Name: Coniugazione saggi di accoppiamento per lanalisi specifica per sequenza di proteine di trasferimento relativi coniugazione batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri come eseguire saggi di accoppiamento per analizzare la coniugazione batterica e le interazioni proteiche nei sistemi di secrezione di tipo IV. Questo metodo permette di valutare l'effetto delle mutazioni geniche sul trasferimento plasmidico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del Discovery Sciences &amp; Engineering Consiglio Naturale del Canada (NSERC).

<ol><li>Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+in+pathogenic+and+environmental+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).</li>
<li>Furuya, E. Y., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial-resistant+bacteria+in+the+community+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).</li>
<li>Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffiths%2C+A+%22An+Introduction+to+Genetic+Analysis%2C+7th+Edition%22">An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition</a>. , W.H. Freeman. San Fransisco. (2000).</li>
<li>Cooper, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+Speeds+Adaptation+by+Reducing+Competition+between+Beneficial+Mutations+in+Populations+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli.</a> PLoS Biol. Barton, N. H. 5 (9), 225(2007).</li>
<li>Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+antibiotic+resistance+propagation+by+inhibiting+the+conjugative+DNA+relaxase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).</li>
<li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+the+spread+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plasmids and the spread of resistance.</a> Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li>
<li>Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShala%2C+A+%22Handbook+of+Clinical+Nanomedicine%3A+Nanoparticles%2C+Imaging%2C+Therapy+and+Clinical+Applications%22">Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications</a>. Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. , Pan Sanford Publishing. Singapore. 657-686 (2016).</li>
<li>Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+systems+in+bacterial-host+associations%2C+and+their+description+in+the+Gene+Ontology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology.</a> BMC Microbiol. 9 (1), Suppl 1 2(2009).</li>
<li>Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+of+prokaryotic+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F+factor+conjugation+is+a+true+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">F factor conjugation is a true type IV secretion system.</a> FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).</li>
<li>Lederberg, J., Tatum, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Recombination+in+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene Recombination in Escherichia Coli.</a> Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).</li>
<li>Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mobility of Plasmids.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Willetts, N., Skurray, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conjugation+System+of+F-Like+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The Conjugation System of F-Like Plasmids.</a> Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).</li>
<li>Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+sequence+and+gene+products+of+the+transfer+region+of+the+F+sex+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor.</a> Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).</li>
<li>Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+exclusion+in+F-like+plasmids+requires+intact+TraG+in+the+donor+that+recognizes+its+cognate+TraS+in+the+recipient%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient.</a> Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).</li>
<li>Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Architecture%2C+and+Function+of+Bacterial+Type+Iv+Secretion+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+the+Agrobacterium+VirB%2FD4+and+related+conjugation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems.</a> Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).</li>
<li>Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a, Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+bacterial+type+IV+secretion+lexicon%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The expanding bacterial type IV secretion lexicon.</a> Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).</li>
<li>Christie, P. J., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+dynamic+properties+of+bacterial+Type+IV+secretion+systems+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review).</a> Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+Intercellular+transfer+of+macromolecules+by+systems+ancestrally+related+to+conjugation+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).</li>
<li>Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+structure+of+the+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion toolkit.</a> EMBO Rep. 9, 735(2008).</li>
<li>Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Regulation+of+the+Type+VI+Secretion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Regulation of the Type VI Secretion System.</a> Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).</li>
<li>Chandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+complex+of+a+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system.</a> Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).</li>
<li>Rivera-Calzada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+type+IV+secretion+core+complex+at+subnanometre+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution.</a> EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).</li>
<li>Waksman, G., Fronzes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems.</a> Trends Biochem Sci. 35, 691(2010).</li>
<li>Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The structural biology of type IV secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).</li>
<li>Kaplan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+a+cell-embedded+megadalton+protein+complex+by+DNP-supported+solid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR.</a> Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).</li>
<li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sex-factor-affinity+site+in+E.+coli+as+gamma+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, Pt 1 135-140 (1981).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Jobling, M. G., Holmes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+vectors+with+the+pl5a+replicon%2C+kanamycin+resistance%2C+inducible+lacZ%CE%B1+and+pUC18+or+pUC19+multiple+cloning+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites.</a> Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315(1990).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+P%28BAD%29+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter.</a> J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Mutational+Analysis+of+Conjugative+Transfer+Region+1+%28Tra1%29+from+the+IncHI1+Plasmid+R27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).</li>
<li>Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Like+Type+IV+Secretion+Systems+Encode+Proteins+with+Thioredoxin+Folds+That+Are+Putative+DsbC+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues.</a> J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).</li>
<li>Hazes, B., Frost, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+systems+biology+approach+to+study+type+II%2FIV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).</li>
<li>Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+protein+nanotubes%3A+Learning+from+nature%27s+nanotech+examples%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature's nanotech examples.</a> Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).</li>
<li>Harris, R. L., Silverman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tra+proteins+characteristic+of+F-like+type+IV+secretion+systems+constitute+an+interaction+group+by+yeast+two-hybrid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).</li>
<li>Moore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+F-Plasmid+Conjugative+Transfer+Gene+traU%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU.</a> J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+role+of+the+transfer+gene%2C+traN%2C+of+the+F+and+R100-1+plasmids+in+mating+pair+stabilization+during+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation.</a> J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).</li>
<li>Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+bacterial+conjugation+by+plasmids+from+marine+environments+visualized+by+gfp+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression.</a> Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

