico, a questo punto, è che le cellule donatrici e riceventi non ospitano il plasmide di interesse. In modo che quando si aggiunge il plasmide knock-out, non si ottengano risultati contrastanti.

Durante il tentativo di questa procedura è importante essere molto organizzati in quanto esistono diverse condizioni di crescita e antibiotici per le cellule donatrici, riceventi e transconiugate. Seguendo questa procedura, possono essere eseguite altre metodiche come la cristallografia, la risonanza magnetica o la spettrometria di massa al fine di ottenere un quadro strutturale e funzionale dettagliato della proteina di interesse.