processo Coniugazione batterica fornisce un mezzo attraverso il quale i batteri possono diffondersi geni mediante un vantaggio evolutivo di crescita in ambienti difficili, come la diffusione di marcatori di resistenza agli antibiotici. Poiché molti dei plasmidi coniugativi sono così grandi, 12 studi funzionali sulle proteine coinvolte nel montaggio del dispositivo di trasferimento attraverso la mutazione di geni bersaglio sul plasmide coniugativo si sono ingombranti. I protocolli descritti qui forniscono un m...

Il trasferimento di geni e proteine ​​a livello micro-organismal svolge un ruolo centrale nella sopravvivenza dei batteri e l&#39;evoluzione, nonché i processi di infezione. Lo scambio di DNA tra batteri o tra un batterio e una cellula può essere ottenuto attraverso la trasformazione, coniugazione o trasduzione vettoriale. 1,2 coniugazione è unico rispetto alla trasformazione e trasduzione dal fatto che durante la coniugazione tra batteri gram-negativi come Escherichia coli, il trasferimento del DNA avviene in modo donatore controllato quale un sistema macromolecolare complesso collega cellule donatrici e riceventi. Coniugazione è anche il modo più diretto in cui le cellule batteriche interagiscono con le cellule ospiti per iniettare i geni, proteine ​​o sostanze chimiche a sistemi host. 3 Molto spesso, il trasferimento di tali agenti ha effetti notevoli sulla serie, che vanno dalla patogenesi e carcinogenesi ad ospitare evoluzione e adattamento. E &#39;stato dimostrato che recombinatio conjugativen aumenta il tasso di adattamento 3 volte nei batteri con alti tassi di mutazione in condizioni di stress ambientale. 4 Inoltre, la coniugazione è di gran lunga la via più comune attraverso il quale si diffondono i geni di resistenza agli antibiotici in ceppi batterici. 5,6 I microrganismi sono evoluti sistemi di secrezione specializzati per supportare il trasferimento di macromolecole attraverso le membrane cellulari; attualmente ci sono 9 tipi di sistemi di secrezione (Tsss) in batteri gram negativi che sono stati descritti: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, così come la Sec (secrezione) e Tat (due-arginina traslocazione) percorsi. 7,8 Ogni tipo di sistema di secrezione è ulteriormente suddiviso in diversi sottotipi, una necessità a causa della diversità delle proteine e la peculiarità di meccanismi coinvolti, in differenti ceppi batterici. Ad esempio, nel sistema di secrezione di tipo IV (T4SS), i sistemi di Ti e Cag facilitano il trasporto effettore che l&#39;F-plasmide, R27 unND pKM101 T4SSs facilitare il trasferimento di un plasmide coniugativo. 7,9,10 Una comprensione dettagliata dei meccanismi attraverso i quali gli organismi assemblano i loro rispettivi sistemi di secrezione dalle loro proteine componenti e condividono contenuti cellulari con un destinatario o il loro ambiente circostante è un fattore importante per lo sviluppo di strategie mirate per combattere i microrganismi e processi di patogeni infezione cellulare. Dopo l&#39;identificazione coniugazione batterica iniziale in E. coli da Lederberg e Tatum, 11 sono state identificate e caratterizzate numerose plasmidi mobili e coniugazione. 12 Tali plasmidi mobili mostrano notevole gamma è formato (da 1 a oltre 200 kilobasi (kb)), tuttavia tutti i plasmidi mobili contengono una relaxase, che riconosce l&#39;origine di trasferimento (orit) consentendo così la trasmissione del plasmide. plasmidi coniugativi ulteriori geni codificano per il montaggio di un T4SS funzionale così come un tipoIV proteine ​​accoppiamento. 12 Ad esempio 100 kb F plasmide di E. coli codifica tutti i geni coniugazione di una regione (tra) 33,3 trasferimento kB. 13 I geni della regione Tra del plasmide codifica F tutte le proteine che facilitano la formazione di pilus, accoppiamento formazione coppia (MPF), il trasferimento del DNA e le funzioni di esclusione durante il trasferimento plasmide conjugative. 10,14,15 un corpus significativo di conoscenze è disponibile per conjugative T4SSs, per quanto dettagliati studi strutturali delle proteine e dei complessi di coniugazione sono solo più di recente diventando disponibili. 16 - 28 Per assemblare una visione complessiva del processo conjugative, è necessario un accoppiamento di studi strutturali dettagliate per mutazionale analisi delle proteine ​​di trasferimento coniugazione. Ciò può essere ottenuto mediante saggi accoppiamento coniugazione. Per il plasmide F, ciascuna proteina codificata all&#39;interno della regione di tra gioca un ruolo nella co F-mediatanjugation; Pertanto, il knockout / delezione di un gene transfer abolisce la capacità conjugative della cella (Figura 1). Mentre più piccoli plasmidi mobili sono più favorevoli per le procedure di cancellazione standard per i plasmidi coniugazione più grandi come F, knockout genici si ottengono più facilmente tramite ricombinazione omologa in cui il gene bersaglio viene sostituito con uno trasmettere un distinto gene di resistenza agli antibiotici. Nel protocollo corrente, ci avvaliamo di ricombinazione omologa per sostituire un gene trasferimento di interesse con cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) nella 55 kb F plasmide derivato pOX38-Tc; 29,30 plasmide knockout risultante, pOX38-Tc Δgene :: Cm, facilita resistenza alla presenza di cloramfenicolo (Cm) in terreni di crescita. Cellule del donatore ospitano pOX38-Tc Δgene :: Cm potuto influenzare conjugative trasferimento di DNA / accoppiamento come osservata attraverso l&#39;uso di un saggio di accoppiamento; l&#39;efficienza di accoppiamento di una cellula donatrice pOX38-Tc Δgene :: cm e una recip normaleiente diminuirà o, più spesso, essere abolito. trasferimento conjugative del plasmide pOX38-Tc Δgene :: Cm può essere ripristinato tramite un piccolo plasmide recupero ospitare il gene trasferimento mirato. Questo plasmide recupero può essere uno che fornisce l&#39;espressione costitutiva, come plasmide pK184 (pK184-gene), 31 o uno che fornisce l&#39;espressione inducibile finché tale plasmide obiettivi correttamente il gene nella posizione corretta all&#39;interno della cellula (citoplasma o periplasma). Di conseguenza, in saggi di accoppiamento tra questo nuovo donatore (ospitare pOX38-Tc Δgene plasmidi :: Cm + pK184-gene) ed una cellula ricevente, l&#39;efficienza di accoppiamento è previsto per ripristinare quasi quella di un normale dosaggio accoppiamento donatore-ricevente. Questo sistema permette di sondare la funzione del gene eliminato attraverso la generazione di una serie di costrutti pK184 gene (delezioni o mutazioni puntiformi) e testare la capacità di ogni costrutto di ripristinare la capacità di accoppiamento del harbouring pOX38-Tc Δgene :: Cm cellula donatriceS.

<table><tbody><tr><td>Kit di mini-preparazione del plasmide GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel GeneJet</td><td>Fisher</td><td>Scientific K0692</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR GeneJet</td> Fisher <td></td><td>Scientific K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Kit di mutagenesi sito-diretta</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA ad ampio raggio</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>Le cuvette hanno una distanza di 1 mm.</td></tr><tr><td>Enzimi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td><forte>Antibiotici</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Concentrazioni finali</forte></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo (cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &; g/mL</td></tr><tr><td>di Kanamicina (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Acido nalidixico (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>di Rifampicina (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>di Tetraciclina (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>di streptomicina (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 &; g/mL</td></tr></tbody></table>

coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Il trasferimento di materiale genetico per coniugazione batterica è un processo che avviene tramite complessi formati da specifiche proteine di trasferimento. In Escherichia coli, queste proteine di trasferimento costituiscono un meccanismo di trasferimento del DNA noto come formazione della coppia di accoppiamento, o complesso di trasferimento del DNA, che facilita il trasferimento coniugativo del plasmide. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un metodo che possa essere utilizzato per determinare il ruolo di una specifica proteina di trasferimento coinvolta nella coniugazione utilizzando una serie di delezioni e/o mutazioni puntiformi in combinazione con saggi di accoppiamento. Il gene bersaglio viene eliminato sul plasmide coniugativo e viene quindi fornito in trans attraverso l'uso di un piccolo plasmide di recupero che ospita il gene bersaglio. Le mutazioni che interessano il gene bersaglio sul plasmide di recupero possono rivelare informazioni sugli aspetti funzionali della proteina bersaglio che provocano l'alterazione dell'efficienza di accoppiamento delle cellule donatrici che ospitano il gene mutato. Le alterazioni nell'efficienza dell'accoppiamento forniscono informazioni sul ruolo e l'importanza della particolare proteina di trasferimento, o di una regione in essa, nel facilitare il trasferimento coniugativo del DNA. L'abbinamento di questo saggio di accoppiamento con studi strutturali tridimensionali dettagliati fornirà una comprensione completa della funzione della proteina di trasferimento coniugativa, oltre a fornire un mezzo per identificare e caratterizzare le regioni di interazione proteina-proteina.

Il processo di F coniugazione batterica plasmide-driven è un processo coordinato che coinvolge le proteine di trasferimento all'interno della regione Tra della F-plasmide che assembla un T4SS per facilitare la sintesi pilus e il trasferimento di DNA coniugativo. La proteina traffico (GenBank adesione # BAA97961; UniProt ID P14497) è necessario per conjugative formazione F-pilus. 10,14,35 - 37 La proteina contiene un dominio tioredossina come C-te...

Qui, presentiamo un protocollo per eliminare un gene di interesse coinvolto nella coniugazione dei plasmidi e successivamente analizzare l'impatto della sua assenza utilizzando saggi di accoppiamento. La funzione del gene viene ulteriormente esplorata in una regione specifica della sua sequenza utilizzando mutazioni di delezione o puntiformi.

Coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

L'obiettivo generale di questo test di accoppiamento è valutare gli effetti delle mutazioni all'interno del gene di trasferimento coniugativo sulla sua capacità di influenzare il trasferimento plasmidico nel contesto di un complesso funzionale di secrezione di tipo quattro. Questo metodo consente di porre domande specifiche sulle proteine, come l'identificazione delle regioni delle interazioni proteina-proteina che si verificano tra le proteine di trasferimento mentre assemblano un sistema di secrezione funzionale di tipo quattro nella coniugazione batterica. In questa tecnica, i geni su grandi plasmidi coniugativi vengono eliminati dalla ricombinazione omologa.La funzione genica viene valutata fornendo il gene bersaglio ai knock-out su un plasmide più piccolo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'organizzazione e l'impostazione sono fondamentali per condurre con successo questa procedura. Un'adeguata preparazione sperimentale è necessaria per ottenere risultati interpretabili.Iniziare questo protocollo con la preparazione del plasmide pBAD33 digerito come descritto nel protocollo di testo. Esegui ogni digest su un gel di agarosio. Uti

conjugative-mating-assays-for-sequence-specific-analysis-transfer

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l'espressione del ΦC31 integrasi.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Fonte: Erdogan, F., et al., Saggi di accoppiamento coniugativo per l'analisi sequenziale specifica delle proteine di trasferimento coinvolte nella coniugazione batterica. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra la procedura per il trasferimento di un plasmide F da cellule di E. coli donatore a cellule ricevente utilizzando un plasmide di salvataggio e selezionando i transconiuganti attraverso la doppia resistenza agli antibiotici. Il processo include la miscelazione di colture batteriche,...

Trasferimento di plasmidi F e doppia selezione antibiotica in E. coli

Descriviamo qui tre protocolli diversi per la ricerca in vitro di coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale in Staphylococcus aureus.

Metodologia per lo studio del orizzontale Gene Transfer in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Con l'obiettivo di comprendere i comportamenti dei vari elementi coniugativi batterici di DNA in condizioni diverse, descriviamo un protocollo per la rilevazione di differenze nella frequenza di coniugazione, con alta risoluzione, per stimare quanto efficientemente il batterio donatore avvia la coniugazione.

Confronto ad alta risoluzione delle frequenze di Coniugazione batterica

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull'agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Qui, descriviamo la costruzione di mutanti nulli di Aeromonas in specifiche glicosiltransferasi o regioni contenenti glicosiltransferasi, i saggi di motilità e la purificazione dei flagelli eseguiti per stabilire il coinvolgimento e la funzione dei loro enzimi codificati nella biosintesi di un glicano, nonché il ruolo di questo glicano nella patogenesi batterica.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

La coniugazione media il trasferimento genico orizzontale mobilitando il DNA plasmidico attraverso due cellule diverse, facilitando la diffusione di geni benefici. Questo lavoro descrive un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione efficiente del trasferimento plasmidico coniugativo, basato sull'uso di marcatori differenziali nel plasmide coniugativo, nel donatore e nel ricevente per rilevare la transconiugazione.

Rilevazione del trasferimento genico orizzontale mediato da plasmidi coniugativi naturali in E. coli

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per esaminare funzionalmente la trascrizione e l'attività inibitoria di agenti antibatterici che mirano alla trascrizione batterica.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

Qui presentiamo un protocollo che facilita la caratterizzazione funzionale a medio e alto rendimento di costrutti di geni e promotori nel tessuto staminale secondario dell'albero in tempi relativamente brevi. È efficiente, facile da usare e ampiamente applicabile a una vasta gamma di specie arboree.

L&#39;uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo

Scopri come eseguire saggi di accoppiamento per analizzare la coniugazione batterica e le interazioni proteiche nei sistemi di secrezione di tipo IV. Questo metodo permette di valutare l'effetto delle mutazioni geniche sul trasferimento plasmidico.

Coniugazione saggi di accoppiamento per lanalisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica (Video) | JoVE Journal

Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine di trasferimento relativi coniugazione batterica

Esplora altri video

Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

Esplora altri video

Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine di trasferimento relativi coniugazione batterica